18/09/ De onde as células vêm? PARA ONDE vão? 2. O que estas células PODEM ser?

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1 Setembro Outubro Data Tópico/Objetivo 18 Gastrulação 20 Discussão periódicos 25 Eixo DV 27 Discussão periódicos 2 Neurulação; Definição do campo neural 4 Discussão periódicos 9 Desenvolvimento do Membro Não haverá aula 18 Discussão periódicos 23 Genes Hox 25 Discussão periódicos 30 Prova escrita Nota: (apresentação x 1 +participação em discussão x1 + prova escrita x 2)/4 A= 8-10 B=6-8 C=5-6 Evaluating a paper A thorough understanding and evaluation of a paper involves answering several questions: a. What questions does the paper address? b. What are the main conclusions of the paper? c. What evidence supports those conclusions? d. Do the data actually support the conclusions? e. What is the quality of the evidence? f. Why are the conclusions important? Type of research Descriptive Comparative Analytical Question asked: What is there? What do we see? How does it compare to other organisms? Are our findings general? How does it work? What is the mechanism? 1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão? 2. O que estas células PODEM ser? 3. QUANDO elas decidem o que vão ser? 4. COMO ocorre esta decisão? 5. Como é determinada a MORFOLOGIA tecidual? 1

2 Descrição Expressão Cirurgia Descrição Expressão Cirurgia Embriologia Clássica Mapa do Destino Imunohistoquímica Hibridização in situ RT-PCR SUPERexpressão Cultura Transplantação Ablação SUBexpressão RNA antisenso RNAi Knockout ou mutação Como seguir uma célula entre várias? 1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão? 2. O que estas células PODEM ser? 3. QUANDO elas decidem o que vão ser? 4. COMO ocorre esta decisão? 5. Como é determinada a MORFOLOGIA tecidual? A injeção de corante flourescente permite acompanhar o destino celular A injeção de corante flourescente permite acompanhar o destino celular Gilbert 8th Edition Gilbert 8th Edition 2

3 Mapa do destino = Fate Map Injeção de Corante Fluorescente Injeção de corante fluorescente (Dale e Slack, 1987;Lane e Sheets, 2000) Hibridação in situ RT-PCR= Reverse-Transcriptase PCR Conversão de RNA em cdna (DNA complementar) Descrição Expressão Cirurgia Embriologia Clássica Mapa do Destino Imunohistoquímica Hibridização in situ RT-PCR Cultura Transplantação Ablação SUPERexpressão SUBexpressão RNA antisenso RNAi Knockout ou mutação 3

4 uper Expressão Gênica!!!! Microinjeção de RNA Eletroporação Infecção Transgênese Microinjeção de RNA Eletroporação Transgênicos por integração no prónucleo RNA antisenso inibe a tradução Descrição Expressão Cirurgia DNA Embriologia Clássica Mapa do Destino Imunohistoquímica Hibridização in situ RT-PCR SUPERexpressão Cultura Transplantação Ablação RNA mensageiro RNA antisenso SUBexpressão RNA antisenso RNAi Knockout ou mutação Inibição da Tradução 4

5 RNAi 1. RNA dupla fita (dsrna) reconhecido pelo complexo enzimático DICER Knockout 1) Transfecção Linhagem da massa celular interna 2. Clivagem do dsrna em sirna (silencing RNA) 3. sirna utilizado como molde pelo complexo RISC para reconhecimetdo do RNA-alvo a ser clivado Ao final de várias mitoses, distinguem-se duas populações de células: Massa Celular Interna Trofoblasto Knockout : 2) Recombinação O Knockout, ao contrário da transgênese, requer recombinação Massa Celular Interna Embrião Propriamente Dito Porção Embrionária da Placenta Blastocele Trofoblasto Porção Embrionária da Placenta Zona Pelúcida Knockout : 3) Seleção Knockout : 4) Barriga de aluguel G418 Neomicina 5

6 Knockout : 5) Quimeras Transgênese: 6) Cruzamento Descrição Expressão Cirurgia Embriologia Clássica Mapa do Destino Imunohistoquímica Hibridização in situ RT-PCR SUPERexpressão SUBexpressão RNA antisenso RNAi Knockout ou mutação Cultura Transplantação Ablação 1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão? 2. O que estas células PODEM ser? 3. QUANDO elas decidem o que vão ser? 4. COMO ocorre esta decisão? 5. Como é determinada a MORFOLOGIA tecidual? Transplantação: troca de microambiente/mudança de contexto O transplante de vesícula óptica para o ectoderma do tronco em anfíbios gera cristalino ectópicos. O ectoderma do tronco tem potencial de formar cristalino. doador aceptor 6

7 Os genes A,B e C contribuem para o desenvolvimento de vísceras: Sua relação pode ser resumida como: A B - C - formação de vísceras 2) Expressão de A irá a) estimular formação de vísceras b) inibir formação de vísceras Você quer fazer um camudongo knockout. O gene normal tem 2 exons e um intron, como demonstrado abaixo. Qual das construções abaixo seria o ideal para fazer o knockout? TK= gene da timidina quinase (necessário para o processo de seleção) neor= gene de resistência a neomicina (necessário para o processo de seleção) 3) Num animal mutante defeituoso para o gene B (não expressa), o embrião irá a) carecer de vísceras b) desenvolver excesso de vísceras 4) Num animal com ganho de função de B, o mutante irá a) carecer de vísceras b) desenvolver excesso de vísceras 5) Num animal com perda de função de C, o mutante irá a) carecer de vísceras b) desenvolver excesso de vísceras Os genes A,B e C contribuem para o desenvolvimento de vísceras: Sua relação pode ser resumida como: A B - C - formação de vísceras 2) Expressão de A irá a) estimular formação de vísceras b) inibir formação de vísceras 3) Num animal mutante defeituoso para o gene B (não expressa), o embrião irá a) carecer de vísceras b) desenvolver excesso de vísceras 4) Num animal com ganho de função de B, o mutante irá a) carecer de vísceras b) desenvolver excesso de vísceras 5) Num animal com perda de função de C, o mutante irá a) carecer de vísceras b) desenvolver excesso de vísceras Você quer fazer um camudongo knockout. O gene normal tem 2 exons e um intron, como demonstrado abaixo. Qual das construções abaixo seria o ideal para fazer o knockout? TK= gene da timidina quinase (necessário para o processo de seleção) neor= gene de resistência a neomicina (necessário para o processo de seleção) It is not birth, marriage or death, but gastrulation, which is truly the most important time in your life Lewis Wolpert (1986) O evento mais importante da sua vida não é o seu nascimento, seu casamento, sequer a sua morte. É a Gastrulação. (e o aprendizado sobre este) 7

8 GASTRULAÇÃO CLIVAGEM EM VERTEBRADOS Definição dos Folhetos Embrionários: Ectoderma, Mesoderma, Endoderma Requer um rearranjo celular extenso : MOVIMENTOS MORFOGENÉTICOS Requer sinalização inter e intracelular GRADIENTES MORFOGENÉTICOS Holoblástico Radial (ANFÍBIOS) Meroblástico Discoidal (RÉPTEIS, PEIXES, AVES) Holoblástico Rotacional (MAMÍFEROS) * ventral dorsal 8

9 Formação de células-garrafa Invaginação do lábio do blastóporo DORSAL Invaginação do lábio do blastóporo ventral Deslocamento da Blastocele Formação to Tampão Vitelínico e do Arquêntero O lábio do blastóporo é formado por células-garrafa Mudança de FORMA CELULAR O Arquêntero é formado pela fenda entre as células que involuem e as células vitelínicas Ectoderma Mesoderma Endoderma Fig

10 Formação do EPI e HIPOblasto Início da linha primitiva a partir da Zona Marginal Posterior Gastrulação: Formação do Ectoderma, Mesoderma e Endoderma a partir do Epiblasto e Hipoblasto Stern et al. A mesoderma se dá por DELAMINAÇÃO de células do Epiblasto no nó de Hensen e na linha primitiva As células que ingressam pela linha primitiva têm dois destinos: Espaço entre Epi e Hipoblasto Deslocam e substituem o Hipoblasto secundário, formando o endoderma definitivo 10

11 As células do Epiblasto que migram Para o espaço do meio : Mesoderma Para a camada hipoblástica: Endoderma As células do Hipoblasto são deslocadas lateralmente para formarem a VESÌCULA VITELÌNICA As células do futuro mesoderma preenchem o espaço entre o EPI e HIPOblasto EXCETO na Membrana Bucofaríngea Membrana Cloacal * * * * * Posterior Região mais anterior da linha Região mais posterior da linha Anterior Yang, X., D. Dormann, A. E. Münsterberg and C. J. Weijer Dev. Cell 3:

12 As células da região mais anterior da linha primitiva formam o endoderma anterior e o mesoderma pré-cordal As células da região mediana da linha primitiva formam a notocorda, e estruturas mesodérmicas laterais As células da região mediana da linha primitiva formam a notocorda, e estruturas mesodérmicas laterais As células do EPIBLASTO que migraram formam o Mesoderma na blastocele Endoderma quando se inserem no Hipoblasto As que permanecem na superfície formam a Ectoderma O blastocisto de mamífero contêm MASSA CELULAR INTERNA que formará o embrião propriamente dito e o TROFOECTODE RMA, que formará os anexos embrionários 12

13 created by Annie Poon in collaboration with Mary Madabhushi Movimentos Morfogenéticos : a força motriz da gastrulação O QUE DEFINE AS CÉLULAS DO ORGANIZADOR? 13

14 O que direciona a migração celular? Como que termina a gastrulação? Café... Cabou!! Café