Sinalização no desenvolvimento de membros. 17/04/2018 Nathalie Cella

Transcrição

1 Sinalização no desenvolvimento de membros 17/04/2018 Nathalie Cella

2 O que são genes HOX/Homeobox/Homeóticos?

3 1. São fatores de transcrição com um domínio ligante a DNA (domínio homeobox ou homeótico) 2. O domínio homeobox tem cerca de 60 aminoácidos Propriedades das Proteínas Homeóticas

4 3. A ordem dos genes homeóticos no cromossomo corresponde à ordem temporal e espacial em que são expressos -> colinearidade

5 Hox existe em mamíferos e suas propriedades e importância no desenvolvimento são conservadas

6 HIPÓTESE: Os genes homeobox/homeóticos definem os segmentos corporais

7 Anterior Posterior Normal Ubx Ubx Ubx Ubx Deleção para Ubx

8 HIPÓTESE: Os genes homeobox/homeóticos definem os segmentos corporais RESULTADO: A mutação/ inativação de Ultrabithorax (ubx) extende o limite posterior do segmento torácico, OU regride o limite anterior do segmento abdominal

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10 Mini-revisão de anatomia

11 braço coxa antebraço canela mão pé

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13 Hox especifica o mesênquima que se tornará estilopódio, zeugopódio e autopódio Hox 9 e 10 especificam estilopódio Hox 11 especifica zeugopódio Hox 12 e 13 especificam autopódio (Hox 12 especifica o punho) Hox 10 especifica estilopódio Hox 11 especifica zeugopódio Hox 12 e 13 especificam autopódio

14 camundongo knockout do Hox11 não desenvolve zeugopódio (ulna e rádio) Mutação em Hox 13

15 O que determina onde o broto do membro se formará? Genes Hox determinam o eixo antero-posterior, a segmentação do corpo e a região onde os apêndices (por exemplo, membros) se formarão extremamente conservados

16 Eixo dos membros

17 O membro se desenvolve a partir do mesoderma. Como sabemos disso? Remoção de grupo de células Transplante Marcação de células com corantes ou isótopos radioativos

18 Qualquer pedaço do campo do membro pode dar origem a um membro completo Campo do membro

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20 Os brotos do membro surgem devido a proliferação do mesoderma subjacente: Placa lateral esqueleto somitos músculo

21 Formação do broto do membro (limb bud)

22 O que determina onde o broto do membro se formará?

23 Indução do broto do membro membro ectópico FGF10 COMO a expressão de FGF10 É restrita à essa região? Células expressando FGF10 foram transplantadas no flanco de um embrião de galinha

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25 O que determina que um par de membros seja Superior/Anterior? Inferior/Posterior?

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27 Tbx5 Em camundongos a especificação dos membros anteriores e posteriores não é dada por Tbx4 e Tbx5. Pitx1 especifica membro posterior Tbx4

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29 O que determina o padrão de expressão de Tbx5 e Tbx4?

30 Hoxd9 = Tbx5 Hoxd9+ Hoxc9+ Hoxb9 = Tbx4

31 Resumindo..

32 Padronização A-P (Wnt, BMP, Ac. Retinoico etc)? Hox?? FGF10 no mesoderma FGF8 no ectoderma Crescimento Tbx5/4 Definição do membro sup e inf + Hox10 (Jain et al, Development 2018)

33 Início do broto!

34 FGF10 é responsável pela indução da crista ectodérmica apical FGF10 Wnt3a FGF8 Célula da placa lateral FGF10 secreção de FGF8 Expressão de FGF8 Célula da crista ectodérmica apical

35 Indução da crista ectodérmica apical (AER) AER de embrião de galinha Apical ectodermal ridge Mantém o mesênquima subjacente proliferando Expressa fatores que especificam o eixo antero-posterior (A-P) e dorsoventral (D-V)

36 Expressão de FGF8 na AER O FGF8 secretado pela AER mantém o mesênquima abaixo dele em um estado indiferenciado e proliferativo zona de progressão (PZ)

37 Centros sinalizadores do broto do membro PZ = progress zone = zona de progressão AER apical ectodermal ridge = crista ectodérmica apical PZ ZPA = zone of polarizing activity = zona de polarização

38 Interação recíproca entre a cristal ectodérmica apical e o mesênquima subjacente

39 Em resumo.. O mesênquima induz e sustenta a formação do AER (através de FGF10) O mesênquima determina que tipo de membro se formará (anterior ou posterior) AER (através de FGF8) mantém o mesênquima da zona de progressão proliferando, promovendo o crescimento do membro no eixo proximal-distal

40 Determinação dos eixos

41 Transplantes recíprocos para determinar se o mesênquima (PZ) ou a crista ectodérmica apical (AER) determinam o eixo proximal-distal

42 TROCA DE AER MEMBROS NORMAIS AER não controla esse eixo

43 TROCA DE PZ

44 O mesênquima da PZ especifica o eixo proximal-distal Duplicação das estruturas do membro Mecanismo ainda MUITO discutido Há 3 modelos tempo, espaço e periodicidade parecem controlar esse processo Dígitos partindo do húmero

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46 Hox também interage

47 Determinação dos eixos

48 Antes do broto ser reconhecível na superfície do embrião, o mesênquima já está especificado. Se esse mesênquima for transplantado no flanco de um animal, um membro se formará com o eixo-anteroposterior do animal doador

49 ZPA zona de polarização zona de progressão ZPA = zone of polarizing activity = zona de polarização Região da mesoderme na face posterior ZPA é responsável pela polaridade do eixo antero-posterior

50 dígitos duplicados como um espelho dos dígitos normais

51 Sonic hedgehog (Shh) é o responsável pela especificação do eixo antero-posterior

52 substituição de 1 base no enhancer de shh

53 Mutação semelhante causa polidactilia em humanos

54 Quem é responsável pela expressão de Shh na ZPA? HOX

55 ELCR = early limb control region dhand Shh dhand knockout não desenvolve membros dhand knockout não expressa Shh na ZPA Charité et al, Development 2000

56 Feedback positivo entre a crista ectodérmica apical e a zona de polarização:

57 Especificando a identidade dos dígitos shh novamente dedão Célula progenitor do dígito 4 Célula progenitora do dígito 5 dedinho shh knockout têm dígitos todos iguais

58 A membrana interdigital especifica a identidade do dígito anterior a ela Quando a membrana entre o digito 2 e 3 foi retirada, o digito 2 se transformou em 1. O mesmo ocorreu qdo foi retirado a membrana entre o 3 e 4.

59 BMP expresso nas membranas interdigitais especifica os dígitos Bead contendo noggin, inibidor de BMP Deleção de shh e Gli3 gera membro com vários dígitos sem especificação

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61 Determinação dos eixos

62 Expressão de wnt7a na ectoderme especifica o eixo dorso-ventral normal vp = ventral pads vt = ventral tendons Wnt7a-deficient vp = ventral pads vt = ventral tendons dp = dorsal pad dt = dorsal tendons

63 FGF10 AER FGF8 Gremlin FGF10 BMP AER FGF8 Gremlin FGF10 BMP AER FGF8 ZPA ZPA TÉRMINO DA EXTENSÃO DO MEMBRO FGF8 = colapso do AER SEM AER = colapso do ZPA O eixo dorso-ventral também participa, pois animais deficientes para Wnt7a não desenvolvem dígitos posteriores, indicando que Wnt7a também é importante na determinação do eixo antero-posterior

64 Coordenação dos 3 eixos Início: FGF10 FGF8 Depois: Shh ativa Gremlin, que inibe BMP Com o crescimento do membro, gremlin não alcança mais o ectoderma; consequentemente, BMP passa a inibir a expressão de FGF8 no ectoderma Sem FGF8, a AER colapsa (apoptose) Sem a retroalimentação do AER, a ZPA não se sustenta (apoptose)

65 Esculpindo o autopódio Fator responsável pela morte celular Nas membranas interdigitais? BMPs

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