Enterobactérias Provas bioquímicas

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1 BACILOS GRAM-NEGATIVOS Enterobactérias Provas bioquímicas ENTEROBACTÉRIAS IMPORTÂNCIA CLÍNICA A maioria das enterobactérias é encontrada no trato gastrointestinal de humanos, no reino animal, na água, solo e vegetais. São considerados enteropatógenos por causarem infecções gastrointestinais (Salmonella typhi, Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Escherichia coli) e em outros locais. São responsáveis por de cerca de 70% das infecções urinárias e 50% das septicemias. As enterobactérias representam 80% ou mais de todos os Gram negativos de importância clínica isolados na rotina microbiológica. 1

2 ENTEROBACTÉRIAS É a maior e mais heterogênea família de bacilos Gram negativos de importância médica (27 gêneros, 102 espécies e 8 grupos indefinidos). 25 espécies envolvidas em 95% das amostras, sendo possível o isolamento de enterobactérias de qualquer amostra clínica. São bacilos Gram negativos, não esporulados, oxidase negativos, com motilidade variável. São anaeróbios facultativos, fermentam a glicose com ou sem produção de gás, são catalase positivos e reduzem nitrato a nitrito. Crescem em: Meios básicos (caldo peptona); Meios ricos (ágar sangue, ágar chocolate e CLED); Meios seletivos (MacConkey, EMB). INFECÇÕES HOSPITALARES E NA COMUNIDADE Baseado em dados de prevalência e importância clínica, os laboratórios de microbiologia utilizam metodologias que permita discriminar com 80% de acerto os gêneros e espécies considerados abaixo: - Escherichia coli - Shigella spp. - Salmonella typhi - Salmonella spp. - Citrobacter freundii -Proteus mirabilis - Proteus vulgaris - Citrobacter koseri - Klebsiella pneumoniae - Klebsiella oxytoca - Providencia spp. - Serratia spp. - Enterobacter aerogenes -Enterobacter cloacae -Enterobacter agglomerans -Yersinia enterocolitica - Morganella morganii 2

3 INFECÇÕES HOSPITALARES E NA COMUNIDADE Nas infecções hospitalares: Principais gêneros das enterobactérias (99% dos isolamentos): Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Providencia spp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Serratia spp. As enterobactérias que atualmente predominam são: Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp. As enterobactérias menos isoladas são: Edwarsiella spp., Hafnia spp., Yersinia spp. Nas infecções da comunidade: Destacam-se: Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Salmonella spp., Shigella spp. A diferenciação dos gêneros da família Enterobacteriaceae é feita através de provas bioquímicas. A diferenciação das espécies ou tipos é feita sobretudo com base em caracteres sorológicos (sorotipos). Também pode ser baseada na combinação de ambos. E. coli Salmonella Shigella Yersinia 3

4 IDENTIFICAÇÃO SOROLÓGICA As amostras relacionadas bioquimicamente são divididas em subgrupos ou tipos, por critério sorológico, de acordo com a presença dos antígenos: somático (O), flagelar (H) e de envoltório ou cápsula (K). A identificação sorológica é feita apenas com patógenos de importância epidemiológica como Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, utilizando-se esquemas simplificados, em laboratórios de referência. Escherichia coli Provas complementares (sorológicas, testes biológicos) são utilizadas, para complementação de provas bioquímicas, principalmente na identificação de uma das seis categorias de E. coli enteropatogênicas para o homem. 4

5 Escherichia coli E. coli é um bacilo Gram negativo e pertence à família das Enterobacteriaceae. São aérobias e anaeróbias facultativas. O seu habitat natural é o lúmen intestinal do homem e de animais de sangue quente. Possui múltiplos flagelos dispostos em volta da célula. A Escherichia coli é, portanto, um componente da flora normal do intestino humano e de animais saudáveis, impedindo o crescimento de espécies bacterianas nocivas e sintetizando apreciável quantidade de vitaminas (K e do complexo B). Escherichia coli Possuem fímbrias e adesinas que permitem a sua fixação, impedindo o arraste pela urina ou diarréia. Muitas produzem exotoxinas. São suscetíveis aos ambientes secos, aos quais não resistem. Possuem camada LPS e esta camada lipopolissacarídica ativa o sistema imunitário (que a reconhece como endotoxina ou lipídeo A) de forma agressiva. A vasodilatação excessiva provocada pelas citocinas (produzidas pelas células de defesa do organismo) pode levar ao choque séptico e morte em alguns casos. 5

6 Baseado nos fatores de virulência, manifestações clínicas e epidemiologia, linhagens de E. coli são agrupadas em classes ou variantes: Atualmente, existem 6 grupos reconhecidos de E. coli patogênicas: Enteropatogênicas ou EPEC Enterotoxigênicas ou ETEC Enteroinvasivas ou EIEC Enterohemorrágicas ou EHEC Enteroagregativas ou EAEC Difuso-aderentes ou DAEC 6

7 1) EPEC ("Enteropathogenic E.coli"; E.coli Enteropatogênica): Causam diarréias não sanguinolentas. São epidêmicas em crianças causando diarréia aquosa em crianças pequenas com menos de 1 ano de idade (diarréia do lactente). Causam febre, náuseas e vômitos. São os principais patógenos causadores de diarréia em países subdesenvolvidos. Alimentos vegetais são regados com águas contaminadas transmitindo a diarréia. EPECs têm um fator de adesão (EAF) aos enterócitos e produzem enterotoxinas, resultando em destruição das microvilosidades do intestino delgado, com má absorção dos nutrientes e conseqüente diarréia osmótica. 7

8 PENETRAÇÃO NAS CÉLULAS DO HOSPEDEIRO A célula eucariótica (do hospedeiro) possui um citoesqueleto composto de uma proteína chamada actina. E.coli quando em contato com a célula do hospedeiro causam uma mudança no ponto de contato pela produção de INVASINAS. As INVASINAS rearranjam os filamentos de actina que aninham a bactéria e a ajuda a entrar para dentro da célula. 2) ETEC ("Enterotoxic E.coli ou E.coli Enterotoxinogênica): Infectam principalmente o intestino delgado e os sintomas são: Dores abdominais, vômitos, náuseas e febre baixa. Produzem enterotoxinas semelhantes à toxina da cólera, causando aumento da secreção de eletrólitos como o sódio para o lúmen intestinal, seguidos de água por osmose. Produz dois tipos de toxinas: Toxina Termolábil (LT) inativada a 60 C por 30 min. Toxina Termoestável (ST) suporta 100 C por 30 min. O resultado é diarréia profusa aquosa, tipo água de arroz, sem sangue. A bactéria tem fímbrias que lhe permite aderir fortemente ao epitélio e não ser completamente arrastada pela diarréia volumosa. 8

9 ETECs são as causadoras mais comum de diarréia do turista (diarréia do viajante), sendo ingeridas em grandes números em comida mal cozida ou água contaminada com detritos fecais. 3) EIEC ("Enteroinvasive E.coli; E.coli Enteroinvasiva): são invasivas e destrutivas da mucosa intestinal, causando úlceras e inflamação. Causa diarréia aquosa inicial seguida de disenteria (diarréia com sangue e muco), semelhante à da disenteria bacteriana (Shigella spp.). Produz invasão do enterócito (endocitose), rompe as células e invade as células vizinhas, causando a morte celular das células do hospedeiro. Acomete crianças maiores do que o grupo acometido pelas EPECs e adultos, mas o isolamento em pacientes com diarréia não é freqüente. 9

10 4) DAEC (Difusamente aderente ou "Diffusely adherent E.coli) Aderem às células epiteliais num padrão difuso e apresenta fímbrias de superfície (F1845). A maioria dos pacientes apresenta diarréia aquosa sem sangue nem leucócitos fecais. 5) E. coli enteroagregativa (EAEC ou EAggEC) Produz adesão na mucosa do cólon (padrão diferente da EHEC, EPEC ou EIEC). Produz toxinas LT e ST e fatores de colonização das fímbrias (AAF = fímbrias de aderência agregativa). Está associada à diarréia crônica, aquosa e mucóide (sem sangue e nem leucócitos), com febre baixa, pouco ou nenhum vômito. 10

11 6) EHEC ("Enterohemorragic E.coli" ; E.coli Enterohemorragica): Causam diarréia aquosa inicial que pode progredir em colite hemorrágica e síndrome hemolítico-urêmico (que ocorre em 5% das infecções por EHEC). Têm fímbrias aderentes e produzem uma toxina semelhante à toxina de Shiga (entero-hemolisina) produzida pela Shigella. Causa diarréia sanguinolenta sem leucócitos, sem febre, dor abdominal. Podem provocar anemia, trombocitopenia e insuficiência renal aguda potencialmente perigosa (SHU), levando à colite hemorrágica (grave). O sorogrupo mais comumente envolvido é o O157:H7 (doença do hambúrguer). 11

12 Woman paralyzed by E. coli-tainted hamburger Stephanie Smith: the 22 year old children's dance instructor was paralyzed from the waist down after eating E. coli-tainted hamburger traced back to the meat supplier. She was in a coma for nine weeks (that's her, hospitalized, in the photo), and can now no longer walk. "Ground beef is not a completely safe product," one food safety expert in the article is quoted. TESTES UTILIZADOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS Nenhum sistema oferece 100% de acerto para a caracterização das espécies de enterobactérias, mas analisam o principal comportamento descrito na literatura. 80% Acurácia da identificação - A maioria dos esquemas trabalha com um máximo de 80% de acerto. 12

13 TESTES UTILIZADOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS Podem ser utilizados testes preparados no laboratório (controle de qualidade). Adquiridos no comércio em testes isolados ou em kits. Métodos automatizados (ampliam o número de testes) Métodos rápidos em substratos cromogênicos (detecção de enzimas bacterianas) que se revelam após 4 a 6 horas de incubação. Cerca de 80-90% das enterobactérias podem ser identificadas através desses esquemas, com resultado concluído entre 48 a 72 horas. Principais provas para a identificação das enterobactérias de importância clínica 1. Fermentação da glicose 2. Fermentação da lactose 3. Motilidade 4. Utilização de citrato 5. Descarboxilação da lisina 6. Produção de sulfeto de hidrogênio (H 2 S) 7. Produção de gás (CO 2 ) 8. Oxidase 9. Produção de indol 10. Produção de urease 11. Produção de fenilalanina desaminase ou opção triptofanase 12. Produção de gelatinase ou opção DNAse Provas complementares de Identificação Fermentação de outros carboidratos: sacarose, maltose, arabinose, salicina, dulcitol, manitol, etc. Utilização de aminoácidos: arginina e ornitina Hidrólise da esculina, etc. 13

14 ETAPAS DA IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS ANÁLISE DO CRESCIMENTO NOS MEIOS RICOS E SELETIVOS A identificação de uma enterobactéria começa com a análise do material semeado. Em geral temos os seguintes meios para interpretar: Secreções: ágar sangue, ágar EMB (Eosin Methylene Blue) MacConkey. e Líquidos nobres e biópsias: Ágar Chocolate, EMB e MacConkey. Fezes: MacConkey, EMB e Salmonella-Shigella (S-S) Urina: CLED (Cistina-Lactose-Eletrolito-Deficiente) ou ágar sangue e MacConkey, etc. MacConkey Ágar Sangue EMB 14

15 CLED Salmonella-Shigella agar 1. Cultura em placa contendo meio sólido MacConkey Observar a morfologia e fermentação da lactose: Negativa: Coloração transparente Positiva: Rosa ou vermelha Salmonella Shigella Proteus Yersinia E. coli Enterobacter Citrobacter Klebisiella 15

16 ANÁLISE DO CRESCIMENTO NOS MEIOS RICOS E SELETIVOS Devemos considerar que: A enterobactéria sempre cresce nos meios ricos (ágar sangue, chocolate e CLED), bem como nos meios seletivos: ágar MacConkey, EMB e Salmonella-Shigella. Os Gram positivos como regra não crescem em ágar MacConkey e Salmonella-Shigella, exceto os enterococos e também bactérias não fermentadoras e Candida spp. Portanto caracteriza-se uma enterobactéria quando ela está presente em todos os meios semeados, mas ainda é necessário diferenciar de outros (bacilos não fermentadores, enterococos e Candida spp.). Após a semeadura no meios, recomenda-se realizar: Coloração de Gram da colônia isolada Para evitar enganos de interpretação (diferenciar cocos de bacilos, Gram positivos de Gram negativos e leveduras). Prova da oxidase indicada para detectar e/ou diferenciar o grupo Aeromonas, Plesiomonas,Vibrio que também são fermentadores. Prova do metabolismo fermentador triagem utilizando os meios de OF glicose (quando suspeitar de não fermentador), TSI (Tríplice Açúcar Ferro) ou EPM (Rugai sem sacarose), para enterobactérias. Série bioquímica complementar sempre necessária para caracterizar gênero e espécie. 16

17 As Enterobactérias caracterizam-se por se apresentarem como: Crescem bem no meio de McConkey ou EMB (Eosin Methylene Blue); Bacilos Gram negativos; Fermentadores da glicose; Produzem ou não gás; Oxidase negativas; Reduzem nitrato a nitrito. PROVA DO CITOCROMO-OXIDASE Sistema enzimático relacionado com os citocromos da cadeia respiratória de alguns microrganismos. As enterobactérias são oxidase negativas (diferente de outros bacilos Gram negativos). Teste: Papel de filtro contendo um reagente incolor (tetrametil p- fenileno de amina), protegido da luz. Utilizando uma alça de platina as colônias do microrganismo são espalhadas sobre a área do papel. Prova positiva = desenvolve-se a cor púrpura em até 1 minuto. E. coli Pseudomonas Na reação negativa não há desenvolvimento de cor púrpura (cor da colônia a rósea). 17

18 PROVA DA PRODUÇÃO DE UREASE A urease é uma enzima que degrada a uréia em duas moléculas de amônia e uma de anidrido carbônico. Colônias são transferidas com uma alça para o meio contendo uréia, ph neutro e um indicador de ph, o vermelho fenol. Após o crescimento: Prova positiva quando a urease ataca a uréia alcalinizando o meio = rosa choque. Na prova negativa não há alteração da cor do meio. Proteus Os organismos do gênero Proteus são urease positivos diferentemente da maioria das enterobactérias. PROVA DA FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS Esta prova pode ser realizada de várias maneiras. A mais usual envolve a utilização de um meio com glicose ou outro açúcar e/ou álcool com ph neutro e um indicador de ph. Além disso utiliza-se um tubo de Durhan, invertido, imerso no meio. O meio é inoculado com a cultura teste e incubado. Enterobactérias produzem ácido devido a fermentação da glicose = meio se torna amarelo Exceção: Shigella produz ácido e não produz gás. 18

19 PROVA DA FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS A prova positiva é indicada pela viragem da cor do meio (amarelo) devido a produção de ácidos, com abaixamento do ph do meio A prova negativa é revelada pela ausência de mudança de cor (laranja ou vermelho). Além disso, o ácido fórmico é transformado em CO 2 e Hidrogênio, os quais são coletados pelo tubo de Durhan. PROVA DA PRODUÇÃO DE GÁS SULFÍDRICO OU SULFETO DE HIDROGÊNIO Existem duas vias fermentativas que produzem sulfeto de hidrogênio. Primeira via: O gás sulfídrico é produzido por redução do enxofre orgânico presente no aminoácido cisteína (nas peptonas do meio), através da ação da enzima cisteína desulfurase. Em meio de cultura contendo o aa sulfurado, inocula-se com a cultura teste e incuba-se apropriadamente. Coloca-se sobre a cultura uma tira de papel de filtro impregnada com solução saturada de acetato de chumbo. Na prova positiva = papel de filtro negro Na prova negativa a fita permanece branca. - + O H 2 S produzido é volátil e incolor, mas ao reagir com o acetato de chumbo forma-se sulfeto de chumbo, que enegrece o papel de filtro. 19

20 PROVA DA PRODUÇÃO DE GÁS SULFÍDRICO OU SULFETO DE HIDROGÊNIO Pela segunda via: o H 2 S pode ser produzido pela redução de compostos inorgânicos de enxofre, pela ação da enzima redutase do tiossulfato (convertem o tiossulfato em sulfito com liberação de sulfeto de hidrogênio). Para esse teste pode ser empregado o meio de TSI (tríplice sugar and iron) ou o de meio de SIM (sulfito, indol e motilidade). O meio é semi-sólido para permitir a respiração anaeróbia. Nesse caso, inocula-se o meio por punctura e incuba-se em aerobiose por 24h a 35 o C. Nas duas vias, o H 2 S produzido reage com o metal pesado formando sulfetos que apresentam coloração negra. Salmonella spp. = H 2 S + Shigella spp. = H 2 S PROVA DA PRODUÇÃO DE INDOL O indol é resultante da degradação do aa triptofano pela enzima triptofanase. A prova é realizada inoculando-se o meio contendo triptofano. Após a incubação colocar 0,5 ml do reagente de Kovacs através da parede interna do tubo. A prova positiva: Ocorre a complexação do indol com o aldeído, em meio ácido, formando o composto colorido. Desenvolve-se um anel de cor rósea em 5 minutos. A prova é negativa com qualquer outra tonalidade de cor (original do meio ou marrom). - + triptofanase Triptofano Indol + piruvato e amônia 20

21 PROVA DA MOTILIDADE A prova da motilidade indica indiretamente a presença de flagelos e (não é uma prova bioquímica e sim fisiológica). A prova é efetuada inoculando-se em linha reta, através da técnica da punctura (com agulha), 2/3 de um meio semi-sólido. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculação, turvando o meio. A prova é negativa quando os microrganismos ficam restritos ao local da inoculação sem, contudo, turvar o meio PROVAS DO MEIO DE TSI Meio de TSI (Triple Sugar Iron) permite avaliar: Fermentação da glicose, Produção de gás, Fermentação de lactose e/ou sacarose Produção de H 2 S. O TSI ou tríplice açúcar e ferro é um meio sólido distribuído de tal sorte que apresenta uma base e uma inclinação. Cor = vermelho cereja Deve ser inoculado por picada central até o fundo, seguido de espalhamento na superfície e incubação durante 18-24h a 35 o C. É constituído de: glicose (0,1%); lactose (1,0%); sacarose (1,0%); peptonas; aminoácidos, incluindo sulfurados; tiossulfato de sódio; citrato férrico amoniacal (indicador da produção de H 2 S), com ph neutro e um indicador de ph (vermelho de fenol). 21

22 PROVAS DO MEIO DE TSI Após o crescimento da bactéria pode-se observar os resultados: K=alcalina (vermelho) e A= ácida (amarelo) Resultado: expresso como A/A (inclinação e base ácidas = amarelo). Resultado é expresso como K/A (inclinação alcalina e base ácida); A K A A Presença de gases: Levantam ou fragmentam o meio. O resultado é representado como A/A com gás. H 2 S na presença de sais de ferro forma sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolúvel. PROVAS DO MEIO DE TSI Desse modo, pode-se observar num único meio os processos fermentativos, respiração aeróbia e anaeróbia. A utilização dos açúcares e aminoácidos na inclinação se dá apenas por respiração aeróbia. Na base os processos são realizados por fermentação (incluindo também putrefação), com utilização dos aminoácidos básicos, sulfurados, triptofano, com produção de gás sulfídrico, mercaptanas, aminas, dentre outras. Já a utilização do tiossulfato indica que ocorre respiração anaeróbia, gerando também gás sulfídrico. 22

23 PROVAS DO MEIO DE TSI Interpretação mais provável Ápice ou inclinação Base H 2 S Gás Sem crescimento = bactéria exigente Vermelho Vermelho neg neg Crescimento na superfície = Não Fermentador ou Gram (+) Vermelho Vermelho neg neg Crescimento na superfície = Gram (+) Amarelo Vermelho neg neg Enterobactéria ou Aeromonas lactose e sacarose negativas Vermelho Amarelo neg variável Enterobactéria Amarelo Amarelo neg variável Salmonella, Proteus/Morganella/Providencia e Citrobacter Amarelo Amarelo + variável Série Bioquímica (EPM, MILI, CITRATO ) O objetivo das provas bioquímicas é a identificação de um dos agentes conhecidos: Shigella Salmonella Escherichia coli Yersinia Além de outras enterobactérias, que deverão ser classificadas utilizando tabelas de identificação. Leitura das séries Bioquímicas e identificação dos microrganismos, conforme tabela de reações. Obs: Todas as enterobactérias fermentam a glicose 23

24 INTERPRETAÇÃO DO MEIO EPM Superfície Desaminação do Triptofano (enzima L-triptofano desaminase) Reação positiva verde escuro ou acastanhado Reação negativa superfície inalterada Base Produção de gás = Formação de bolhas ou rachaduras no meio Produção de H 2 S = Presença de pigmento negro de qualquer intensidade Hidrólise da Uréia = Coloração azul esverdeada (fraca) indica prova positiva (presença de urease) Glicose - Fermentação desse açúcar, com produção de gás. Prova positiva: meio amarelo, com ou sem presença de bolhas de ar. Enterobactérias Provas Bioquímicas EPM Inocular picando até o fundo - semear na superfície -incubar com a tampa frouxa 24hs/35 C Glicose formiase EPM Tiossulfat o-redutase Urease L-triptofanodesaminase Bactéria Fermenta glicose produção de ácido vira indicador para amarelo Bactéria Fermenta glicose produção de ácido fórmico enzima formiase desdobra ác. Fórmico em CO2 e H2 - bolhas Bactéria produz tiossulfato redutase age no tiossulfato de Na produz H2S. H2S reage com Fe do Citrato de Fe amoniacal sulfeto de Fe (precipitado negro) Bactéria produz urease - age sobre a uréia formando CO2 e NH3. NH3 dissolve-se sob forma de carbonato de amônia alcaliniza o meio - azul Tubo EPM - Fermentação da glicose, produção de gás, H2S, uréia, fenilalanina. Bactéria produz LTD que provoca desaminação de a.a., convertendoos em -cetoácidos. No caso do L-triptofano, formase ácido indol pirúvico reage com sais de Fe origina composto cíclico de cor verde escura 24

25 Enterobactérias Provas Bioquímicas - Mili MILi Tubo MILI - fazer picada central apenas - incubar 24hs/35 C Motilidade Lisina descarboxila se Triptofanas e Motilidade amostras móveis se difundem à partir do inóculo inicial turvando o meio. Amostras imóveis somente crescem no local onde foram semeadas Descarboxilases promovem remoção de CO2 dos a.a. produz amina alcalinizando o meio torna-se o meio cor púrpura Descarboxilação da lisina: lisina positiva roxo, na prova negativa o meio Se a.a. não é utilizado, através da fermentação permanece da glicose, acidifica-se o meio amarelo nos 2/3 inferiores. amarelado nos 2/3 Indol anel de indol faz parte da molécula de triptofano. Triptofanase age no a.a. libera anel pirrólico. Coloca-se reativo de Kovacs reage com indol anel vermelho Ágar CITRATO DE SIMMONS Citrato é a única fonte de carbono. Alguns microrganismos como a E. coli não possuem a permease do citrato (transporte do citrato para o interior da célula) e não crescem no meio contendo como única fonte de carbono o citrato. A prova é feita semeando-se a bactéria no meio sólido inclinado de citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em ph 6,8 a 7,0 apresenta-se verde. A inoculação deve ser feita com alça em agulha e em linha reta. A prova positiva (alcalinização do meio) = azul Prova negativa: coloração inalterada (verde original do meio) Observação: Não utilização do citrato (prova negativa) sem crescimento bacteriano

26 Enterobactérias Provas Bioquímicas Citrato de Simmons Citrato - inocular a superfície - incubar 24hs/35 C A prova positiva é evidenciada pelo aparecimento de coloração azul na superfície. Citrato de Simmons Amostras que utilizam citrato como única fonte de C também utilizam sal de amônia como única fonte de Ni libera o Na. Na junta-se com H2O e forma NaOH alcaliniza o meio, que vira indicador azul de bromotimol para azul TABELA PARA IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA DAS ENTEROBACTÉRIAS Bactérias Lactose Glicose com produção de gás EPM H 2 S Urease L-TD Motili -dade MILI Indol Lisina Descar bo-xilase CITRATO Citrato Escherichia coli / Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae / /+ + Citrobacter freundii - /+ + - /+ - / / Arizona Shigella sp /+ - - Edwardsiella tarda / Salmonella sp Serratia marcescens / Proteus mirabilis - + -/ /+ - - /+ Providencia rettgeri Yersinia enterocolitica /+ - / /+ 26