Indução neural: determinação do eixo inicial/definição do domínio neural

Transcrição

1 Indução neural: determinação do eixo inicial/definição do domínio neural Marilene Hohmuth Lopes 1. Indução da formação da PLACA NEURAL pelo Mesoderma (Mudança na forma celular, expressão de marcadores gênicos) 1. Associação da Placa Neural com a Notocorda subjacente; constrição apical nas células da borda da Placa Neural 1. Dobramento da Placa Neural 1. A convergência do Tubo Neural é uma combinação de fatores: Pressão lateral e constrição nos pontos de dobradiça e extensão convergente 1. Fusão do Tubo Neural na porção dorsal concomitante com a Migração da Crista Neural 1

2 Prêmio Nobel em 1935 O QUE INDUZ A FORMAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO? Resultados: 1. Gerou dois eixos embrionários= DUPLICAÇÃO AXIAL 1. O segundo embrião é composto de células doadoras E aceptoras. Conclusão: O Lábio dorsal do blastóporo tem capacidade INDUTIVA Propriedades do : 1. Inicia Gastrulação 2. Participa do Mesoderma Dorsal 3. Induz formação de tecido Nervoso a partir do Ectoderma O ORGANIZADOR 2

3 (A origem das células do blastóporo dorsal () A fertilização em anfíbios é seguida pela ROTAÇÃO CORTICAL, que forma o CRESCENTE CINZA 3

4 O da blástula deriva do crescente cinza (estágio 1 blastômero) 1 Spemann, 1938 Porque neste experimento a situação (A) gerou dois embriões? a) Porque dividiu o ovo pela metade b) Foi um resultado aleatório c) Porque dividiu o crescente cinza. d) Porque dividiu o. Crescente cinza 1 Spemann, 1938 Porque neste experimento a situação (A) gerou dois embriões? a) Porque dividiu o ovo pela metade b) Foi um resultado aleatório c) Porque dividiu o crescente cinza. d) Porque dividiu o. Propriedades do : 1. Inicia Gastrulação 2. Participa do Mesoderma Dorsal 3. Induz formação de tecido Nervoso a partir do Ectoderma 4

5 2 2 No experimento de Spemman, que tipo de molécula deve ser a responsável pela indução do novo eixo embrionário? No experimento de Spemman, que tipo de molécula deve ser a responsável pela indução do novo eixo embrionário? a)fator de transcrição (proteína nuclear) b)receptor de membrana c)ligante de membrana d)proteína extracelular secretada a)fator de transcrição (proteína nuclear) b)receptor de membrana c)ligante de membrana d)proteína extracelular secretada Spemann, O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal? 1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação? Pergunta: O ovo recémfertilizado tem sua potencialidade distribuída simetricamente? 5

6 1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal? Sem Crescente cinza não há região dorsal ENTÃO, qual o elemento ativo no crescente cinza? 1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação? Rotação cortical Crescente Cinza Recémfertilizado Mesoblástula Transcrição zigótica Gástrula Um gene candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades: Um gene candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades: 1. Expressão na região dorsal 1. Capaz de causar duplicação axial 3. Ser de origem materna A TRANSCRIÇÃO no embrião de Xenopus só ocorre NA BLÁSTULA Os fatores indutivos do estão presentes ANTES da blástula 1. Expressão na região dorsal 1. Capaz de causar duplicação axial 1. Capaz de compensar pelo efeito do UV 1. Ser de origem materna 6

7 Quantidades crescentes de Ultravioleta alteram o desenvolvimento embrionário U.V. O tratamento com UV inibe a rotação cortical, altera a localização de Dsh, que passa de dorsal para homogêneo U.V. Dorsal Ventral Dorsal Ventral Dishevelled Western Blot para Dsh Membros da Família Wnt Via de sinalização Wnt Obs.: Wnt=Wingless +int Heasman, J. Development 124, (1997) 7

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9 O Dsh, assim como o Wnt, causa duplicação axial controle Injetados com XDsh Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades: Candidato: Wnt/Dsh 1. Expressão na região dorsal 1. Capaz de causar duplicação axial 1. Ser de origem materna Sokol et al.,development 121: (1995) O Dsh normalmente se encontra concentrado na região dorsal de blástulas Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades: Candidato: Wnt/Dsh Dorsal Ventral 1. Expressão na região dorsal 1. Capaz de causar duplicação axial 1. Ser de origem materna Western Blot para Dsh 9

10 O Dsh normalmente se encontra concentrado na região dorsal de blástulas Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades: Dorsal Ventral Antes da Transcrição zigótica Candidato: Wnt/Dsh 1. Expressão na região dorsal 1. Capaz de causar duplicação axial 1. Ser de origem materna Western Blot para Dsh O embrião de Xenopus expressa beta-catenina desde cedo ventral dorsal 10

11 Um gene/sinal candidato a dorsalizador endógeno deve ter a seguintes propriedades: Localização da beta-catenina na blástula de Xenopus Candidato: VIA DO Wnt (beta-catenina) 1. Expressão na região dorsal 1. Capaz de causar duplicação axial 1. Ser de origem materna ventral dorsal Schohl and Fagotto Development 129, (2002) Um gene/sinal candidato a dorsalizador endógeno deve ter a seguintes propriedades: Candidato: VIA DO Wnt (beta-catenina) 1. Expressão na região dorsal Development 1992 Mar;114(3): Organization and regulation of cortical microtubules during the first cell cycle of Xenopus eggs. Schroeder MM, Gard DL 1. Capaz de causar duplicação axial 1. Ser de origem materna O centríolo do esperma organiza a polimerização dos microtúbulos que resultam na rotação cortical 11

12 Slide 37 da Profa Nathalie: A rotação cortical desloca elementos citoplasmáticos especificamente para o crescente cinza 1. Fertilização 1. Polimerização polarizada dos microtúbulos pelo aster espermático 1. Rotação cortical 1. Concentração de Dsh na região vegetal-dorsal 1. Inibição de GSK-3 na região vegetal-dorsal 1. Atividade da betacatenina na região vegetal-dorsal Região Ventral Região Dorsal 12

13 Spemann, O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal? Acúmulo de beta catenina nuclear. 1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação? Pergunta: O ovo recémfertilizado tem sua potencialidade distribuída simetricamente? Este pedaço é só endoderma! A região DORSAL da blástula deriva do crescente cinza (estágio 1 blastômero) 3 No experimento acima, ocorreu uma duplicação na blástula aceptora e uma duplicação do início da gastrulação. O que aconteceria com a gastrulação se fosse removido o crescente cinza de um embrião antes da primeira divisão celular? a)nada, porque o embrião se regenera. b)nada, porque o início da gastrulação é determinado pelo c)ausência de gastrulação porque o crescente cinza dá origem ao d)ausência de gastrulação porque faltariam células. Crescente cinza 13

14 3 No experimento acima, ocorreu uma duplicação do na blástula aceptoar e uma duplicação do início da gastrulação. O que aconteceria com a gastrulação se fosse removido o crescente cinza de um embrião antes da primeira divisão celular? a)nada, porque o embrião se regenera. b)nada, porque o início da gastrulação é determinado pelo c)ausência de gastrulação porque o crescente cinza dá origem ao d)ausência de gastrulação porque faltariam células. 1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal? Acúmulo de beta catenina nuclear. 1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação? Sem Crescente Cinza não há e não há gastrulação. 1. Mas beta-catenina é uma proteína nuclear, e o efeito do depende de uma proteína secretada Rotação cortical Recémfertilizado Mesoblástula Gástrula Crescente Cinza 14

15 Rotação cortical Crescente Cinza Gástrula Dsh no pólo vegetal Rotação cortical Dsh no crescente cinza Recémfertilizado Mesoblástula Recémfertilizado Mesoblástula Transcrição zigótica Gástrula? Neural Dsh no pólo vegetal Rotação cortical Dsh no crescente cinza Recémfertilizado Mesoblástula Transcrição zigótica Gástrula COMO É FORMADO O ORGANIZADOR? 2. Transcrição zigótica do que? 15

16 Propriedades do : O de Spemann fica no MESODERMA DORSAL 1. Inicia Gastrulação 2. Participa do Mesoderma Dorsal 3. Induz formação de tecido Nervoso a partir do Ectoderma Crescente cinza de Spemann Após a gastrulação, as células do irão formar a notocorda QUAL É A RELAÇÃO ENTRE O CRESCENTE CINZA, BETA-CATENINA E O MESODERMA DORSAL???!! 16

17 Como é formado o MESODERMA? Nieuwkoop, anos 70 O pólo vegetal SECRETA elementos que induzem o mesoderma mesmo antes da transcrição zigótica. Hipótese: Existem fatores no pólo vegetal que induzem o Mesoderma Um fator candidato a indutor endógeno do MESODERMA deve ter a seguintes propriedades:? Um fator candidato a indutor endógeno do MESODERMA deve ter a seguintes propriedades: 1. Capaz de induzir MESODERMA 1. Expresso no pólo vegetal 1. Ser de origem materna 17

18 Hipótese: Existem fatores SECRETADOS do pólo vegetal que induzem o Mesoderma Como é formado o MESODERMA DORSAL? Mas, VegT é uma proteína nuclear... VegT 4 Dale and Slack, Dale and Slack, 1987 Neste experimento, conjugaram blastômeros do pólo vegetal (amarelo )em posições variadas em relação ao pólo dorsal (variando de 1 a 4) e calcularam a percentagem de sucesso em induzir genes dorsais no ectoderma (em azul) Neste experimento, conjugaram blastômeros do pólo vegetal (amarelo )em posições variadas em relação ao pólo dorsal (variando de 1 a 4) e calcularam a percentagem de sucesso em induzir genes dorsais no ectoderma (em azul) a) Não há diferença entre o poder de indução de 1 a 4 porque todos induziram genes dorsais b) Os blastõmeros 1 e 4 têm um índice maior porque estão nas pontas c) O blastômero 1 teve um índice mais alto porque é maior d) O blastômero 1 teve índice mais alto porque tem o citoplasma do crescente cinza a) Não há diferença entre o poder de indução de 1 a 4 porque todos induziram genes dorsais b) Os blastômeros 1 e 4 têm um índice maior porque estão nas pontas c) O blastômero 1 teve um índice mais alto porque é maior d) O blastômero 1 teve índice mais alto porque tem o citoplasma do crescente cinza 18

19 Dale and Slack, 1987 Blastômero dorsal do pólo vegetal é capaz de induzir mesoderma DORSAL no ectoderma Hipótese: Existem fatores no pólo vegetal que induzem o Mesoderma Dorsal/ NASCE O CENTRO DE NIEUWKOOP! 5 Dale and Slack, 1987 Neste experimento, que tipo de molécula o blastômero vegetal produz para exercer seu efeito no ectoderma sobrejacente? 5 Dale and Slack, 1987 Neste experimento, que tipo de molécula o blastômero vegetal produz para exercer seu efeito no ectoderma sobrejacente? a) Fator de transcrição (proteína nuclear) b) Receptor de membrana c) Ligante de membrana d) Proteína extracelular secretada a) Fator de transcrição (proteína nuclear) b) Receptor de membrana c) Ligante de membrana d) Proteína extracelular secretada 19

20 Hipótese: Existem fatores SECRETADOS do polo vegetal DORSAL que induzem o Mesoderma DORSAL QUAL É A RELAÇÃO ENTRE VegT Que elemento materno está na região dorsal? O CRESCENTE CINZA, BETA-CATENINA E O MESODERMA DORSAL???!! O Centro de Nieuwkoop é formado pela sobreposição de VegT e Beta-catenina (VegT) 20

21 Mas VegT e beta-catenina são fatores de transcrição!!! E são maternais (= antes da transcrição zigótica!) β-catenina VegT e outros TGF-betas Mesoderma Dorsal Mesoderma Ventral O que é secretado pelo Centro de Nieuwkoop para formar o? E agora????!!!! β-catenina VegT e outros TGF-betas Nieuwkoop?? Mesoderma Dorsal (Org) Mesoderma Ventral 21

22 A presença SIMULTÂNEA dos fatores de transcrição betacatenina e VegT inicia a transcrição zigótica de genes que codificam proteínas secretadas VegT Beta-Catenina Nieuwkoop? 1. Ativado por VegT 2. Ativado por beta-cat 3. Induz 4. ZIGÓTICO!! β-catenina Nieuwkoop? Mesoderma Dorsal (Org) VegT? Mesoderma Ventral Genes do O centro de Nieuwkooop no pólo vegetal, secreta Nodal, que induz a formação do no mesoderma Xnrs são expressos zigóticamente VegT Beta-Catenina Xnr-1/ Nodal Nieuwkoop 1. Zigótico 2. Ativado por VegT 3. Ativado por beta-cat 4. Induz Transc. Zigótica 1. Zigótico 2. Ativado por VegT 3. Ativado por beta-cat 4. Induz Genes do 22

23 Propriedades do : Dsh no pólo vegetal VegT no pólo vegetal Rotação cortical Dsh no crescente cinza Recémfertilizado Mesoblástula Transcrição zigótica Nodal (produzido pelo C. Nieuwkoop) Gástrula Neural 1. Inicia Gastrulação 2. Participa do Mesoderma Dorsal 3. Induz formação de tecido Nervoso a partir do Ectoderma por proteínas secretadas Dsh no pólo vegetal VegT no pólo vegetal Rotação cortical Dsh no crescente cinza Recémfertilizado Mesoblástula Transcrição zigótica Nodal Gástrula? Neural O que é que o lábio do blastóporo dorsal secreta que pode induzir diferenciação neural no ectoderma? 23

24 VIA DE SINALIZAÇÂO DE BMP Existem proteínas extracelulares que são inibidores de BMP e atuam evitando a ligação de BMP com o seu Receptor O lábio do blastóporo dorsal produz inibidores de BMP como Chordin, Noggin e Follistatin. CHORDIN NOGGIN 24

25 Superexpressão de inibidores de BMP induzem um segundo eixo neural. O que é que o lábio do blastóporo dorsal secreta que pode induzir diferenciação neural no ectoderma? Inibidores de BMP Development October 15, 2003 vol. 130 no SE inibição do BMP induz destino neural ENTÃO BMP induz destino epidermal BMP BMP Neural Epidermal Neural Epidermal 25

26 6 Como provar que BMP4 comanda a decisão de epiderme e placa neural a partir do ectoderma? 6 Como provar que BMP4 comanda a decisão de epiderme e placa neural a partir do ectoderma? a) Aumentar a quantidade de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido epitelial. b) Reduzir a quantidade de inibidor de BMP4.Espera-se que tenha mais tecido neural c) Reduzir o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural d) Aumentar o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural a) Aumentar a quantidade de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido epitelial. b) Reduzir a quantidade de inibidor de BMP4.Espera-se que tenha mais tecido neural c) Reduzir o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural d) Aumentar o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural Remoção da via de sinalização de BMP>> neural mrna para receptor dominante negativo de BMP (pg) Normal Duplicação 0 88% % 27% 200 7% 76% Suzuki et al Proc Natl Acad Sci U S A Oct 25;91(22):

27 O potencial de cada célula é indefinido Fator Morfogenético: A posição de cada célula em relação a fonte de morfógeno é interpretada em programas de diferenciação distintos Tem efeitos diferentes em doses-diferentes Ou seja: Gera um gradiente de resposta a partir da origem do fator Gradiente morfogenético BMC Developmental Biology :22 O ectoderma exposto a altos níveis de BMP = Epitélio Epitélio Neural O ectoderma exposto a baixos níveis de BMP = Neural Epitélio Neural BMP4 BMP4 27

28 SE BMP induz epidermal ENTÃO ausência de sinal deve favorecer a diferenciação neural BMP Neural Epidermal Epidermal Neural ENTÃO ausência de qualquer sinal favorece NEURAL Redução da densidade de células tronco aumenta a expressão de genes neuraisof neural markers. Evidence for the default neural state Modelo de diferenciação neural por default Neural markers Epidermal Neural Pluriipotency Tropepe, V. et al., Neuron, 30(1), pp

29 Ausência de qq sinal.. Dsh no pólo vegetal VegT no pólo vegetal Rotação cortical Dsh no crescente cinza Recémfertilizado Mesoblástula Transcrição zigótica Nodal Gástrula Neural Inibidor de BMP Neural Modelo de diferenciação neural por default E em outros modelos, é parecido? Próxima aula 29