Aplicação das técnicas moleculares na monitorização de cultivos de microalgas e gestão das zonas costeras

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2 Aplicação das técnicas moleculares na monitorização de cultivos de microalgas e gestão das zonas costeras Patricia A. Clemente J. Assunção Departamento de Biotecnología Instituto Tecnológico de Canarias (ITC)

3 Porque é que se cultivan Microalgas? Actividade escassamente desenvolvida mas com um grande potencial económico. Actividade de baixo impacto ambiental (não compete por terra fértil). As actividades podem ser associados com o ambiente (águas residuais, hidroponia, gás de combustão, etc.) Legislação Sistemas Abiertos Sistemas Abertos Sistemas Fechados

Actividade de baixo impacto ambiental (não compete por terra fértil).

4 Cómo se cultivam las Microalgas? Laboratório Escalado Raceways (250L, L, ) Centrifugação Atomização Biomasa (seca, fresca)

5 Aplicação da Biología Molecular ANTES DURANTE DEPOIS Laboratório Cultivos Producto final

6 Laboratório A detecção de espécies de interesse em amostras de campo 3xs Amostras estirpes puras 3xs Semanas, Meses C- C+ PCR especifica Sequenciação Sequenciação

: Muitas espécies do mesmo género Só 1 espécie produz a sustancia de interese (ej.

7 Laboratório Identificação e/ou confirmação de estirpes adquiridas Espécies mal identificadas: Colecções, publicações, base de dados Identificação só até sp. : Muitas espécies do mesmo género Só 1 espécie produz a sustancia de interese (ej. Dunaliella sp., Nannochloropsis sp.) Taxonomía tradicional: Características fisiológicas y morfológicas.? Taxonomia tradicional

8 Engenharía genética Fontes naturales esgotadas (ex. Taxol) Knowhow en bacterias, hongos, levaduras Chlamydomonas reinhardtii: gama completa de ferramentas moleculares para a manipulação genética Microalgas: Fábricas unicelulares Tipo de proteína Função Aplicação Anticorpo Anticorpo derivado da IgG1 Actividade contra a glicoproteína D do vírus herpes simple Actividade contra o antigénio PA83 do ántrax Anticorpos monoclonais Anticorpos monoclonais Toxina B da cólera Factor necrose tumoral Vacina oral contra Staphylococcus aureus Tratamento do cáncer Vacina oral Terapêutica Grande capacidade para acumular biomasa (64.000L/4 semanas) (XXX-12h) Manipulação genética (6-8 semanas) Proteínas, biodiesel, pigmentos, Soro bovino amiloide asociado a las glándulas mamarias Descarboxilasa de ácido glutámico humana 65 Estimulação da produção de mucina no intestino para a imunização de recémnascidos Diagnóstico precoz da diabetes tipo I Terapêutica Terapêutica Organismo Costo de producción Tiempo de producción Capacidad de escalamiento Calidad del producto Riesgo de Contaminación Bactérias Baixo Corto Alto Baixo Endotoxinas Levaduras Medio Medio Alto Medio Baixo Células de insectos Alto Medio Medio Alto Alto Células de mamíferos Alto Longo Muito bajo Muito alto Virus-Priões Animais Alto Muy largo Bajo Muito alto Virus-Priões Células de plantas Baixo Corto Alto Alto Baixo Plantas Muito baixo Longo Muito alto Alto Baixo Microalgas Muito bajo Corto Muito alto Alto Baixo Factor de crescimento endotelial vascular humano Proteína B1 do grupo de alta mobilidad Tratamento do enfisema pulmonar e da disfunção eréctil; antidepressivo Cicatrização de feridas pela activação de células endoteliais Terapêutica Terapêutica Rivera Solís et al La microalga verde Chlamydomonas reinhardtii: nueva alternativa para la producción de proteínas recombinantes de interés médico. Ciencia, (oct-nov):1-9

Função Aplicação Anticorpo Anticorpo derivado da IgG1 Actividade contra a glicoproteína D do vírus herpes simple Actividade contra o antigénio PA83 do ántrax Anticorpos monoclonais Anticorpos

Cultivos de microalgas Identificação (Bacterias, Diatomeas, Dinoflagelados, Cianobacterias) PCR especificas (gênero, espécie ), Sequenciação (SSU, ITS, rbcl, ) Contaminação (sistemas

9 Cultivos de microalgas Identificação (Bacterias, Diatomeas, Dinoflagelados, Cianobacterias) PCR especificas (gênero, espécie ), Sequenciação (SSU, ITS, rbcl, ) Contaminação (sistemas abertos) Mais frequentes no verão Identificar a espécie: Toxicidade?. Tomar medidas para evitar novas contaminações. Espécie a identificar Extracção ADN PCR Sequenciação Sequenciação Identificação

abertos) Mais frequentes no verão Identificar a espécie: Toxicidade?

10 Identificação de toxinas nos cultivos de microalgas PCR (vs HPLC, ELISA, etc.) Identificar os genes que produzen toxinas: Microcistinas (mcya, mcyb, mcyc, mcyd, mcye, mcyg) Cilindrospermopsina GTGATTGAATTTCTTGGTCG GGAAATTTCTATGTCTGACTCAG ATCCAGCAGTTGAGCAAGC GCCGATGTTTGGCTGTAAAT ATCACTTCAATCTAACGACT AGTTGCTGCTGTAAGAAA GCAACATCCCAAGAGCAAAG CCGACAACATCACAAAGGC GACGCTCAAATGATGAAAC GCAACCGATAAAAACTCCC CGCAAACCCGATTTACAG CCCCTACCATCTTCATCTTC ACTCTCAAGTTATCCTCCCTC AATCGCTAAAACGCCACC GGCATTCCTAGTTATATTGCCATACTA GCCCGTTTTTGTCCCTTTCGTGC CCTCGCACATAGCCATTTGC GAAGCTCTGGAATCCGGTAA GGCAAATTGTGATAGCCACGAGC GATGGAACATCGCTCACTGGTG ndaf mcya mcyb mcyc mcyd mcye mcyg rpoc1 polyketide synthase peptide synthase Gene a identificar Extracção ADN PCR PCR convencional PCR a tempo real Furukawa K. J. of Bioscience and Bioengineering, (2006) 102 (2): 90-96; Ouahid Y. Environ Toxicol, (2005) 20: ; Fergursson KM, Saint CP. Environ Toxicol, (2003) 18(2):120-5.

GCCGATGTTTGGCTGTAAAT ATCACTTCAATCTAACGACT AGTTGCTGCTGTAAGAAA GCAACATCCCAAGAGCAAAG CCGACAACATCACAAAGGC GACGCTCAAATGATGAAAC GCAACCGATAAAAACTCCC CGCAAACCCGATTTACAG CCCCTACCATCTTCATCTTC

11 Legislação) Estudos de impacto ambiental (ex: A espécie a cultivar existe localmente?) Lista de especies Marinas de Canarias (Algas, Hongos, Plantas y Animales). Gobierno de Canarias (Estudos antes 2002). (micro-organismos: Bacterias, Dinoflagelados y Cianobacterias) Reino Plantae: sólo División Magnoliophyta No está contemplado División Chlorophyta: Tetraselmis, Dunaliella Taxonomia muda constantemente. Não detectar não significa que não exista. PCR especifica para detectar a espécie de cultivo no ambiente marinho próximo. PCR/sequenciação das espécies presentes nos cultivo de microalgas.

(micro-organismos: Bacterias, Dinoflagelados y Cianobacterias) Reino Plantae: sólo División Magnoliophyta No está contemplado División Chlorophyta:

Producto Final (Chlorella) Productos comerciais (comprimidos e cápsulas) Amostras de biomasa comercial Sequenciação do 18S rdna Outras especies (Scenedesmus, Parachlorella, ) Diferentes

12 Producto Final (Chlorella) Productos comerciais (comprimidos e cápsulas) Amostras de biomasa comercial Sequenciação do 18S rdna Outras especies (Scenedesmus, Parachlorella, ) Diferentes espécies de Chlorella (C. vulgaris, C. sorokiniana, ) Görs et al. (2010). Quality analysis of commercial Chlorella products used as dietary supplement in human nutrition. J Appl Phycol, 22:

espécies de Chlorella (C. vulgaris, C. sorokiniana, ) Görs et al. (2010).

13 Casos Prácticos (Planta Piloto ITC) 1 2??

Casos Practicos (Planta Piloto ITC) Sequenciação do 18S rdna, ITS BLAST (Basic Local Alignment Search Tool): http://www.ncbi.nlm.nih.

14 Casos Practicos (Planta Piloto ITC) Sequenciação do 18S rdna, ITS BLAST (Basic Local Alignment Search Tool): árvore filogenética Chlamydomonas oligothermica Nannochloropsis salina isolate D12 Nannochloropsis salina strain MBIC10063 Nannochloropsis gaditana Cepa problema Nannochloropsis limnetica strain SAG Nannochloropsis granulata strain MBIC10054 Nannochloropsis oceanica strain MBIC10090 Nannochloropsis maritima Nannochloropsis oceanica strain LAMB0001

gov árvore filogenética Chlamydomonas oligothermica Nannochloropsis salina isolate D12 Nannochloropsis salina strain

15 Casos Practicos (Planta Piloto ITC) Isochrysis galbana Nannochloropsis gaditana

16 OBRIGADA

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