Mestrado Integrado em Medicina Veterinária. Babesiose canina no distrito de Bragança

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1 Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Babesiose canina no distrito de Bragança Filipa Cristina Teixeira de Sousa Rodrigues Orientador: Prof. Doutor Luis Cardoso UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO VILA REAL, 2014

2 The murrain of Beasts (Gustave Doré) Behold, the hand of the Lord is upon thy cattle which is in the field, upon the horses, upon the asses, upon the camels, upon the oxen, and upon the sheep: there shall be a very grievous murrain. (Êxodo 9:3) II

3 AGRADECIMENTOS Ao Prof. Luis Lucas Cardoso por ter despertado em mim o adormecido gosto e interesse pelos ixodídeos e as doenças transmitidas por vetores, pela sua sempre disponibilidade, partilha de conhecimentos e pela sua amizade. O meu muito obrigado. Ao Dr. Duarte Diz Lopes, da VetSantiago - Clínica Veterinária Dr. Duarte Diz Lopes, pela sua visão de crescimento no conhecimento científico e espírito investigador e por me ter permitido percorrer esse caminho. Aos amigos Fátima, Patrick e Catarina, pelo constante apoio moral e espiritual. Ao Eng. Zé Luís pela sua ajuda técnico-florestal. A todos os cachorros que participaram neste estudo, sem eles não poderia concretizar este projeto. Aos meus pais, Judite e Nelson, pelo seu eterno amor, os meus pilares. III

4 RESUMO A babesiose canina (ou piroplasmose) é causada por protozoários transmitidos por carraças e afeta cães em muitas partes do mundo. As duas principais espécies reconhecidas como agentes da doença são Babesia canis e Babesia gibsoni, que correspondem respetivamente a formas intraeritrocitárias (ou piroplasmas) grandes (3-5 µm) e pequenas (0,5-2,5 µm). As espécies B. canis e Babesia vogeli, anteriormente consideradas subespécies de B. canis, são os dois agentes da babesiose canina mais frequentemente assinalados na Europa, estando associados às carraças Dermacentor reticulatus e Rhipicephalus sanguineus, respetivamente. Os sinais clínicos da doença são variáveis e incluem essencialmente apatia, anorexia, perda de apetite, mucosas pálidas, icterícia, urina escura, epistaxis e dor. Outras manifestações clínicas incluem trombocitopenia e anemia hemolítica. A babesiose canina causada por piroplasmas grandes é endémica no Nordeste Transmontano, e tanto as espécies B. canis como B. vogeli já foram especificamente identificadas em cães desta área geográfica. O presente trabalho faz uma abordagem à babesiose canina no distrito de Bragança, focando essencialmente dados clínicos de animais em que foi diagnosticada a doença. Foram analisados os processos clínicos de 110 cães suspeitos de hemoparasitoses, tendo sido diagnosticada babesiose em 84 deles (76,4%) através de observação de piroplasmas grandes em esfregaço de sangue periférico. Destes 84 cães, 46 (45%) eram machos, 38 (55%) eram fêmeas, 44 (52,4%) tinham menos de 3 anos de idade e aproximadamente 70% (57/84) dos cães tinham aptidão para a caça. Em 39 cães (46,4%) verificou-se a presença de carraças. Os sinais clínicos mais frequentes foram apatia (76,1%; 64/84), pigmentúria (68,3%; 41/60), anorexia (50%; 42/84), mucosas anémicas (35,1%; 27/77) e icterícia (13%; 10/77). Setenta e três cães (87%) (54 do concelho de Bragança e 19 do concelho de Vinhais) habitavam dentro da área de delimitação do Parque de Montesinho- Nogueira. Os casos de babesiose canina deste estudo incidem predominantemente em dois períodos específicos, no outono (outubro, novembro e dezembro) e na primavera (março, abril e maio). Em 19 cães foi confirmada a presença de Babesia canis por PCR e posterior análise por sequenciação do gene 18S rarn. Confirma-se a existência de babesiose canina na área em estudo, o Nordeste Transmontano, o que deve ser levado em conta na clínica de pequenos animais em termos de diagnóstico e, sobretudo na aplicação de medidas profiláticas. IV

5 ABSTRACT Canine babesiosis (or piroplasmosis) is a protozoal tick-borne disease with worldwide distribution. Two main species have been identified as aetiological agents of the disease in dogs: Babesia canis and Babesia gibsoni, which correspond to large (3 5 mm) and small (0.5 2,5 µm) intraerythrocytic parasitic forms (or piroplasms), respectively. Species B. canis and Babesia vogeli, previously considered as subspecies of B. canis, are the two most frequently reported agents of canine babesiosis in Europe, being associated with Dermacentor reticulatus and Rhipicephalus sanguineus ticks, respectively. The clinical manifestations of babesiosis are variable but essentially include lethargy, anorexia, decreased appetite, pale mucous membranes, jaundice, haemoglobinuria, epistaxis and pain. Thrombocytopenia and hemolytic anemia can also be present. Canine babesiosis caused by large piroplasms is endemic in the Northeast of Portugal and both species B. canis and B. vogeli have been molecularly identified in dogs from this geographical area. This dissertation presents an approach to the canine babesiosis in the district of Bragança, focusing essentially on clinical data from dogs diagnosed with babesiosis. From 110 dogs with suspected of a canine vector-borne disease, 84 were diagnosed with babesiosis (76.4%) by observing intraerythrocytic large piroplasms on peripheral blood smears. Of these 84 dogs, 46 (45%) were male, 38 (55%) were female, 44 (52.4%) had less than 3 years and approximately 70% (57/84) were hunting dogs. Thirty-nine dogs (46.4%) were found infested with ticks. The most frequent clinical signs were lethargy (76.1%, 64/84), haemoglobinuria (68.3%, 41/60), anorexia (50%, 42/84), pale mucous membranes (35.1%, 27/77) and jaundice (13%, 10/77). Seventy-three dogs (87%) (54 from the municipality of Bragança and 19 from the muncipality of Vinhais) lived within the limits of Montesinho- Nogueira Park. The present cases of canine babesiosis occurred mainly in two specific periods, during fall (October, November and December) and spring (March, April and May). In 19 of these dogs, the presence of B. canis was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and subsequent sequencing of the 18S rrna gene. The presence of canine babesiosis in the Northeast of Portugal should alert small animal veterinary practitioners in terms of diagnosis and also to promote effective control measures against this vector-borne disease. V

6 ÍNDICE GERAL Agradecimentos.. Resumo... Abstract... Índice geral. Lista de figuras Lista de gráficos.. Lista de tabelas Abreviaturas... III IV V VI VII VIII VIII IX 1. Revisão bibliográfica Introdução Taxonomia Distribuição geográfica e transmissão Ciclo de vida Patogenia e sinais clínicos Diagnóstico Tratamento Prevenção Material e métodos Resultados Sinais clínicos Discussão Conclusões Referências bibliográficas 38 VI

7 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Victor Babes... 1 Figura 2. Distribuição das espécies de Babesia canina na Europa baseadas maioritariamente por análise molecular... 8 Figura 3. Ciclo de vida de Babesia sp. (Mehlhorn e Schein, 1984). 9 Figura 4. Piroplasmas grandes Figura 5. Piroplasmas grandes Figura 6. Mucosas anémicas. 22 Figura 7. Mucosas ictéricas Figura 8. Presença de carraças Figura 9. Babesia spp. (piroplasmas grandes) Figura 10. Urinas escuras.. 23 Figura 11. Hemoaglutinação. 23 Figura 12. Merozoítos 24 Figura 13. Merozoítos 24 Figura 14. Merozoítos 24 Figura 15. Merozoítos 24 Figura 16. Merozoítos livres.. 24 Figura 17. Trofozoítos Figura 18. Pré-gametócitos 25 Figura 19. Monocitose Figura 20. Fagocitose 25 Figura 21. Podengo Português.. 25 Figura 22. Área de delimitação da Intervenção Territorial Integrada Montesinho Nogueira (ITI- MN) (adaptado de VII 28

8 Figura 23. Distribuição nas diferentes freguesias, dos casos clínicos de babesiose, no distrito de Bragança 29 Figura 24. D. reticulatus macho (3,9 mm) Figura 25. Petéquias mucosa oral.. 30 Figura 26. Tubo de hemograma. 31 Figura 27. Mórula de Ehrlichia canis. 31 LISTA DE GRÁFICOS Gráfio 1. Distribuição dos casos de babesiose canina ao longo dos meses do ano (Abril de 2008 a Maio de 2012)... Gráfico 2. Distribuição dos casos de babesiose canina ao longo dos anos de 2008 a LISTA DE TABELAS Tabela 1. Piroplasmas do género Babesia que afetam o homem (adaptado de: Schnittger, 2012)... 3 Tabela 2. Piroplasmas do género Babesia nos animais domésticos (adaptado de: Schnittger, 2012)... 3 Tabela 3. Piroplasmas recentemente identificadas em mamíferos selvagens e aves (adaptado de: Schnittger, 2012). Tabela 4. Distribuição, vetores e características citológicas de Babesia spp. e Theileria spp. que infetam cães (adaptado de: Solano-Gallego e Baneth, 2011) Tabela 5. Espécies de Babesia encontradas em hospedeiros inesperados (adaptado de: Schnittger, 2012). Tabela 6. Principais sinais clínicos e alterações laboratoriais na infeção pelas várias espécies de Babesia no cão (adaptado de: Solano-Gallego e Baneth, 2011) Tabela 7. Protocolos de tratamento de babesiose canina (adaptado de: Solano-Gallego e Baneth, 2011) Tabela 8. Raças dos cães com babesiose (n = 84). (*) Raças com aptidão de caça.. 26 Tabela 9. Casos de babesiose canina nas diferentes freguesias dos concelhos de Bragança e Vinhais, do distrito de Bragança.. 28 Tabela 10. Principais sinais clínicos detetados em cães com babesiose diagnosticada por observação de piroplasmas grandes no sangue periférico 30 VIII

9 ABREVIATURAS ACTH ADN BID CID CK ELISA IFAT IM MODS TID PCR PO rarn SC SID SIRS hormona adrenocorticotrófica (do inglês adrenocorticotropic hormone ) ácido desoxirribonucleico duas vezes por dia (do latim bis in die) coagulação intravascular disseminada creatinina-quinase ensaio imunoenzimático (do inglês (enzyme-linked Immunosorbent assay ) imunofluorescência indirecta (do inglês indirect fluorescent antibody test ) intra-muscular síndrome de disfunção orgânica múltipla (do inglês multiple organ dysfunction syndrome ) três vezes ao dia (do latim ter in die) reação em cadeia da polimerase (do inglês polymerase chain reaction ) via oral (do latim per os) ácido ribonucleico do ribossoma subcutânea uma vez por dia (do latim semel in die) síndrome da resposta inflamatória sistémica (do inglês systemic inflamatory response syndrome ) IX

10 1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1. INTRODUÇÃO A babesiose ou piroplasmose é uma hemoparasitose de importante significado clínico associada a carraças e que foi identificada em animais domésticos e selvagens, tendo atualmente uma distribuição mundial. Os seus agentes etiológicos são dos mais detetados, e além dos mamíferos podem afetar aves (Schnittger et al., 2012). Embora na babesiose canina se mencione essencialmente o género Babesia, estudos recentes reforçam a ideia de que parasitas do género Theileria também podem infetar e ter um papel patogénico nos cães domésticos. Nos cães, a infeção por piroplasmas resulta numa variedade de manifestações clínicas, desde doença subclínica a uma apresentação grave, caracterizada por febre, anemia, icterícia, esplenomegalia, letargia e colapso associados a hemólise intra e extra vascular, hipoxia tecidular, resposta inflamatória, trombocitopenia e pigmentúria (Irwin, 2010). A primeira epidemia ocorreu provavelmente há mais de 2000 anos, estando descrita no Livro do Êxodo uma praga divina que infetou todo o gado do Ramsés II (Livro do Êxodo 9:3) (Boustani e Gelfand, 1996). Figura 1. Victor Babes (fonte: internet) Mas foi no fim do século XIX, em 1888 que um biólogo romeno, Victor Babes (Figura 1) descobriu uns microrganismos, inicialmente pensando serem bactérias, dentro de glóbulos vermelhos de bovinos na Roménia, que causavam hemoglobinúria e cuja doença era denominada de febre de água vermelha ( red water fever ). Passado algum tempo o mesmo 1

11 investigador também observou esses agentes em glóbulos vermelhos de ovinos (Babes, 1888). Estes agentes foram mais tarde denominados de Babesia bovis e Babesia ovis, respetivamente, e o género foi então identificado como Babesia em honra ao Dr. Babes (Uilenberg, 2006). Em 1889 Smith e Kilborne identificaram um protozoário responsável pela febre do gado do Texas ( Texas cattle fever ) e denominaram-no como Pyrosoma bigeminum, que corresponde atualmente à Babesia bigemina. Mais tarde em 1893 os mesmos investigadores concluíram que este microrganismo era transmitido por uma carraça, Boophilus annulatus, estabelecendo pela primeira vez o papel de carraças como o artrópode vetor de uma doença infeciosa (Smith e Kilborne, 1893). Em canídeos, os parasitas do género Babesia foram primeiramente observados em Itália em 1895 por Piana e Galli-Valerio num cão de caça, que foi tratado, aparentemente com sucesso com comprimidos que continham calomel, aloé, sulfato de quinino e vinho Marsala (Piana e Galli-Valerio, 1895). Em 1904 foram também identificados piroplasmas em eritrócitos de cavalos em África, provavelmente a espécie atual Babesia caballi (Koch, 1904). Em 1910, Patton descreveu, pela primeira vez, piroplasmas pequenos em canídeos (Patton, 1910). Nos Estados Unidos foi Eaton em 1934 que identificou o primeiro caso de babesiose canina, provavelmente Babesia vogeli (Eaton, 1934). O primeiro caso de babesiose humana foi descrito em 1957 na Croácia, num agricultor esplenectomizado, numa área endémica de babesiose bovina por Babesia bovis (Skrabalo e Deanovi, 1957). Estes parasitas intraeritrocitários do género Babesia e Theileria são comumente denominadas de piroplasmas devido à sua forma de pera quando observadas ao microscópio (Irwin, 2009). Em termos taxonómicos, pertencem ao filo Apicomplexa, um antigo ramo da linhagem Eucariota caracterizado pela presença de um complexo apical e um citoesqueleto único (Chauvin et al., 2009), classe Piroplasmea e ordem Piroplasmida que inclui a Família Babessidae, onde se enquadra o género Babesia, e a família Theileriidae que inclui os géneros Theileria e Cytauxozoon. Já foram identificadas mais de 100 espécies de Babesia (Levine, 1988) (Tabelas 1, 2 e 3). Os géneros Babesia e Theileria estão também relacionados estrutural, funcional e filogeneticamente com o género Plasmodium, de que algumas espécies causam a malária ou paludismo no homem (Lau et al., 2009). 2

12 Tabela 1. Piroplasmas do género Babesia que afetam o homem (adaptado de: Schnittger et al., 2012). Espécie Distribuição geográfica B. microti Estado Unidos Japão, Taiwan, Alemanha B. venatorum Áustria, Itália, Alemanha, Bélgica B. divergens Estados Unidos Babesa sp. CA1 Estados Unidos B. divergens-like Estados Unidos CA3, CA4 Babesia sp. (ovine) Coreia do Sul Tabela 2. Piroplasmas do género Babesia nos animais domésticos (adaptado de: Schnittger,et al., 2012). Hospedeiro Espécie Distribuição geográfica Bovinos B. bovis África, América, Ásia, Austrália, B. bigemina África, América, Ásia, Austrália, Europa B. major Ásia, Europa Europa B. occultans África B. ovata Ásia B. divergens Europa Babesia sp. Kashi China Equinos T. equi Europa, América Equinos, asininos B. caballi Europa, América Suínos B. trautmanni África, Europa Pequenos ruminantes B. crassa Ásia B. ovis África, Ásia, Europa B. motasi África, Ásia, Europa Babesia sp. Xinjiang China Cão B. vogeli África, América, Ásia, Austrália, B. conradae América (Estado Unidos) Europa B. gibsoni América (Brasil) Babesia sp. América (Estado Unidos) B. rossi África do Sul, Nigéria, Sudão B. microti-like Espanha, Portugal B. canis Europa Gato B. felis África do Sul B. cani presentii Israel 3

13 Tabela 3. Piroplasmas recentemente identificadas em mamíferos selvagens e aves (adaptado de: Schnittger et al., 2012). Hospedeiro Espécie Gaivota (Larus cachinnans) Kiwi (Apteryx australis mantelli) Atobá-pardo (Sula leucogaster) Morcego (Pipistrellus sp.) Rinoceronte-negro (Diceros bicornis) Corço (Capreolus capreolus) Veado (Cervus elaphus) Chita (Acinonyx jubatus) Leão (Panthera leo, P. pardus) Macaco-japonês (Macaca fuscata) Babuíno (Papio cynocephalus) Urso-negro-asiático (Ursus thibetanus) Urso-pardo (Ursus arctos) Guaxinim (Procyon lotor) B. bennetti B. kiwiensis B. polea B. vesperuginis B. bicornis B. capreoli B. odocoilei B. lengau B. leo Babesia sp. Babesia sp. Babesia sp. Babesia sp. Babesia sp TAXONOMIA Historicamente o critério de identificação deste parasita nos cães, baseou-se na sua morfologia dentro do eritrócito (forma piriforme), sendo que todos os piroplasmas grandes (3,0-5,0 µm) eram classificados como Babesia canis enquanto os piroplasmas de menores dimensões (1,5-2,5 µm) denominavam-se Babesia gibsoni (Boozer e Macintire, 2003). Durante várias décadas, esta classificação taxonómica manteve-se para estes parasitas, até que Reichnow, uma protozoologista alemão, em 1935, sugeriu diferenças na virulência de B. canis isoladas na Europa e no Norte de África, que seriam as futuras subespécies B. canis canis e B. canis vogeli, respetivamente (Irwin, 2009). No fim dos anos 1980 foi proposta a divisão da espécie B. canis em três subespécies: B. canis canis, B. canis vogeli (Reichenow, 1935) e B. canis rossi (Nuttal, 1910), baseado nas diferenças da especificidade do vetor, distribuição geográfica e propriedades patogénicas e antigénicas (Uilenberg et al., 1989). Através de métodos moleculares que confirmaram a distinção genotípica destas três subespécies, foi depois proposta a sua classificação como três espécies diferentes (Zahler et al., 1998; Carret et al., 1999). Entretanto já foi identificada uma quarta nova espécie de piroplasma grande Babesia sp. (ainda sem nome específico) geneticamente relacionada com a B. bigemina dos bovinos, descrita em cães com sinais de 4

14 babesiose, na Carolina do Norte, nos Estados Unidos (Birkenheuer et al., 2004b). Babesia caballi, piroplasma típico dos cavalos, foi identificado molecularmente em cães assintomáticos na Croácia (Beck et al., 2009). Em relação aos piroplasmas pequenos, além de Babesia gibsoni (Patton,1910), reconhecem-se mais duas espécies geneticamente distintas, e com efeitos clínicos também diferentes: Babesia conradae (Kjemtrup et al., 2000), e Babesia microti-like (ou Theileria annae) (Zahler et al., 2000a; Camacho et al., 2001). Theileria sp. (África do Sul), Theileria annulata e Theileria equi também foram já diagnosticadas molecularmente em cães, mas ainda com significado clínico desconhecido. (Matjila et al., 2008; Criado-Fornelio et al., 2003b; Beck et al., 2009). A classificação dos piroplasmas caninos tem sido largamente debatida entre os parasitologistas, especialmente no que diz respeito à nomenclatura dos piroplasmas pequenos. Além disso, os dados das análises moleculares dos vários estádios dentro do hospedeiro mamífero não esclarecem os pormenores do ciclo de vida destes piroplasmas, e também não se conseguiu ainda identificar todos os seus vetores artrópodes. Os estádios intra-eritrocitários dos géneros Babesia e Theileria podem ser estruturalmente semelhantes quando observados ao microscópio ótico. Estes dois géneros são historicamente distintos em certos estádios do seu ciclo biológico, e na presença ou não de transmissão transovárica na carraça. A diferente classificação filogénica destes piroplasmas pequenos baseia-se somente em dados moleculares, nomeadamente na subunidade ribossómica 18S (18S rarn - ácido ribonucleico do ribossoma). Os estádios pré-eritrocitários, nos linfócitos e macrófagos, característicos do género Theileria, ainda não foram observados em cães infetados. No entanto foi já possível observar piroplasmas em forma de tétrada (Cruz de Malta), considerada característica de Theileira spp. e Babesia microti (piroplasma de roedores com carácter zoonótico), e esquizogonia observada em linfócitos, em cães infetados por B. conradae. Os piroplasmas B. microti-like identificados em cães na Galiza (Espanha) estão filogeneticamente relacionados com B. microti (Irwin, 2009). O piroplasma B. microti-like também é designado isolado ou estirpe espanhola ( Spanish isolate ) pelo fato de ter sido detetado pela primeira vez num cão na Alemanha que tinha sido infetado nos Pirenéus em Espanha (Zahler et al, 2000a). 5

15 1.3. DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA E TRANSMISSÃO A distribuição geográfica do agente causal, e consequentemente a ocorrência da babesiose canina, está largamente dependente do habitat da espécie dos vetores, neste caso as carraças (Tabela 4). Tabela 4. Distribuição, vetores e características citológicas de Babesia sp. e Theileria sp. que infetam cães (adaptado de: Solano-Gallego e Baneth, 2011). Espécie Distribuição geográfica Vetor (s) Dimensões (µm) Aparência citológica B. rossi África Sul, Nigéria, Sudão Haemophysalis elliptica (H. leachi) 2x5 Normalmente aos pares B. canis Europa Dermacentor spp. 2x5 Normalmente aos pares B. vogeli África, Ásia, Europa, América Norte/Centro/ Sul, Austrália Rhipicephalus sanguineus 2,5x4,5 Piroplasmas únicos ou aos pares Babesia spp. Leste dos Estados Unidos B. gibsoni Sudeste Ásia, Estados Unidos, América do Sul, Austrália, Europa B. conradae Estados Unidos (Califórnia) --- 2x6 Amebóide, em pares, piriforme H. longicornis 1x3 Geralmente H. bispinosa piroplasmas R. sanguineus únicos R. sanguineus? 0,3-3 Anel, tétrada, amebóide B. microti-like (Theileria annae) Espanha (Galiza, Burgos), Croácia, América Norte Ixodes hexagonus? I. ricinus? R. sanguineus 1x2,5 Geralmente piroplasmas únicos Theileria spp. África do Sul --- Deteção molecular ---- Babesia rossi, transmitida por Hemaphysalis elliptica, está restrita, até este momento, ao continente africano, e B. canis tem sido maioritariamente encontrada na Europa, enquanto B. vogeli e B. gibsoni têm uma distribuição geográfica mais alargada. No caso específico da Europa são várias as espécies de Babesia reportadas (Figura 2) (Solano-Gallego et al., 2011). Estudos moleculares de babesiose canina demonstram a presença de B. canis, transmitida por Dermacentor reticulatus, em Espanha (Ruiz de Gopegui et al., 2007), Polónia (Cacciò et al., 6

16 2002), Hungria (Földvári et al., 2005), Rússia (Rar et al., 2005), Suíça (Porchet et al., 2007), Roménia (Ionita et al., 2012) e Alemanha (Zahler et al., 1998). B. vogeli já foi diagnosticada na Turquia (Gulanber et al., 2006), e mais recentemente o primeiro caso autóctone de B. canis num cão foi identificado na Noruega (Oines et al., 2010). Na Holanda foi descrito um surto de babesiose canina autóctone por B. canis (Matjila et al., 2005). Babesia vogeli, transmitida por Rhipicephalus sanguineus, distribui-se pelos cinco continentes: América do Norte (Boozer et al., 2003), América do Sul (Passos et al., 2005), Europa (Cacciò et al., 2002; Solano-Gallego et al., 2008; Cardoso et al., 2008, 2010), África do Sul (Matjila et al., 2004), Australia (Jefferies et al., 2003) e Ásia (Inokuma et al., 2004). A presença das espécies B. canis e B. vogeli em cães do mesmo país foi descrita na Eslovénia (Duh et al., 2004), França (Cacciò et al., 2002), Itália (Solano-Gallego et al., 2008), Espanha (Criado-Fornelio et al., 2007), na Albânia (Hamel et al., 2009) e Portugal (Cardoso et al., 2008). Figura 2. Distribuição das espécies de Babesia canina na Europa baseadas maioritariamente por análise molecular (adaptado de: Solano-Gallego e Baneth, 2011). Em relação aos piroplasmas pequenos, o que tem maior distribuição geográfica é B. gibsoni (Lobetti, 1998; Inokuma et al., 2004; Criado-Fornelio et al., 2003a; Hartelt et al., 2007; Birkenheuer et al., 2005; Trotta et al. 2009), também denominada estirpe asiática devido à sua primeira identificação molecular em países asiáticos. Carraças do género Haemophysalis e provavelmente R. sanguineus são os vetores (Solano-Gallego et al., 2009). B. gibsoni pode ser ainda transmitida por via de transfusão sanguínea (Stegeman et al., 2003) e transplacentária (Fukumoto et al., 2005). Vários estudos demonstraram transmissão direta 7

17 de B. gibsoni de cão para cão através de mordeduras, saliva ou sangue (Birkenheuer et al, 2005; Jefferies et al., 2007; Yeagley et al., 2009). Embora B. gibsoni possa afetar qualquer cão, existe uma elevada prevalência em raças cães de luta com Pit Bull Terrier e Tosa Ino (Matsuu et al., 2004; Lee et al., 2009). A importância clínica e epidemiológica de B. gibsoni na Europa ainda não está bem estabelecida, tendo sido diagnosticados quatro casos em Espanha (Tabar et al, 2009) e dois na Alemanha (Hartelt et al., 2007). Babesia microti-like ( Spanish isolate, T. annae) é neste momento endémico na Galiza, no Norte de Espanha (Camacho-Garcia, 2006), mas também já foram reportados casos esporádicos em Portugal (Simões et al, 2011), Croácia (Beck et al., 2009) e Estados Unidos (Yeagley et al., 2009), cujo vetor mais provável é Ixodes hexagonus (Camacho et al., 2003). Babesia conradae é neste momento reportada no sul da Califórnia (Kjemtrup et al., 2006; Zahler et al, 2000b). No caso específico da identificação de B. microti-like nos Estados Unidos, questionase se serão casos esporádicos ou se o piroplasma foi introduzido no continente americano por cães infetados vindos da Europa. No entanto, casos descritos em raposas (Birkenheur et al., 2010) levantam a hipótese destas serem reservatórios para a infeção em caninos (Irwin, 2010). Foram também reportados esporadicamente, infeções por T. equi, T. annulata e Babesia caballi, diagnosticados por PCR, em cães em Espanha (Criado-Fornelio et al., 2007), Croácia (Beck et al., 2009) e França (Fritz et al, 2010), mas ainda sem significado clínico e epidemiológico. No caso específico de Portugal, a babesiose canina causada por piroplasmas grandes foi já diagnosticada no Nordeste Transmontano (Diz-Lopes et al., 2005), e tanto as espécies B. canis como B. vogeli foram especificamente identificadas em cães da mesma área geográfica (Cardoso et al., 2008, 2010) CICLO DE VIDA Algumas espécies de Babesia, incluindo B. canis, podem ser infetantes para o seu hospedeiro vertebrado, somente dois a três dias depois da carraça ter-se fixado (Schein et al., 1979). Os hospedeiros vertebrados são infetados pela injeção de esporozoítos da saliva da carraça aquando da sua refeição de sangue. Pensa-se que a alteração da temperatura ou a 8

18 presença de sangue no trato intestinal da carraça seja estímulo para a ativação da maturação dos esporozoítos em trofozoítos. Estes trofozoítos, em forma de anel, invadem os eritrócitos (no caso do género Theileria, primeiro parasitam linfócitos e só depois os eritrócitos) originando dois merozoítos, em forma de pera, por divisão binária (assexuada), denominada fase de merogonia. Estes merozoitos podem dividir-se até oito ou mais parasitas dentro de um só eritrócito. Depois da lise do eritrócito, cada merozoito irá parasitar outros eritrócitos e assim sucessivamente. Alguns merozóitos param de se dividir e evoluem para prégametócitos (Figura 3). Quando os eritrócitos parasitados são ingeridos pela carraça aquando da sua refeição de sangue, os pré-gametócitos diferenciam-se em gametócitos que depois sofrem fusão e originam um zigoto (8-10 µm), finalizando a fase de gamogonia. Este zigoto invade as células intestinais, evolui para um estádio móvel, o oocineto, iniciando meiose (esporogonia), característica importante no filo Apicomplexa (Chauvin et al., 2009). Nesta fase estas estruturas podem invadir vários órgãos da carraça. Figura 3. Ciclo de vida de Babesia sp. (Mehlhorn e Schein, 1984) Legenda: esporozoítos (Sz); trofozoítos (T); merozoítos (M); pré-gametócitos (G); gametócitos (Sk); zigoto (Z); transmissão transovárica (To); transmissão transestadial (Ts); glândulas salivares (Sg); esporozoítos (Sz) A invasão dos oocinetos nos ovários da carraça fêmea pode resultar na infeção dos ovos (transovárica), acontecendo somente em algumas espécies de piroplasmas grandes (Babesia sensu strictu). Esta multiplicação assexuada desenvolve-se também nos vários estádios da carraça, larva, ninfa e adulto, explicando assim a transmissão através das várias gerações (transestadial) (Taboada e Lobetti, 2006; Uilenberg, 2006). Finalmente os oocinetos, 9

19 dirigem-se às glândulas salivares da carraça onde termina o ciclo originando os esporozoítos. Os esporozoítos representam o estádio infetante de Babesia. No hospedeiro vertebrado o ciclo de vida de Babesia sp., desenvolve-se exclusivamente dentro dos eritrócitos, enquanto Theileira sp. apresenta uma fase préeritrocitária nos leucócitos (Chauvin et al., 2009; Uilenberg, 2006). A transmissão por via transovárica não está descrita em espécies do género Theileria, somente a transestadial (Chauvin et al., 2009). As espécies de Babesia são específicas em relação ao seu vetor e normalmente está associada a uma só espécie de carraça, numa área geográfica particular. Em relação à especificidade do hospedeiro vertebrado, pensava-se ser restrito, no entanto, depois de estudos moleculares, provou-se que algumas espécies de Babesia podem ter diferentes hospedeiros vertebrados (Tabela 5). Tabela 5. Espécies de Babesia encontradas em hospedeiros inesperados. Espécie Hospedeiro País (adaptado de: Schnittger et al., 2012) B. bigemina Veado Estados Unidos, Brasil B. bovis Veado Estados Unidos, Brasil Cavalo Itália, Argentina B. caballi Zebra África do Sul Cão Croácia Dromedário Jordânia B. canis Gato Espanha, Portugal B. capreoli Cabra Áustria B. divergens Coelho Estados Unidos Bovino Áustria, França, Alemanha, Suécia, Irlanda Cabra Áustria Veado França, Irlanda, Espanha, Eslovénica, Grã-Bretanha B. felis Cão Roménia B. microti Cão Espanha Raposa Polónia Cavalo Itália B. microti - like Macaco Japão Esquilo Japão B. ovis Cabra Espanha B. vogeli Gato Tailândia 10

20 1.5. PATOGENIA E SINAIS CLÍNICOS A patogenia da babesiose varia consideravelmente devido sobretudo às diferentes espécies envolvidas, mas outros fatores também estão envolvidos: a idade, o estado imunitário do hospedeiro vertebrado e doenças concomitantes (Irwin, 2009). A inoculação de esporozoítos no hospedeiro vertebrado e a replicação intraeritrocitária dos merozoítos, irá desencadear uma resposta imunitária. Mesmo numa infeção primária, a expressão clínica de babesiose pode depender da raça e da idade do animal. Algumas raças (Beagle, Fox Terrier, Porcelana, Teckel ou sem raça definida) podem ser mais resistentes a B. canis do que outras (Cocker Spaniel, Griffon, Yorkshire Terrier, Doberman, Pequinês) (Martinod et al., 1986). As diferentes respostas à infeção por Babesia, dependendo da espécie, raça e características individuais dos hospedeiros vertebrados, demonstram que pode existir uma base genética na resistência à babesiose. A exposição de um cão a reinfeções repetidas gere um fenómeno de imunização adquirida (como no paludismo), e em zonas endémicas estes cães podem tornar-se portadores assintomáticos (Wlosniewski et al., 1997). Na infeção por Babesia estão envolvidos mecanismos imunitários humorais e celulares. O importante papel da resposta celular, na proteção contra o parasita é demonstrado pela elevada suscetibilidade dos animais esplenectomizados. A produção de anticorpos iniciase cerca de 7 dias depois da infeção por B. canis e persiste por vários meses (Brandão et al., 2003). As espécies de Babesia desenvolveram estratégias que evitam ou retardam a resposta imunitária do hospedeiro vertebrado. Esta adaptação resulta da modulação da resposta imunitária do hospedeiro. A blastogénese dos linfócitos e a produção de anticorpos está diminuído nos cães infetados por B. gibsoni (Adachi et al., 1992). A capacidade de algumas espécies de Babesia de aderir às células endoteliais, originando o sequestro dos eritrócitos na microvasculatura, permite persistir no organismo do hospedeiro vertebrado, não passando pelo baço. Este mecanismo permite também estar mais perto dos locais de inoculação da carraça (Chauvin et al., 2009). A maior parte dos sinais clínicos observados na babesiose canina, são consequência da anemia hemolítica e da síndrome da resposta sistémica inflamatória (SIRS) que origina uma falha orgânica sistémica (Taboada e Lobetti, 2006). A maior parte dos cães com babesiose desenvolve anemia hemolítica e/ou trombocitopenia, juntamente com vários graus de 11

21 anorexia, febre, esplenomegalia, icterícia e pigmentúria. A presença de múltiplas coinfecções (que acontece com alguma frequência por partilha do mesmo vetor) dificulta uma correta identificação dos sinais clínicos específicos da babesiose (Irwin, 2010). A gravidade da anemia não é diretamente proporcional ao grau de parasitémia, inclusive nos casos agudos, em que a parasitémia pode ser baixa. Por isso, a causa da hemólise envolve mais do que a lesão direta do parasita (Irwin, 2010). A anemia hemolítica ocorre devido à lise direta dos eritrócitos pela replicação intracelular dos parasitas que causam hemólise intravascular, bem como pela destruição dos eritrócitos pelos macrófagos no fígado e baço (hemólise extravascular) (Day et al., 1999). Os diversos mecanismos envolvidos na destruição das células incluem: ligação de anticorpos e ativação do complemento (Adachi et al. 1995; Carli et al., 2009), produção de fatores hemolíticos no soro (Onishi et al., 1990), dano oxidativo e fagocitose dos eritrócitos (Murase et al., 1996; Otsuka et al., 2001) e diminuição na fragilidade osmótica dos eritrócitos (Makinde et al., 1994). Está documentada a produção de anticorpos anti-eritrócitos em cães infetados por B. gibsoni (Adachi et al., 1992) e B. vogeli, mas não no caso de infeção por B. canis (Carli et al., 2009). A hemólise intensa resulta em hemoglobinémia, hemoglobinúria, bilirrubinémia e bilirrubinúria. A hipoxia tecidular é um fator importante que contribui largamente para os sinais clínicos de babesiose canina. As causas de hipoxia incluem anemia, choque hipovolémico, estase vascular por sequestro dos eritrócitos, destruição da hemoglobina e por conseguinte diminuição no aporte de oxigénio (Ayood et al., 2010; Taboada e Lobetti, 2006). Os órgãos mais afetados pela hipoxia são o rim, o músculo e o sistema nervoso central. A hipoxia tecidular, o choque hipertensivo, as alterações multiorgânicas e elevada mortalidade são grandemente atribuídos a infeções por B. rossi (Jacobson, 2006; Reyes et al., 1998). O baço tem um importante papel no controlo da babesiose (Homer et al., 2000). Cães esplenectomizados que foram experimentalmente infetados por B. canis desenvolveram parasitémia e sinais clínicos rapidamente (Vercammen et al., 1995). A esplenectomia é um fator de risco importante para o desenvolvimento de babesiose em humanos e potencialmente fatal (Boustani e Gelfand, 1996), bem como na babesiose canina (Camacho et al., 2001). Além da anemia, a trombocitopenia é a alteração hematológica mais importante na patogenia da babesiose canina. A trombocitopenia ligeira é um dado frequente na babesiose canina (Bourdeau e Guelfi, 1995) mas estudos recentes revelaram trombocitopenia em mais de 99% dos animais, a maior parte deles moderado a grave (Furlanello et al., 2005; Zygner et al., 2007). Existem vários mecanismos que explicam a diminuição das plaquetas em 12

22 circulação, nomeadamente coagulação intravascular disseminada (CID), destruição imunomediada, e sequestro esplénico (Boozer e Macintire, 2003). A insuficiência renal aguda está descrita como uma complicação da infeção por Babesia sp. Os danos renais são normalmente mínimos (Lobetti e Jacobson, 2001). Em estudos experimentais foi proposto que a hipoxia tecidular produzia insuficiência renal (Lobetti et al., 1996). A formação de imunocomplexos juntamente com eventual necrose tubular devido à hemoglobinúria foi também proposta como principal mecanismo na nefropatia aguda por Babesia sp. (Wozniak et al., 1997). Histologicamente, as alterações observadas a nível renal são essencialmente caraterizadas por degenerescência vacuolarhidrópica e necrose das células epiteliais dos túbulos proximais, não afetando os glomérulos (Mathe et al., 2007). Os valores de creatinina-quinase (CK) também podem estar elevados (Furlanello et al., 2005) devido possivelmente à rabdomiólise, já descrita como uma complicação de infeção por B. rossi (Lobetti et al., 1996). Em casos complicados de babesiose associada a B. rossi, na África do Sul, estão descritos, hipoglicémia (Keller et al., 2004), hiperlactémia persistente (Nel et al., 2004), valores elevados de cortisol e ACTH e tiroxina (T4) total baixa (Schoeman et al., 2007). A leucocitose ou leucopenia estão descritas nas diferentes fases de infeção. A leucopenia com neutropenia são os parâmetros com os valores mais elevados (Furlanello et al., 2005; Zygner et al., 2007). A hiperfibrinogemia é um dado comum na babesiose canina (Schetters et al, 1996), num estudo foi de 100%, sugerindo a existência de uma resposta inflamatória aguda (Furlanello et al., 2005). Foi proposta a existência de um mecanismo fisiopatológico do hospedeiro que explica as diferentes apresentações clínicas de babesiose canina por B. canis (Schetters et al., 2009a) que se baseia na hipótese de a síndrome de resposta inflamatória (SIRS) originar a síndrome de disfunção orgânica múltipla (MODS) (Matijakto et al., 2007). A babesiose canina é geralmente classificada clinicamente em duas formas, complicada e não complicada, ou ainda em, hiperaguda, aguda, crónica e subclínica. Na forma de babesiose não complicada os sinais clínicos incluem febre, anemia, taquipneia, esplenomegalia, icterícia e depressão. A forma complicada depende particularmente das complicações que se desenvolvem e dos sistemas afetados, podendo incluir insuficiência renal, hepatopatia, edema pulmonar, lesões no miocárdio e no sistema nervoso central (Lobetti, 1998, Lobetti e Jacobson, 2001). A fase crónica (também referido como um estado de premunição) desenvolve-se na maior parte dos cães, infetados por Babesia, que foram ou 13

23 não tratados. Esse período de tempo ainda não está bem definido, mas suspeita-se que será de meses ou até mesmo anos. As infeções crónicas são frequentemente assintomáticas, podendo revelar-se em momentos de stresse ou de imunodepressão (Irwin, 2010). As consequências clínicas de uma infeção crónica ainda estão pouco estudadas e esclarecidas. Enquanto a maior parte dos cães toleram aparentemente bem esta condição imunológica, teoricamente estão em risco de desenvolver complicações imunomediadas e sofrer recaídas clínicas em situações de imunodepressão. A infeção crónica pode não ter consequências em alguns cães e pode até ter alguns benefícios com efeito protetor em animais que vivem em zonas endémicas (Brandão et al., 2003). Babesia canis causa doença moderada a grave, a parasitémia é geralmente baixa e não está diretamente associada à gravidade da doença (Uilenberg et al., 1989). Os principais sinais clínicos incluem febre, anorexia, letargia e desidratação e a maioria dos animais apresenta trombocitopenia moderada a grave, hiperfibrinogenemia e anemia não regenerativa normocítica normocrómica moderada a grave, hemólise e neutropenia (Tabela 6). A hemoglobinúria foi descrita em infeções naturais por B. canis (Bourdeau e Guelfi, 1995; Solano-Gallego et al., 2008). Num outro estudo foi observada azotémia e hiperestenúria em 37% de casos de infeção por B. canis, sugerindo azotemia pré-renal provavelmente devida à hipovolémia (Solano-Gallego et al., 2008). Embora as seroprevalências de B. canis variem entre 20-30%, até 85% em zonas endémicas em França (Bourdeau e Guelfi, 1995; Wlosniewski et al., 1997), a doença clínica é muito menor (14%) e a mortalidade atinge os 1,5% (Martinod et al., 1986). Esta variação pode ser interpretada pela presença de outros fatores como coinfecções, respostas inflamatórias específicas dos hospedeiros vertebrados, e talvez diferentes protocolos de tratamento. É uma doença típica de cães jovens adultos com habitat no exterior, que vivem nas aldeias, incluindo cães de caça e cães de gado (Bourdoiseau, 2006). A babesiose por B. canis ocorre predominantemente entre o Outono e a Primavera, época favorável ao seu vetor, D. reticulatus (Bordoiseau, 2006; Cardoso et al., 2010; Solano-Gallego et al., 2008), que também coincide com a época de caça (Cacciò et al., 2002). A babesiose por B. vogeli normalmente é subclínica e causa doença leve a moderada (Carret et al., 1999; Uilenberg et al., 1989) em animais adultos, que frequentemente é diagnosticada como coinfecção ou afeta cães esplenectomizados. Em cachorros de 3-4 meses B. vogeli pode causar anemia hemolítica grave, sendo por vezes fatal (Solano-Gallego e Baneth, 2011). As principais caraterísticas clínicas desta doença estão descritas na Tabela 6. 14

24 Tabela 6. Principais sinais clínicos e alterações laboratoriais na infeção pelas várias espécies de Babesia no cão (adaptado de: Solano- Gallego e Baneth, 2011). Espécie Dados clínicos Sinais clínicos Alterações clinicopatológicas B. canis Adultos jovens com Febre, letargia, Trombocitopenia, habitat no exterior, cães anorexia, icterícia anemia normocítica de gado e de caça normocrómica não regenerativa leve a moderada, anemia regenerativa não frequente, neutropenia, pigmentúria, bilirrubinemia, B. vogeli Cachorros e adultos com infeções e doenças concomitantes Febre, letargia, anorexia, icterícia B. rossi Jovens e adultos Não complicada Febre, letargia, anorexia, mucosas pálidas, esplenomegalia bilirrubinúria (hemólise) Anemia hemolítica regenerativa imunomediada, anemia não regenerativa, leucocitose, leucopenia, trombocitopenia Anemia leve a moderada, trombocitopenia, leucocitose, pigmentúria, bilirrubinemia, bilirrubinúria Prognóstico Favorável Favorável Favorável Babesia sp. Esplenectomizados e imunocomprometidos B. gibsoni Frequente em cães de luta (Pit Bull Terrier e Tosa Inu) B.conradae B. microtilike Cães no Sul da Califórnia Adultos jovens com habitat no exterior, cães de guarda e de caça Complicada Insuficiência renal aguda (anúria), icterícia, hipotensão, síndrome do stress respiratório agudo (ARDS), vómito, diarreia, pancreatite, mialgia, rabdomiólise, ascite, edema pulmonar, lesões cerebrais e renais, choque Febre, letargia, anorexia Febre, letargia, mucosas pálidas, icterícia, linfoadenomegalia, esplenomegalia, perda de peso Letargia, mucosas pálidas, vómito, linfoadenomegalia Fraqueza, febre, letargia, pigmentúria, taquicardia, taquipneia Alterações metabólicas e de ácido-base (acidose metabólica e alcalose respiratória), azotemia, coagulopatias, CID, anemia hemolítica imunomediada, hipoglicemia e hiperlactemia Anemia não regenerativa moderada e trombocitopenia Anemia hemolítica regenerativa, anemia imunomediada, trombocitopenia, pigmentúria, bilirrubinémia, bilirrubinúria Anemia hemolítica imunomediada não regenerativa, trombocitopenia Anemia regenerativa moderada a grave, trombocitopenia, azotemia, proteinúria Reservado a desfavorável Favorável Reservado Reservado a desfavorável Reservado a desfavorável 15

25 Babesia rossi é considerada a mais virulenta de entre os piroplasmas grandes que afetam o cão e é mais prevalente no Verão (Jacobson, 2006; Reyers et al., 1998). Os cães infetados por B. rossi que apresentem anemia leve a moderada, sem evidência de falha orgânica têm melhor prognóstico do que se houver compromisso vascular com grave anemia e hemoconcentração com MODS. A taxa de mortalidade de babesiose canina por B. rossi complicada é por volta dos 15% (Jacobson, 2006). A nova espécie de piroplasma grande Babesia sp. (ainda sem nome específico) geneticamente relacionada com a B. bigemina (93,9%) na Carolina do Norte, foi primeiramente descrita num cão tratado com quimioterapia para um linfoma (Birkenheuer et al., 2004b). Recentemente foram também diagnosticados mais sete cães em situações de imunossupressão, como quimioterapia para tratamento de neoplasias e esplenectomia (Sikorski et al., 2010). As características laboratoriais e clínicas estão descritas na Tabela 6. Dentro do grupo dos piroplamas pequenos a infeção crónica é frequente na babesiose por B. gibsoni, caracterizada por perda de peso e fraqueza. B. conradae parece ser mais virulenta que B. gibsoni, e é caracterizada por alta parasitémia, anemia grave e letalidade elevada (Conrad et al., 1991; Kjemtrup et al., 2006) A presença de anemia grave e azotemia é característico na infeção por B. microti-like. Um estudo recente descreve 58 cães infetados em que 36% estavam azotémicos no momento do diagnóstico, sendo considerado, para este piroplasma, a presença de azotemia um fator de risco e também um critério de prognóstico (Camacho et al., 2004). Quanto aos piroplasmas pequenos, Theileria sp., diagnosticado molecularmente, as alterações clinicopatológicas encontradas incluem anemia, esplenomegalia e trombocitopenia, mas o seu significado clínico ainda é pouco esclarecedor (Matjila et al., 2008). 1.6 DIAGNÓSTICO A suspeita clínica de babesiose deve estar presente sempre que um cão é apresentado com sinais clínicos caracterizados por letargia, febre, pigmentúria, bem como, valores analíticos de anemia ou trombocitopenia (Irwin, 2010). Os dados recolhidos da anamnese são importantes como: época do ano e presença de carraças (Cardoso et al., 2010), viagens para zonas endémicas e lesões de mordedura de outro cão (Birkenheuer et al., 2005). 16

26 A microscopia ótica continua a ser o teste diagnóstico mais utilizado, tendo uma sensibilidade elevada na fase aguda da infeção, na deteção dos piroplasmas intraeritrocitários nos esfregaços sanguíneos corados (Figura 4 e 5), no entanto a sensibilidade pode ser baixa em casos de baixa parasitémia. A diferenciação entre piroplasmas grandes e pequenos é também relativamente fácil. O diagnóstico por microscopia é a primeira e, muitas vezes, a única opção em países em vias de desenvolvimento onde a babesiose canina é endémica (Irwin, 2009). Na babesiose canina por piroplasmas grandes é maior a possibilidade de encontrar parasitas em amostras de sangue periférico (pavilhão auricular, unha), ou no exame das células do buffy coat de um hematócrito, do que numa amostra de sangue de uma veia central (Bohm et al., 2006). O diagnóstico de piroplasmose em cães com infeção crónica ou portadores assintomáticos continua a ser um desafio devido á baixa, e muitas vezes intermitente parasitémia, sendo difícil a observação dos piroplasmas por microscopia (Solano-Gallego e Baneth, 2011). A visualização morfológica dos piroplasmas no esfregaço sanguíneo é suficiente para o diagnóstico, mas não determina a espécie de Babesia, sendo necessário recorrer a uma análise molecular (Irwin, 2009). A combinação de testes serológicos e reação em cadeia da polimerase ( polymerase chain reaction PCR) continuam a ser os testes diagnósticos mais sensíveis. A serologia pode detetar infeções persistentes recentes ou mais antigas. O teste de imunofluorescência indireta ( indirect fluorescente antibody test IFAT) é o mais utilizado no diagnóstico de babesiose canina (Taboada et al., 1992), embora ocorram reações cruzadas entre as diferentes espécies de Babesia e outros protozoários (Vercammen et al., 1995). O ensaio imunoenzimático ( enzyme-linked immunoorbent assay - ELISA) tem sido usado principalmente em estudos epidemiológicos (Schetters et al., 1996). O diagnóstico por PCR é um teste frequentemente usado no diagnóstico de babesiose canina, e é especialmente importante na deteção de infeções com baixa parasitémia e na determinação das espécies de piroplasmas (Solano-Gallego e Baneth, 2011). 17

27 Figura 4. Piroplasmas grandes (esfregaço sangue periférico, coloração diff-quick, ampliação 1000x, fonte: própria) Figura 5. Piroplasmas grandes (esfregaço sangue periférico, coloração diff-quick, ampliação 1000x, fonte: própria) 1.7 TRATAMENTO O maneio adequado de um cão com piroplasmose envolve tanto um tratamento etiológico específico como uma terapia de suporte. O tratamento de suporte tem o objetivo de restaurar a oxigenação dos tecidos, corrigindo a anemia, a desidratação e as alterações eletrolíticas (Irwin, 2010). Este maneio clínico inclui a administração de fluidos endovenosos, transfusões sanguíneas e o uso de antiinflamatórios (Ayoob et al., 2010). A decisão de realizar uma transfusão sanguínea depende do grau de anemia. No caso de babesiose canina devem ser também considerados outros fatores, nomeadamente os sinais clínicos agudos, o grau de regeneração da anemia e as complicações respiratórias ou cardíacas. Cães com valores de hematócrito igual ou menor que 15% são candidatos a transfusão sanguínea (Lobetti, 2006). 18

28 Na Tabela 7 estão descritos os vários protocolos terapêuticos para os diferentes agentes etiológicos da babesiose canina. Os cães infetados com as formas grandes de Babesia spp. são normalmente tratados com o dipropionato de imidocarb, apresentando respostas clínicas favoráveis, enquanto que as formas pequenas são mais resistentes aos fármacos convencionais, havendo uma resposta menos eficaz à terapêutica (Solano-Gallego e Baneth, 2011). Os efeitos adversos são normalmente locais que incluem dor na administração, mas também é frequente manifestarem-se sistemicamente por náuseas e vómitos nos 15 minutos seguintes e possíveis sinais de cólicas, diarreia e ptialismo (Bourdoiseau, 2006). O uso de atropina numa dose de 0,04 mg/kg 10 minutos antes da administração de dipropionato de imidocarb pode prevenir estes efeitos colinérgicos adversos (Dantas-Torres e Figueiredo, 2006). O aceturato de diminazeno, usado no tratamento de infeções por piroplasmas grandes e pequenos, tem uma margem de segurança reduzida, com respostas terapêuticas muito variáveis individualmente, pelo que o seu uso deve ser cuidadoso (Miller et al., 2005). A procura de um protocolo eficaz no tratamento das formas pequenas de Babesia spp. tem sido notavelmente morosa, a cura parasitológica e clínica é muitas vezes difícil de alcançar e são frequentes as recaídas. O uso de clindamicina (25 mg/kg, BID, PO) reduziu a parasitémia numa infeção experimental, mas não conseguiu eliminar o parasita, tendo sido observados piroplasmas 108 dias depois do início da infeção (Wulansari et al., 2003). Outros protocolos alternativos para B. gibsoni incluem a combinação de atovaquona (medicamento anti-malária) e um macrólido, a azitromicina (Birkenheuer et al., 2004a). Foram ainda avaliados outros protocolos, nomeadamente o uso de artsunato (Goo et al., 2010) e epoxomicina (Aboulaila et al., 2010), para o tratamento mais eficaz de infeções por piroplasmas pequenos. Estudos in vitro de numerosos extratos de plantas da floresta tropical com propriedades anti-babesia têm sido publicados (Subeki et al., 2004, 2005a, 2005b). Outros estudos demonstraram que certas estruturas (péptidos) da carraça Haemahysalis longicornis diminuíam a parasitémia de B. microti em ratinhos e eliminavam B. gibsoni diretamente na carraça (Tsuji et al., 2007). 19

29 Tabela 7. Protocolos de tratamento de babesiose canina (adaptado de: Solano- Gallego e Baneth, 2011). Espécie Princípio ativo Protocolo tratamento Resposta ao tratamento B. canis B. vogeli B. rossi Dipropionato de imidocarb 5-6,6 mg/kg IM, SC; podese repetir em 14 dias 3-5 mg/kg dose única Boa Aceturato de diminazeno Babesia spp B. gibsoni Dipropionato de imidocarb 5-6,6 mg/kg IM, SC; podese repetir em 14 dias Boa B. gibsoni Azitromicina + atovaquona Clindamicina B. conradae Dipropionato de imidocarb Aceturato de diminazeno B. microti-like Dipropionato de imidocarb 10 mg/kg PO, SID + 13,3 mg/kg PO TID durante 10 dias mg/kg PO, BID durante 7-10 dias 5-6,6 mg/kg IM, SC; podese repetir em 14 dias 3-5 mg/kg dose única 5-6,6 mg/kg IM, SC; podese repetir em 14 dias Melhoria ou resolução dos sinais clínicos sem eliminação do parasita e com recaídas ocasionais a frequentes Moderada a má com recaídas frequentes Má 1.8 PREVENÇÃO A prevenção de babesiose canina, como em todas as doenças transmitidas por carraças, passa essencialmente por eliminar a possibilidade da exposição ao vetor, com o uso de antiparasitários externos efetivos, em formulações spot-on, sprays ou coleiras. Em zonas endémicas pode ser difícil de concretizar, independentemente das melhores estratégias de desparasitação externa (Irwin, 2009). Alguns medicamentos têm sido investigados pelo seu efeito profilático na babesiose canina, especialmente em zonas endémicas, como é o caso do uso do diproprionato de imidocarb em dose única de 6 mg/kg, que pode evitar desenvolvimento clínico de babesiose 20

30 por B. canis até 8 semanas (Uilenberg et al., 1981), e a doxiciclina 5 mg/kg PO, SID que se pensa diminuir a gravidade dos sinais clínicos da babesiose por B. canis (Vercammen et al., 1996). Embora a imunidade celular esteja relacionada com a resistência à infeção por Babesia, a imunidade natural é o resultado da ação de mecanismos de imunidade humoral. Este facto facilitou o desenvolvimento de uma vacina (Schetters, 2005). Existem 2 vacinas comercializadas em alguns países da Europa. Uma das vacinas contém apenas antigenes de B. canis enquanto a outra é bivalente, contendo antigenes de B. canis (estirpe Europeia) e B. rossi (estirpe Sul Africana). Ambas vacinas induzem uma proteção parcial contra a babesiose por B. canis através da diminuição da gravidade dos sinais clínicos, grau de parasitémia ou duração da doença clínica. A vacina bivalente protege ainda contra a B. rossi (Schetters et al., 2009b). Esta imunidade é evidente 3 semanas após a dose de reforço e dura cerca de 6 meses (Schetters et al., 2006). Outros estudos têm avaliado a eficácia de vários tipos de vacinas (antigene recombinante e ADN) contra a B. gibsoni (Fukumoto et al., 2009). Outra medida importante é recomendar o despiste de Babesia sp. em cães dadores de sangue (Wardrop et al., 2005). 21

31 2. MATERIAIS E MÉTODOS Entre abril de 2008 e maio de 2012 foram apresentados à Clínica Veterinária Dr. Duarte - VetSantiago, em Bragança, 110 cães com sinais clínicos suspeitos de hemoparasitismo, ou seja, letargia, anorexia, mucosas pálidas (Figura 6) ou mucosas ictéricas (Figura 7), hipertermia, urinas escuras (Figura 10) e presença de carraças (Figura 8). Pertenciam a diferentes raças, eram de ambos os sexos, tinham idades compreendidas entre 6 meses e 12 anos e todos tinham acesso ao exterior, segundo os seus proprietários. Estes cães vinham do concelho de Bragança, Vinhais, Macedo, Valpaços e Miranda do Douro, e nenhum deles se tinha ausentado de Portugal. Depois de registado a resenha de cada animal (proprietário, local de residência, raça, idade, sexo), presença de carraças, registo de outras doenças anteriores ou concomitantes Estes foram submetidos a um exame físico, em que foram registados os diferentes sinais clínicos (cor das mucosas, cor da urina, temperatura e outros) como também dados laboratoriais (hematócrito, hemoglutinação). Figura 6. Mucosas anémicas (fonte: própria) Figura 7. Mucosas ictéricas (fonte: própria) As amostras de sangue periférico foram retiradas do pavilhão auricular e preparado um esfregaço sanguíneo, corado por Diffvet (May Grünwald Giemsa modificado) e posteriormente observado em microscópio ótico (ampliação x1000), onde foram identificadas estruturas intraeritrocitárias compatível com piroplasmas grandes do género Babesia (Figura 9). O valor estimativo do hematócrito foi, na maior parte dos animais, obtido pela observação direta no tubo de sangue. Em alguns animais foi efetuada o teste de hemoglutinação, colocando uma gota de sangue numa lâmina e adicionada uma gota de soro fisiológico observando ou não a formação de grumos (Figura 11). 22

32 Algumas amostras de sangue venoso, conservadas em papel de filtro, foram submetidas a análises molecular num centro de investigação fora do país seguindo os procedimentos detalhadamente descritos em Cardoso et al, Todos os animais foram medicados com uma ou duas doses (separadas de 15 dias) de diproprionato de imidocarb (Imizol ) a 4-5 mg/kg por via subcutânea. Os casos de anemia grave e/ou imunomediada, foram medicados com prednisolona por via endovenosa e posteriormente por via oral, sendo que, nos casos mais graves foram internados e sujeitos a fluidoterapia. Os casos clínicos de suspeita, ou confirmação, por observação direta de mórulas no esfregaço sanguíneo ou por serologia por imunomigração rápida (Witness Ehrlichia) de coinfecção por Ehrlichia canis, foram também medicados com doxiciclina, numa dose de 10 mg/kg SID PO, durante dias. Figura 8. Presença de carraças (fonte: própria) Figura 9. Babesia sp. (piroplasmas grandes) (esfregaço sangue periférico, coloração diff-quick, ampliação 1000x, fonte: própria) Figura 10. Urinas escuras (fonte: própria) Figura 11. Hemoaglutinação (fonte: própria) 23

33 3. RESULTADOS De entre 110 cães suspeitos de hemoparasitose que foram apresentados à consulta, 84 foram diagnosticados com babesiose, por observação de piroplasmas grandes em esfregaço de sangue periférico. Nos esfregaços sanguíneos foi possível observar várias formas de merozoítos eritrocitários (Figuras 12, 13, 14, 15), como também fora dos eritrócitos após a sua lise (Figura 16), e possíveis formas de trofozoítos (Figura 17), bem como pré-gametócitos (Figura 18). Também verificou-se a presença de um maior número de monócitos (Figura 19), bem como imagens de fagocitose (Figura 20). As figuras apresentadas são de esfregaços sanguíneos periféricos, com coloração diff-quick e ampliação de 1000x. Figura 12. Merozoítos Figura 13. Merozoítos Figura 14. Merozoítos Figura 15. Merozoítos Figura 16. Merozoítos livres Figura 17. Trofozoítos 24

34 Figura 18. Pré-gametócito Figura 19. Monocitose Figura 20. Fagocitose Destes 84 cães, 46 (45%) eram machos e 38 (55%) eram fêmeas. Dos 84 cães com babesiose, 44 (52,4%) tinham menos de 3 anos de idade. A maior parte dos cães (52,4%) eram de raça Podengo Português (Figura 21), 10 (11,9%) eram de raça indeterminada, e os restantes 30 eram distribuídos por mais 19 raças definidas. Aproximadamente 70% (57/84) dos cães tinham aptidão para a caça (Tabela 8). Figura 21. Podengo Português (fonte: própria) 25

35 Tabela 8. Raças dos cães com babesiose (n = 84). (*) Raças com aptidão de caça Raças Podengo Português Médio * 44 Cruzado 10 Epagneul breton * 3 Cão de Gado Transmontano 3 Pointer * 3 Husky Siberiano 2 Pastor Alemão 2 Caniche 2 Setter Inglês * 2 Perdigueiro Português * 2 Fauve Bretanha * 1 Basset Artesien * 1 Serra de Aires 1 Golden Retriver 1 Pincher 1 Labrador Retriever 1 Griffon * 1 Pequinois 1 Castro Laboreiro 1 Yorshire Terrier 1 Boxer 1 A distribuição ao longo dos meses do ano foi a seguinte: janeiro (n = 4), março (n = 12), abril (n = 11), maio (n = 11), junho (n = 1), setembro (n = 1), outubro (n = 14), novembro (n= 18), dezembro (n = 12), conforme descrito no Gráfico 1. Nos meses de fevereiro, julho e agosto não foram registados casos clínicos de babesiose canina. O Gráfico 2 compara a distribuição dos casos clínicos ao longo dos meses, nos diferentes anos. 26

36 Gráfico 1. Distribuição dos casos de babesiose canina ao longo dos meses do ano (Abril de 2008 a Maio de 2012). Gráfico 2. Distribuição dos casos de babesiose canina ao longo dos meses dos anos de 2008 a Os cães diagnosticados com babesiose provinham de vários locais: 83 do distrito de Bragança (59 do conselho de Bragança, 22 de Vinhais, 1 de Macedo de Cavaleiros e 1 de Miranda do Douro) e finalmente um cão do concelho de Valpaços, pertencente ao distrito de Vila Real. A Tabela 9 descreve a proveniência dos cães com babesiose a partir de diferentes freguesias dos concelhos de Bragança e de Vinhais. 27