UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

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1 UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ROBERTA CARICATTO BERNARDO PINTO Avaliação da capacidade regenerativa de fragmentos de duas espécies de planárias límnicas em hipergravidade São José dos Campos, SP 2013

2 Roberta Caricatto Bernardo Pinto Avaliação da capacidade regenerativa de fragmentos de duas espécies de planárias límnicas em hipergravidade Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas Orientadora: Profª Drª Nádia Maria Rodrigues de Campos Velho São José dos Campos SP 2013

3 Ficha catalográfica

4 ROBERTA CARICATTO BERNARDO PINTO AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE REGENERATIVA DE FRAGMENTOS DE DUAS ESPÉCIES DE PLANÁRIAS LÍMNICAS EM HIPERGRAVIDADE. Dissertação de Mestrado apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas, do Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora: Presidente: Profª Drª Cristina Pacheco Soares (UNIVAP) Orientador: Profª Drª Nádia Maria Rodrigues de Campos Velho (UNIVAP) Membro interno: Profª Drª Flávia Villaça Moraes (UNIVAP) Membro externo: Prof. Dr. Luiz Alberto Vieira Dias (ITA) Suplente: Prof. Dr. Newton Soares (UNIVAP) Profª Drª Sandra Maria Fonseca da Costa Diretora do IP&D-UNIVAP São José dos Campos, 21 de novembro de 2013.

5 AGRADECIMENTOS Agradeço a minha orientadora Drª Nádia de Campos Velho pela dedicação e paciência durante todo esse período. Agradeço aos meus pais Fátima e Milton, e ao meu marido Rafael por toda a compreensão, paciência e disposição em me ajudar em tudo para a conclusão dessa etapa. Aos meus irmãos Fernando e Lígia que estiveram sempre do meu lado e dispostos a ajudar. Agradeço a professora Me. Karla por ser a primeira pessoa a me apoiar e incentivar nesse projeto. As estagiárias do Borboletário que de alguma forma também me ajudaram. A professora Drª Cristina Pacheco Soares por ceder o Laboratório de Biologia Celular e Tecidual para desenvolvimento de parte do experimento. Ao professor Dr. Newton Soares por me ajudar com os procedimentos do Microscópio Eletrônico de Varredura. A técnica de laboratório Priscila Leite pelo auxilio com a fotodocumentação através do Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV. A todas as pessoas que de alguma forma colaboraram com o desenvolvimento desse trabalho. Muito obrigada!

6 RESUMO As planárias têm sido utilizadas como modelo experimental clássico para estudos de regeneração, devido a sua elevada capacidade regenerativa. Girardia tigrina (Girard, 1850) está amplamente distribuída na América do Sul, sendo usualmente utilizada em estudos de diferentes áreas da biologia. A gravidade é um efeito permanente na superfície do planeta e a ausência ou a condição de baixa gravidade provoca alterações nos organismos. O presente trabalho objetivou analisar quais alterações podem ocorrer durante o processo regenerativo em fragmentos de planárias límnicas em condições de hipergravidade. Os fragmentos de G. tigrina e Planaria sp. foram submetidas à simulação de hipergravidade de 3.3xG em centrífuga durante nove dias com temperatura a 15 C ± 1ºC. Posteriormente foram selecionados fragmentos anteriores, medianos e posteriores, e realizada a técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Após esse período, os exemplares foram mensurados por cinco semanas. A comparação do crescimento médio dos fragmentos anteriores, medianos e posteriores dos grupos experimental e controle de Planaria sp. indicou que o crescimento dos fragmentos medianos do grupo experimental foi maior na quinta semana em relação as demais semanas (ANOVA F(3.16)=13,66 p=0,000). O crescimento médio dos fragmentos anteriores, medianos e posteriores dos grupos experimental e controle de G. tigrina indicou que o crescimento do fragmento mediano do grupo experimental foi maior na quinta semana em relação as demais semanas (ANOVA F(3.16)=16,88 p=0,000). Para o crescimento médio dos fragmentos anteriores dos grupos experimental de Planaria sp. e G. tigrina indicaram que o crescimento foi maior na quarta semana em relação as demais semanas (ANOVA, F(3.16)=16,88 p=0,513). A comparação do crescimento médio dos fragmentos medianos dos grupos experimental de Planaria sp. e G. tigrina indicaram que o crescimento foi maior na quinta semana (ANOVA F(1,8)= 4,71 p=0,062). Para os fragmentos posteriores dos grupos experimental de ambas espécies o crescimento médio indicou que houve diferença significativa no crescimento entre os fragmentos (ANOVA, F(1,8)= 5,65; p=0,043). A análise dos fragmentos com microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelou que nos fragmentos dos grupos experimental de G. tigrina e Planaria sp. houve regeneração.. A facilidade de manutenção em laboratório e a capacidade regenerativa por longos períodos fazem destes organismos ótimos modelos para utilização em experimentos de média e longa duração em condições adversas. Palavra-chave: Planárias. Regeneração. Hipergravidade.

7 ABSTRACT Planarians have been used as experimental model to study regeneration due to their high regeneration capacity. Girardia tigrina (Girard, 1850) is widely distributed in South America and is commonly used in studies of different areas of biology, such as genetics, molecular biology, and environmental impacts. Gravity is a permanent effect on the planet s surface, and the absence of gravity or low gravitational condition cause changes in organisms. This study aimed to analyze what changes may occur during the regenerative process in fragments of liminic planarians in hypergravity conditions, and if there are changes, what is the influence of hypergravity on different biological aspects. Fragments of G. tigrina and Planaria sp. were subjected to simulated hypergravity the 3.3x G in a centrifuge for nine days with a temperature of 15 C ± 1 C. The fragments of the control group were maintained under the same conditions as the experimental group. Subsequently, anterior, middle, and posterior fragments were selected, and the technique of scanning electron microscopy (SEM) was applied, after the specimens were measured for five weeks. Comparing the average growth of the anterior, middle and posterior fragments of the experimental and control groups of Planaria sp. indicated that the growth of middle fragments in the experimental group was higher in the fifth week versus the other weeks (ANOVA, F (3.16) = 13.66, p = 0.000). A comparative analysis of average growth of the anterior, middle, and posterior fragments of the experimental and control groups of G. tigrina indicated that the growth of the middle fragment of the experimental group was higher in the fifth week versus the other weeks (ANOVA, F (3.16) = 16.88, p = 0.000). The comparison of the average growth of anterior fragments of experimental groups of Planaria sp. and G. tigrina indicated that growth was higher in the fourth week compared to other weeks (ANOVA, F (3.16) = 16.88, p = 0.513). Comparing the average growth of middle fragments of experimental groups of Planaria sp. and G. tigrina indicated that growth was greater in the fifth week (ANOVA, F (1.8) = 4.71, p = 0.062). For posterior fragments for experimental groups of both species, the average growth was significantly different between the fragments (ANOVA, F (1.8) = 5.65, p = 0.043). The fragment analysis with scanning electron microscopy (SEM) showed that wound healing occurred in the fragments from the experimental groups G. tigrina. Planaria sp. showed regions of the cuts still in the healing process and early wound closure. The species G. tigrina and Planaria sp. demonstrated differences in the layout of cells during the regeneration process. The ease of maintaining Planarians in the laboratory and their regenerative capacity for long periods make these organisms excellent models to use in medium and long-term experiments in adverse conditions. Keyword: Planarians. Regeneration. Hypergravity.

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Vista dorsal de um exemplar de Girardia tigrina (Girard, 1850)...14 Figura 2: Esquema de secção em planárias. As regiões escuras são tecidos pré-existente e as regiões brancas são tecidos recentemente produzidos durante a regeneração (a-h). As linhas contínuas indicam amputações. As letras minúsculas indicam locais específico de amputações. Os números indicam regiões do corpo entre planos de amputação que se tornarão fragmentos...16 Figura 3: Regeneração de fragmentos de planárias: a) Fragmento anterior regenerando a região posterior de G. tigrina; b) Fragmento posterior regenerando a região anterior de G. tigrina Figura 4 e 5:Vista parcial da área de coleta das planárias Girardia tigrina no município de Jacareí SP e detalhe das macrófitas (Pistia stratiotes), local de fixação (raízes) dos espécime...29 Figura 6 e 7: Vista parcial do ranário Toca do Lobo, local de coleta no município de São José dos Campos, SP e vista dorsal de um exemplar de Planaria sp...30 Figura 8: Recipientes de acondicionamento das macrófitas no local de coleta...31 Figura 9: Seleção e acondicionamento dos exemplares: (a) recipiente para triagem dos animais, (b) e (c) recipientes para manutenção dos exemplares no laboratório...31 Figura 10: Exemplar de G. tigrina com destaque para as regiões seccionadas: (A) fragmento anterior; (B) fragmento mediano e (C) fragmento posterior...33 Figura 11: Vista frontal da centrífuga refrigerada, modelo C3i/CR3i, utilizada no experimento, para avaliação do processo regenerativo dos fragmentos em simulação (hipergravidade)...34 Figura 12: Valores de média e desvio padrão de crescimento (semanas) dos fragmentos anteriores, medianos e posteriores entre o grupo experimental e controle por semana (1 a 5) em espécime de Planaria sp...37 Figura 13: Valores de média e desvio padrão de crescimento (semanas) dos fragmentos anteriores, medianos e posteriores entre o grupo experimental e controle por semana (1 a 5) em espécime de Girardia tigrina...38 Figura 14: Valores de média e desvio padrão de crescimento (semanas) dos fragmentos anteriores entre os grupos experimental por semana (1 a 5) em Planaria sp. e G. tigrina...39 Figura 15: Valores de média e desvio padrão de crescimento (semanas) dos fragmentos medianos entre os grupos experimental por semana (1 a 5) em espécimes de Planaria sp. e G. tigrina...40 Figura 16: Valores de média e desvio padrão de crescimento (semanas) dos fragmentos posteriores entre os grupos experimental por semana (1 a 5) em Planaria sp. e G. tigrina...41 Figura 17: Fragmentos de G. tigrina para o grupo experimental. (A) fragmento mediano, (A1) detalhe da região anterior do fragmento mediano, (A2) detalhe da região posterior do fragmento mediano, (B) detalhe da região do corte do fragmento anterior e (C) detalhe da região do corte do fragmento posterior. As setas em (B e C) indicam o local da ferida e migração celular...42

9 Figura 18: Fragmentos de G. tigrina do grupo controle. (A) fragmento mediano, (A1) região anterior do fragmento mediano e (A2) região posterior do fragmento mediano...43 Figura 19: Fragmentos de Planaria sp. do grupo experimental. (A) região anterior do fragmento mediano, (A1) detalhe da região anterior do fragmento mediano, (B) região posterior do fragmento mediano, (B1) detalhe da região posterior do fragmento mediano, (C) fragmento anterior, (D) fragmento posterior, a seta indica região da ferida do fragmento mediano, (D) região posterior do fragmento mediano, (C e D) as setas indicam a região do corte...44 Figura 20: Fragmentos de Planaria sp. do grupo controle. (A) região anterior do fragmento mediano, (A1) detalhe da região anterior do fragmento mediano, (B) região posterior do fragmento mediano (B1) detalhe da região posterior do fragmento median, (C) fragmento anterior e (D) fragmento posterior...45 Figura 21: Fragmentos medianos de G. tigrina do grupo experimental e controle. (A) fragmento mediano do grupo controle, (B) detalhe da faringe do grupo controle, (C) fragmento mediano do grupo experimental e (D) detalhe da faringe do grupo experimental...46

10 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL ASPECTOS MORFOLÓGICOS E ANATÔMICOS Aspectos morfológicos Aspectos anatômicos GIRARDIA TIGRINA (GIRARD, 1850) REGENERAÇÃO Regeneração em planárias BIOLOGIA ESPACIAL E REGENERAÇÃO EM AMBIENTES DE HIPERGRAVIDADE AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA ATRAVÉS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA JUSTIFICATIVA OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAL E MÉTODOS SELEÇÃO DOS ESPÉCIMES PARA ANÁLISE DE FRAGMENTOS SUBMETIDOS A HIPERGRAVIDADE (SIMULAÇÃO EM CENTRÍFUGA) TRIAGEM DAS MACRÓFITAS, SELEÇÃO E ACONDICIONAMENTO DOS ESPÉCIMES CONDIÇÕES DE LABORATÓRIO Fotoperíodo e Temperatura Água de manutenção e alimentação SELEÇÃO DOS EXEMPLARES PARA EXPOSIÇÃO A HIPERGRAVIDADE ANÁLISE ESTATÍSTICA ANÁLISE ATRAVÉS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) RESULTADOS CRESCIMENTO DOS FRAGMENTOS QUANDO SUBMETIDOS A SIMULAÇÃO EM HIPERGRAVIDADE ANÁLISE EM MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXO A - ANÁLISE ESTATÍSTICA... 60

11 11 1 INTRODUÇÃO GERAL Os membros da ordem Tricladida, classe Turbellaria, filo Platyelminthes são em sua maioria Paludicola e com poucas espécies Terrícolas (SLUYS, 1989). As planárias, objeto deste estudo pertencem à família Dugesiidae e ao gênero Girardia com ocorrência na América do Sul (VRIES; SLUYS, 2009). As infraordens são classificadas de acordo com seus ambientes: a) Maricola, eminentemente em águas marinhas costeiras; b) Cavernicola, água doce em ambientes de cavernas; c) Paludicola, tipicamente de ambientes abertos de água doce, e Terricola, no meio terrestre úmido (CARBAYO; FROEHLICH, 2008). Em geral animais muito pequenos, tendo a maioria de um a poucos milímetros, com exceção de dois grupos, um marinho e outro terrestre, que apresentam comprimento da ordem de centímetros, com formas que podem atingir meio metro ou mais. Apresentam simetria bilateral, acelomados, possuem epiderme ciliada e tubo digestório com fundo cego, desprovido de ânus (FROEHLICH; CARBAYO, 2011). As planárias apresentam características na mesoderme, sistema nervoso central (SNC) e sistema excretor que podem ter servido de ponte para a evolução de tecidos complexos e altamente organizados (NEWMARK; ALVARADO, 2002) e (ALVARADO; NEWMARK, 1999). São hermafroditas, e alimentam-se de pequenos invertebrados e larvas de insetos, detritívoros e servem de alimento a invertebrados e vertebrados predadores; portanto, ocupam diversos níveis na cadeia alimentar (KNAKIEVCZ, 2007). As planárias são muito conhecidas por sua capacidade regenerativa e a partir de pequenos fragmentos, tem a capacidade de remodelar continuamente o tamanho e a forma do seu corpo. Ambas as características são dependentes da presença de células adultas pluripotentes estaminais chamados neoblastos e por isso estão sendo utilizadas como modelo experimental clássico para estudos de regeneração, considerando a presença de células-tronco totipotentes, capazes de se diferenciar em qualquer tecido do próprio corpo (GARCIA et al., 2006; SALÓ; AGATA, 2012).

12 ASPECTOS MORFOLÓGICOS E ANATÔMICOS Aspectos morfológicos A taxonomia das planárias baseia-se em uma combinação de características anatômicas, morfológicas e histológicas que são normalmente encontradas na epiderme, mesênquima, musculatura, faringe e órgãos copuladores (VARA; LEAL- ZANCHET, 2008), sendo de grande importância os estudos detalhados da histologia e histoquímica para interpretação correta da fisiologia dos órgãos desses invertebrados (SOUZA; LEAL-ZANCHET, 2004). O corpo de uma planária é revestido pela epiderme e esta é constituída por uma camada única de células cúbicas que repousam sobre uma membrana basal. As células epidérmicas são ciliadas, observando-se maior desenvolvimento destas na parte ventral do corpo (MARCONDES, 1994). Ao longo do corpo das planárias existem células-tronco totipotentes com pequeno diâmetro (5-10μm) e forma ovalada, apresentam núcleo bem extenso e um estreito citoplasma, estas células são conhecidas como neoblastos (BRAZ et al., 2008). As planárias exibem três aspectos importantes, ou seja, a ocorrência de simetria bilateral; a evolução de uma terceira camada celular, isto é, o parênquima, situado entre a epiderme e o revestimento intestinal, a gastroderme e o achatamento dorsoventral do corpo. A simetria bilateral está relacionada à motilidade do animal, enquanto o achatamento é considerado como uma consequência inevitável da ausência dos sistemas circulatório e respiratório (ARAÚJO; BOSSOLAN, 2006). Estudos realizados por Durán; Amaya; Romero (2010) demonstram que o início da expressão e padronização de mecanismos moleculares ocorre durante o desenvolvimento embrionário, similar aos mecanismos de regeneração exibidos em planárias adultas. Os autores sugerem que a extrema capacidade regenerativa exibida em planárias é baseada na conservação da organização genética de células totipotentes necessárias durante o desenvolvimento embrionário desses animais. Kreshchenko et al (2008) demonstraram que o efeito do neuropeptídeo F (NPF) estimula a atividade mitótica de neoblastos e também estimula o controle regenerativo, crescimento do sistema nervoso e sistema muscular, postulando que o NPF tem uma ação morfogenética em animais que se regeneram.

13 13 Braz (2008) constatou em estudos utilizando planárias irradiadas com laser, que a exposição à irradiação pode influenciar na proliferação e morfologia celular decorrentes de mecanismos físico-químicos. Lopes; Campos-Velho e Munin (2009) verificaram que a exposição de fragmentos de planárias regenerantes a laser de baixa potência, auxilia na organização de tecidos de reparação, sendo essa organização de melhor arquitetura na região posterior a faringe do que na região anterior, devido à presença de ocelos fotorreceptores na região anterior Aspectos anatômicos As planárias apresentam eixos antero-posterior (AP) e dorso-ventral (DV) bem distintos, onde pode-se perceber ao longo do eixo AP a região cefálica anterior contendo o gânglio cerebral e, geralmente, um par de ocelos; a região central com uma faringe e uma abertura de boca ventral, e a região posterior da cauda (ADELL; CEBRIÁ; SALÓ, 2010). O sistema nervoso é organizado em gânglios cefálicos ligados a dois cordões nervosos ventrais longitudinais, possuem estruturas sensoriais, tais como fotorreceptores e quimiorreceptores (REDDIEN; ALVARADO, 2004). Um nervo submuscular corre por baixo da musculatura da parede do corpo e se conecta aos nervos principais. A parede do abdômen contém musculatura longitudinal, diagonal que são utilizadas para a locomoção, além de serem utilizadas para ultrapassar obstáculos. As células epiteliais glandulares localizadas no lado ventral são ciliadas e realizam a locomoção, proteção, adesão ao substrato e captura de alimento (NEWMARK; ALVARADO, 2002). A boca está associada a uma faringe tubular musculosa e está localizada no centro da superfície ventral. O alimento é ingerido através da faringe muscular, que serve como boca e ânus do animal, a faringe se conecta a três ramificações do sistema digestório, que é composto por um ramo anterior e dois posteriores (ARAÚJO; BOSSOLAN, 2006). O elemento fundamental do sistema excretor é a célula flama ou solenócito e trata-se de uma célula com a forma de um tubo, em cujo interior há uma cavidade, com um grupo de flagelos, que drenam os resíduos metabólicos para os ductos excretores que são eliminados para o exterior através de poros dorsais (MARCONDES, 1994). Embora, sejam hermafroditas, realizam fecundação cruzada e

14 14 também podem utilizar a regeneração como forma de reprodução assexuada através de uma fissão transversal. O sistema reprodutor é constituído de ovários pares, situado atrás dos gânglios cefálicos, com inúmeros testículos localizados dorsolateralmente. Posterior à abertura da faringe está localizado o gonóporo, que se caracteriza por uma abertura na superfície ventral levando ao aparelho copulador (PREZA, 1995). 1.2 GIRARDIA TIGRINA (GIRARD, 1850) As planárias da espécie Girardia tigrina (Girard, 1850) (Figura 1), pertencem ao filo Platyhelminthes, classe Turbellaria, subordem Tricladida, infraordem Paludicola e família Dugesiidae (DOLCI-PALMA, 1995). G. tigrina vive em águas lênticas, presas às raízes de macrófitas Eichornia sp., ou sob pedras e tem uma distribuição cosmopolita (PREZA, 1995). G. tigrina é uma espécie amplamente distribuída na América do Sul, sendo comumente utilizada em estudos das mais diversas áreas da biologia, tais como genética, biologia molecular e em estudos de impacto ambiental (SILVA; FISCHER, 2006). Caracteriza-se por apresentar a epiderme pigmentada, cabeça triangular com dois ocelos, aurículas, aberturas dos poros faringeal e genital localizados na superfície ventral do animal. A reprodução pode ocorrer de forma sexuada ou assexuada (SANT ANA et al., 2007). Evolutivamente é o primeiro animal, a incorporar um sistema excretor, digestório e gânglios cerebróides, e uma grande concentração de células nervosas, capazes de coordenar movimentos e comportamentos simples (GARCIA et al., 2006). Figura 1: Vista dorsal de um exemplar de Girardia tigrina (Girard, 1850) Fonte: Acervo do autor (2010)

15 REGENERAÇÃO A regeneração é a organização tecidual com substituição de células mortas ou lesadas por células, novas idênticas as originais, promovendo a restituição da integridade anatômica e funcional do tecido (CORREA, 2000) (Figura 2). O processo regenerativo inicia-se com células-tronco e representa a restituição de tecidos a partir de precursores indiferenciados; entretanto, é interessante notar que a natureza resolveu o problema da regeneração de grandes secções do plano corporal com outra estratégia a desdiferenciação, processo pelo qual uma célula adulta, diferenciada, retorna ao seu estágio indiferenciado, para então induzir a sua diferenciação no tipo de célula esperado e reprogramação, onde células adultas são transformadas em célula-tronco, ainda não especializadas (SANTOS; ATHANAZIO, 2006). Muitos organismos, incluindo os humanos, podem regenerar alguns tecidos perdidos ou dilacerados por ferimentos ou doenças. O processo regenerativo envolve a substituição do tecido perdido, mantendo a estrutura e funcionalidade do original, essa é uma característica de muitos invertebrados (DURAN, 2009). A capacidade de regeneração pode ser muito extensa, em alguns animais, tais como planárias, que podem regenerar o seu corpo inteiro a partir de fragmentos de tecido pequenos (PERTESSEN; REDDIEN, 2008), assim como as hidras, que são capazes de regenerar completamente a região anterior após a amputação. Outros casos de regeneração são observadas em animais mais conhecidos, como salamandras ou insetos, que exibem propriedades de regeneração de membros importantes, como a cauda (VERVOORT, 2011).

16 16 Figura 2: Esquema de secção em planárias. As regiões escuras são tecidos pré-existente e as regiões brancas são tecidos recentemente produzidos durante a regeneração (a-h). As linhas contínuas indicam amputações. As letras minúsculas indicam locais específico de amputações. Os números indicam regiões do corpo entre planos de amputação que se tornarão fragmentos Fonte: Reddien e Alvarado (2004) Regeneração em planárias Os princípios de regeneração em planárias são explorados há mais de 100 anos por meio de manipulações cirúrgicas e observações celulares (REDDIEN; ALVARADO, 2004). O processo regenerativo nestes organismos é alvo de inúmeras pesquisas, não apenas por ser um modelo em estudos de biologia celular, mas também devido às anormalidades morfológicas que contribuem para estudos de etiologia e biologia do desenvolvimento (SILVA; FISCHER, 2006). As planárias apresentam uma grande capacidade de regeneração como, por exemplo, um pedaço cortado da região mediana de uma planária pode regenerar uma nova cabeça e uma nova região

17 17 posterior caudal (ALVARADO; NEWMARK, 1999). A regeneração em planárias envolve uma série de processos similares àqueles que ocorrem durante o desenvolvimento normal, tais como: após a lesão ocorre a proliferação de células indiferenciadas e a construção de um blastema; a formação de um padrão e a organização de células numa hierarquia espacial e a diferenciação e expressão do padrão (REDDIEN et al., 2005). Após a amputação, os neoblastos fecham a ferida e proliferam, dando origem ao blastema (ou cone de regeneração). Células presentes no blastema diferenciam-se e geram novamente os diversos tipos celulares do animal e durante a fase final do processo de regeneração, ocorre um ajustamento das estruturas formadas por meio da proliferação e diferenciação celulares (BORGES, 2006) (Figura 3). Essas complexas interações são controladas por um conjunto diversificado de sinais, incluindo vias moleculares, fluxos de íons, e sinais do sistema nervoso. Embora essencial para a regeneração, os mecanismos pelos quais estes sinais de integração, manutenção e restauração da geometria correta do animal ocorrem, ainda não são bem compreendidos (LOBO; BEANE; LEVIN, 2012). Os neoblastos são células que formam uma camada epitelial externa que abrange o tecido derivado do mesênquima. Essa estrutura representa uma interação entre o epitélio e o mesênquima (REDDIEN et al., 2005). Os organismos com simetria bilateral possuem a capacidade de regeneração, sugerindo que o estudo da formação do blastema, determinação e diferenciação em planárias poderia informar processos regenerativos em outros organismos (ALVARADO; TSONIS, 2006). É notável que, fragmentos de planárias cortados ao longo de seu eixo anteroposterior podem regenerar um verme inteiro, perfeitamente (ADELL; CEBRIÁ; SALÓ, 2010). De acordo com Saló; Baguna (1984), o índice mitótico é maior na região posterior do que na região da anterior em espécies de planárias G. tigrina. Em geral, planárias amputadas em qualquer nível ao longo do eixo anteroposterior pode regenerar a cabeça, porém, a taxa de regeneração da cabeça diminui posteriormente (ADELL; CEBRIÁ; SALÓ, 2010). Estudos realizados por Newmark; Alvarado (2000) mostram que há uma ausência de proliferação celular, na ponta distal anterior e posterior do animal, onde estes dois tecidos dependem de migração celular para manter sua integridade estrutural. Isto sugere que a proliferação e migração celular são processos que ocorrem normalmente na manutenção dos tecidos em

18 18 planárias intactas. Wenemoser; Reddien (2010) demonstraram que o início de regeneração em planárias envolve duas respostas distintas de células-tronco: uma resposta sistêmica precoce de qualquer lesão e uma resposta local que é exclusivamente causada pela ausência de tecido, indicando que separam-se os mecanismos de sinalização existentes na regeneração para distinguir entre lesões simples e perda de tecido. Gurley et al (2008) indicam que a proteína β -catenina é um objeto chave na especificação da polaridade em planárias, atuando como um interruptor molecular, direcionando o desenvolvimento da cabeça em espécimens adultos. Segundo Reddien et al (2005) sugerem que o gene SMEDWI-2 dentro dos neoblastos tenha a função de apoiar à geração de células que promovam a regeneração e a homeostase do tecido. Yermakova et al. (2009) verificaram que o hormônio melatonina inibe a regeneração da região anterior, suprimindo a atividade mitótica de neoblastos, fato que não ocorre na região posterior do animal, sugerindo que a melatonina tem um efeito seletivo e direciona a proliferação de neoblastos na região posterior após uma lesão. Figura 3: Regeneração de fragmentos de planárias: a) Fragmento anterior regenerando a região posterior de G. tigrina; b) Fragmento posterior regenerando a região anterior de G. tigrina. Fonte: Acervo do autor (2010)

19 BIOLOGIA ESPACIAL E REGENERAÇÃO EM AMBIENTES DE HIPERGRAVIDADE A Biologia espacial foi criada e desenvolvida na interface de várias ciências como a biologia geral, fisiologia, física, astronomia e geofísica, permitindo, assim entender problemas ligados a este campo. A gravidade é um efeito permanente na superfície do planeta e os sistemas biológicos estão adaptados para conviver sob este efeito e com isso, desempenhando um importante papel no desenvolvimento de vários organismos. O ambiente espacial exibe gravidade reduzida e radiações cósmicas e tem atraído atenção dos cientistas, uma vez que pode dar a resposta de como a vida evoluiu na Terra, tendo como objetivo das primeiras experiências de investigação espacial elucidar o efeito da microgravidade não só em células individuais, mas também em organismos intactos (TOY et al., 2012). A Biologia espacial explora como os organismos percebem e respondem a gravidade e como esta influencia a estrutura, o desenvolvimento, a função, a evolução e comportamento dos mesmos. Estudar a biologia espacial tem estimulado o interesse duradouro em astrobiologia, que aborda questões, como evolução da vida, existências de vida em outras partes do universo, e o futuro da vida na Terra e fora dela (DAYANANDAN, 2011). Pesquisadores começaram a utilizar o ambiente espacial como uma ferramenta para entender como a vida se adapta a mudanças extremas e como os organismos respondem aos perigos da radiação espacial. Durante os últimos 50 anos, têm-se identificado e esclarecido muitos dos efeitos dos vôos espaciais em sistemas vivos, em relação aos níveis celular e tecidual, embora ainda muitos dos mecanismos que os animais usam para detectar e reagir permanecem desconhecidos (TOMKO et al., 2010). A investigação na biologia espacial visa desvendar as questões básicas sobre a influência da gravidade no crescimento, morfologia e função das células no ambiente espacial (CLEMENT, 2006). Foi testado por Grigoryan et al. (2012) a hipótese de que a hipergravidade pode afetar a regeneração da córnea de Pleurodeles waltl, onde a regeneração foi induzida nove dias antes da experiência através da remoção cirúrgica do cristalino no olho

20 20 esquerdo e uma incisão na córnea. Após o período de recuperação pós-operatória de nove dias, os animais foram expostos a hipergravidade de 2G por 12 dias. Ao final do experimento, observaram que os olhos dos animais submetidos a hipergravidade de 2G apresentaram descolamento da retina. O descolamento de retina pode ter sido relacionada ao aumento da pressão intra-ocular induzida pela hipergravidade, sendo a regeneração da córnea mais lenta e a morfologia alterada Hipergravidade (simulação em centrífuga) A gravidade é uma força que age sobre a massa e o seu efeito sobre organismos biológicos depende da sua densidade (YAMASHITA; BABA, 2004). A força gravitacional é uma constante física e está presente na evolução e desenvolvimento da vida na Terra (SHIMADA; MOORMAN, 2006). Todo organismo na Terra está continuamente exposto à gravidade de 1G (KOYAMA et al., 2008). A gravidade sendo uma força de atração entre toda matéria, é uma força bastante familiar, e assim raramente é considerada como parâmetro para estudos biológicos experimentais (BECKER; SOUZA, 2013). Há mais de cinco décadas o homem vem tentado compreender como a gravidade afeta a vida dos seres vivos, ou seja, como alterações gravitacionais podem afetar o desenvolvimento, reprodução e/ou fisiologia dos organismos. Para isso tem-se desenvolvido estudos, com o objetivo de avaliar como a gravidade altera os fenômenos físicos da matéria e, portanto, poderia afetar os sistemas biológicos. Desse modo são desenvolvidas várias experiências em condições de gravidade diferentes da Terra (microgravidade, µg) ou a centrifugação (hipergravidade, HG). A variedade de organismos utilizados nesses experimentos é muito ampla e abrange praticamente toda a escala evolutiva, a partir de organismos unicelulares a multicelulares invertebrados e vertebrados (ALLERS, 2005). A vida evolui sob influencia da gravidade (G) e alterações como a temperatura podem interferir no desempenho celular, pois a variação de temperatura pode ser considerada um estresse natural. Ao contrário da temperatura, a hipergravidade (HG) não é um estresse natural, porque o nível de gravidade é uma constante na Terra, mesmo que na vida cotidiana possa se sentir uma ligeira e curta alteração da

21 21 gravidade, por exemplo, em carros ou elevadores durante a forte travagem (BOURG, 2008). O nível de gravidade superior ao nível de gravidade da Terra causa um estresse porque há maior G de carga, ou seja, um peso maior. Devido ao maior peso, a HG aumenta a demanda metabólica (BOURG, 2009). Os níveis de hipergravidade podem ser considerados como um estresse para o animal submetido a uma alta carga de gravidade, que deve se adaptar a um maior peso: em nível de 3G, o peso do animal é ampliado três vezes, o aumento de peso exige que a o metabolismo seja elevado também (MINOIS, 2006). Estudos demonstram que a força gravitacional influencia na morfogênese de tecidos biológicos (FREY et al., 1997). A gravidade influencia o ambiente mecânico dentro dos tecidos, afetando o peso, a pressão hidrostática extracelular e convecção de fluido (SEARBY; STEELE; GLOBUS, 2005). Uma alteração da gravidade pode perturbar a homeostase do organismo, mas não necessariamente o levar a morte (BOURG; TOFFIN; MASSÉ, 2004) Invertebrados como modelos experimentais em ambiente de hipergravidade Experimentos com invertebrados demonstraram que as células proliferam mais rápido em condições extremas e o processo de envelhecimento pode predizer que a longevidade diminui (KATO et al., 2005). O impacto de hipergravidade foi estudado para verificar se cianobactérias percebem as mudanças de gravidade como estresse. Hipergravidade de 90G e 180G gerada por uma centrifugação aumentou ligeiramente a atividade de proteínas desidrogenases, indicando que a mudança moderada de gravidade dificilmente gera estresse em cianobactérias (ERDMANN et al., 1997). Em experimento com Caenorhabditis elegans, Sasagawa et al (2005) submeteu jovens hermafroditas grávidas a hipergavidade de 8G, 47G, e 200G durante 12 horas e verificou que a hipergravidade diminuiu a taxa de sobrevivência (eclosão de ovos) em 70% em 200G e em 8G e 47G não houve alterações significativas. Foi demonstrado por Bourg e Fournier (2004) que a exposição de moscas Drosophila melanogaster a hipergravidade (3G ou 5G) em idade jovem ocasiona

22 22 aumento para duas semanas a longevidade masculina, resistência ao calor em ambos os sexos, assim como o retardamento comportamental. Bourg (2010) utilizou D. melanogaster para estudos sobre a influência positiva da hipergravidade no envelhecimento comportamental, resistência a fortes tensões e longevidade e verificou que, a exposição a esse tipo de estresse aumenta a resistência ao calor, porém expõe a infecções fúngicas. Estudos mostraram que breves exposições a hipergravidade aumenta a longevidade de vida e alterações comportamentais, a exposição crônica aumenta a resistência ao calor em jovens de Drosophila melanogaster. Esses resultados mostram que hipergravidade pode ter efeitos deletérios ou benéficos sobre a longevidade e o envelhecimento de acordo com o período de exposição de Drosophila melanogaster (MINOIS, 2006). Experiências realizadas com ovos e larvas de Acheta domesticus, para observação do efeito da hipergravidade sob o sistema neural, revelou através de imunocitologia alterações no tamanho dos interneurônios em 3G, porém não houve modificações na proliferação de células neurais (HORN et al., 2001). Embriões de uma espécie do filo Rotifera, ordem Bdelloidea (invertebrados aquáticos microscópicos com padrão de segmentação espiral) foram utilizados para verificação do estudo da influência da hipergravidade no desenvolvimento padrão do citoesqueleto. Os ovos foram submetidos a 3G, 4G, 5G, durante 3 dias, os resultados sugerem que hipergravidade afeta o desenvolvimento do embrião e a disposição do citoesqueleto, os núcleos apresentaram-se agregados de um lado e os microfilamentos e microtúbulos, do outro, porém essa alteração não foi permanente, indicando que o arranjo normal dos microtúbulos e filamentos podem ser recuperados (FASCIO; RICCI; SOTGIA, 2005). Organismos simples, com capacidade regenerativa, quando expostos a hipergravidade podem ajudar a compreender o que ocorre aos astronautas em diferentes ambientes gravitacionais, como no estudo realizado por Zhang et al (2005) em que observou o comportamento, morfologia e regeneração de Dugesia japonica. Estudo realizado por Campos-Velho (2011) demonstrou que os espécimens de Girardia tigrina, mantiveram a capacidade regenerativa em ambiente de hipergravidade e os fragmentos posteriores tiveram um crescimento médio significativamente maior no

23 23 grupo experimental quando comparado ao grupo controle, o que não ocorreu com os fragmentos anteriores de ambos os grupos Vertebrados como modelos experimentais em ambiente de hipergravidade Uma vez que a gravidade é um efeito permanente na superfície do planeta, os sistemas biológicos estão adaptados para conviver sob este efeito. Deste modo, a exposição à hipergravidade, pode causar alterações comportamentais e morfológicas em animais (CAMPOS-VELHO, 2011). A exposição a gravidade alterada pode perturbar o citoesqueleto da célulamatriz extracelular na superfície (ECM) de conexão entre células embrionárias de aves (galinha). Desenvolvimento de órgãos tais como o coração depende interações dinâmicas através das superfícies celulares. A fibronectina (FN), por exemplo, uma glicoproteína que liga a ECM ao citoesqueleto através de receptores de integrina de superfície, é necessário para o desenvolvimento normal do coração. Assim, a gravidade alterada pode perturbar a organogênese (LWIGALE et al., 2000). Sato et al. (1993) submeteram ovos de aves a hipergravidade de 2G por 7 dias e verificaram alterações morfológicas, como, fibrilas densas, maior diâmetro do parênquima e aumento das fibras colágenos no estroma. Estudo realizado por Sajdel-Sulkowskaa et al (2009), demonstrou que parte da massa da região anterior do cérebro e da massa do cerebelo foi reduzida em ratos recém-nascidos quando expostos a hipergravidade de 1,5G por 32 dias entre o período de gestação e pós-parto. Para ratas grávidas que foram mantidas em 1,8G a partir do 11º dia de gestação até o sétimo dia após o nascimento, evidenciam que a hipergravidade produz mudanças na musculatura mastigatória, na nuca e um encurtamento na cadeia de miosina dos embriões em desenvolvimento (MARTRETTE et al., 1998). Em ratas mantidas sob centrifugação durante 14 dias em 2G, observaram que houve perda da haste de células fotorreceptoras e a camada de célula foi reduzida para aproximadamente 20% da sua espessura normal (BARNSTABLEL et al., 2006). Estudo realizado por Kawakami et al (2006), demonstrou que a hipergravidade afeta a expressão dos genes Xotx2 e Xag e apoptose no desenvolvimento embrionário de anfíbio Xenopus laevis. Foram analisados embriões em estágio de gástrula em 2G e

24 24 5G. Os resultados mostraram que 5G retarda o desenvolvimento de embriões e induz microcefalia, microftalmia e supressão da expressão dos genes, Xotx2 (envolvido no desenvolvimento do olho) e Xag1 (regulação da formação de glândula de sustentação). Estas descobertas sugerem que a gravidade elevada influencia certas funções dos genes e induz a apoptose no cérebro e nos olhos, resultando em atraso no desenvolvimento e alterações morfológicas. 1.5 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA ATRAVÉS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA A microscopia eletrônica de varredura (MEV) é utilizada em várias áreas do conhecimento, incluindo a biologia (DUARTE et al., 2003). A microscopia eletrônica de varredura permite uma análise detalhada de interações celulares, da dinâmica celular, comportamento, locomoção e mobilidade. Técnicas modernas de preparação deixam as células num estado natural, com um mínimo de distorção, e torna-se possível preencher as lacunas dos estudos com células vivas (PEDERSEN, 1975). Para observar o processo de cicatrização de feridas, dinâmica, motilidade e locomoção celular, Pedersen (1975) realizou secções em Dugesia tigrina em intervalos de 1, 2, 4, 6, 7, 12, 16, 17 horas, e 1, 2, 3, 4 e 5 dias, e verificou através de MEV que a cicatrização ocorre de um a três ou quatro dias após a secção. A cicatrização completa da ferida baseia-se na interação entre células epidérmicas e o sistema de regeneração de células, membrana de tecido conjuntivo e filamentos musculares. No trabalho de Ishii; Sakurai (1991), a utilização do microscópio eletrônico de varredura para se obter melhor imagem dos aspectos tridimensionais de endocitose, mostrou a absorção de líquidos e material em partículas por fagócitos do intestino de planária, com especial atenção à morfologia de pseudópodes em células fagocíticas do tecido do intestino. Ovos de Haemagogus leucocelaenus foram observados em miscroscopia eletrônica de varredura por Alencar et al (2003), para realização de análises morfométricas das principais estruturas morfológicas, bem como a observação da ornamentação do exocório (camada externa da membrana que forma o revestimento duro do ovo de um inseto), mostrando as diferenças em relação aos tubérculos das

25 25 células coriônicas e ao retículo coriônico externo entre os ovos de H. leucocelaenus quando comparados aos ovos de H. janthinomys e H. equinus. O aparelho reprodutor feminino e masculino de vermes adultos de Shistossoma mansoni foram analisados por Neves et al (2005), e o estudo das estruturas morfológicas internas como, ovários, glândulas vitelinas e lóbulos entre as amostras testiculares, receptáculo seminal, células da glândula Mehlis internas, mostra que o sistema de reprodução não segue um padrão único dentro do filo Platyelminthes. Considerando uma melhor resolução adquirida pelo MEV, pode-se ter uma nova interpretação dessas estruturas. Em Dugesia lugubris o processo de fechamento da ferida durante a regeneração foi examinado sob efeito de citocalasina B que é um inibidor da polimerização da actina por microscopia eletrônica de varredura. Dez horas após a secção observou-se mudanças significativas na morfologia, relacionados ao processo de migração celular. Uma rede de rabditos parecia dar suporte para as células que migram ao tecido da ferida. Migração de células da epiderme foi inibida por citocalasina B, sugerindo que a base para a movimentação de células em planárias é semelhante ao de outros organismos (PASCOLINI et al., 1984). Quando analisado em MEV, o epitélio ventral de Schmidtea mediterranea é ciliado, sendo que estes cílios aparecem de forma homogênea em relação ao comprimento (10 µm), no entanto, o número de cílios é maior na região anterior (cabeça) em comparação com as outras regiões do corpo. Em contraste, a superfície dorsal é quase totalmente desprovida de cílios, com apenas pequenos loci em torno da região anterior (cabeça) tendo aglomerados de cílios. Estes cílios variam em tamanho e parecem ter funções sensoriais. Numerosos poros também estão presentes na superfície da epiderme, e representam os locais em que o muco é excretado (ROMPOLAS; PATEL-KING; KING, 2010). Estudos para observação da fertilização de ovos de anfíbio Pleurodeles waltl em microscopia eletrônica de varredura submetidos a hipergravidade de 2G, 3G e 4G mostrou que houve um aumento das microvilosidades nos ovos devido a condição extrema (AIMAR, et al., 2001). Anken et al (2001) observaram por microscopia eletrônica de varredura que os otólitos (estruturas de carbonato de cálcio presentes dentro do ouvido interno de vertebrados e que tem a função de manter o equilibrio postural) de peixes

26 26 Oreochromis mossambicus tiveram o crescimento diminuído, porém o desenvolvimento morfogenético e o comportamento de natação não foram alterados após exposição durante 22 dias a 3G, período esse necessário para esses animais completarem o seu desenvolvimento ontogenético do nascimento ao estágio de natação livre. Para verificar a influencia da hipergravidade no sistema nervoso central de peixes e larvas de rãs, Rahmann et al (1992) submeteram esses organismos por 9 dias 2G e 4G e através de microscopia eletrônica de varredura observaram uma redução do volume cerebral total, uma diminuição na atividade da creatina quinase e um aumento local da atividade citocromo-oxidase. Ibsh et al (1998) observaram em microscopia eletrônica de varredura que 3G por 8 dias (considerada alta gravidade e longo tempo e 10 minutos em 9G, tempo curto e gravidade elevada (muito superior a 1G)) não alteraram o desenvolvimento de otólitos em peixes adultos de Xiphophorus helleri. Otólitos utricular de embriões de aves expostos sob carga contínua 2G foram examinados sob microscópio eletrônico de varredura e as alterações morfológicas observadas apenas durante o processo de formação do tamanho dos otólitos. Essa formação foi retardada pela centrifugação de 2G, inferindo que HG influencia na formação de otólitos em aves (HARA et al., 1995). Sondag et al (1996) utilizaram hamsters concebidos e nascidos em uma centrífuga, para analisarem a adaptação estrutural de otólitos e verificaram através de microscopia eletrônica de varredura que 2,5G não afeta o conteúdo de cálcio, tamanho e forma, mas diminui a dimensão da área com otólitos, sugerindo que houve uma readaptação estrutural devido a hipergravidade. Uno et al (2000) realizaram estudos com ratos jovens e adultos para examinar a adaptação estrutural de otólitos e analisaram o efeito de 2G na morfologia de otólitos sacular e utricular através de microscopia eletrônica de varredura e os resultados mostraram que a morfologia e a composição de otólitos não foram afetados em até uma semana de exposição de HG.

27 27 2 JUSTIFICATIVA As planárias, objeto do estudo, são macroinvertebrados límnicos indicadores biológicos, com capacidade de regenerar um animal completo a partir de fragmentos do corpo e considerados ótimos organismos-testes. São animais de fácil manutenção em laboratório e sua elevada capacidade regenerativa, fornece um excelente modelo para estudos sobre regeneração celular e desenvolvimento. Girardia tigrina esta amplamente distribuída na América do Sul, sendo usualmente utilizada em estudos de diferentes áreas da biologia, tais como genética, biologia molecular e ambiental. Entretanto são escassos os experimentos com estes organismos em ambientes e extremos.

28 28 3 OBJETIVO GERAL O estudo teve como objetivo geral verificar se planárias límnicas são bons modelos para experimentos em hipergravidade. 3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Verificar quais alterações podem ocorrer durante o processo regenerativo de planárias G. tigrina e Planaria sp. em condições de hipergravidade. Observar se ocorre influência da hipergravidade em diferentes aspectos biológicos. Analisar através de microscopia eletrônica de varredura (MEV) se a hipergravidade influencia na estrutura morfológica ao longo do processo regenerativo das duas espécies de planárias límnicas.

29 29 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 SELEÇÃO DOS ESPÉCIMES PARA ANÁLISE DE FRAGMENTOS SUBMETIDOS A HIPERGRAVIDADE (SIMULAÇÃO EM CENTRÍFUGA) Para análise dos fragmentos durante o processo regenerativo em hipergravidade, foram selecionadas as espécies Girardia tigrina (Girard, 1850) e Planaria sp, sendo 68 espécimes mixoplóides de Planaria sp. e 68 exemplares de espécimes diploides de Girardia tigrina, 34 do grupo-controle e 34 do grupo experimental, para cada grupo. Os espécimes de G. tigrina foram coletados junto à macrófitas (Pistia stratiotes), uma vez por semana no período de abril a agosto de 2011, em um trecho do Rio Paraíba do Sul, área pública, localizado no município de Jacareí/SP. O rio corta a cidade e está localizado na região central, apresenta excesso de matéria orgânica e outros resíduos que são descartados as suas margens, fazendo com que esse trecho seja considerado poluído (Figura 4). A coleta consistiu em retirar das margens do rio, amostras de macrófitas (Figura 5) e posteriormente foram acondicionadas em sacos plásticos para triagem em laboratório. Figura 4 e 5:Vista parcial da área de coleta das planárias Girardia tigrina no município de Jacareí SP e detalhe das macrófitas (Pistia stratiotes), local de fixação (raízes) dos espécimes http// 5 http// 4

30 30 Os exemplares de Planaria sp. foram obtidas do ranário Toca do Lobo (Figura 7), localizado na cidade de São José dos Campos/SP, sendo a água onde os espécimens se encontravam provenientes de tanques de cultivo de rãs para o comércio alimentício (Figura 6). Figura 6 e 7: Vista parcial do ranário Toca do Lobo, local de coleta no município de São José dos Campos, SP e vista dorsal de um exemplar de Planaria sp Fonte: Google Earth, 2013 Fonte: Google Earth, TRIAGEM DAS MACRÓFITAS, SELEÇÃO E ACONDICIONAMENTO DOS ESPÉCIMES As macrófitas foram acondicionadas em recipientes plásticos, contendo água nãoclorada proveniente do Parque Municipal Roberto Burle Marx, localizado na cidade de São José dos Campos - SP (Figura 8). Os exemplares de G. tigrina e Planaria sp. foram retirados com o auxílio de um pincel nº 12 e mantidos em recipientes plásticos com água de manutenção (Figura 9).

31 31 Figura 8: Recipientes de acondicionamento das macrófitas no local de coleta Fonte: Acervo do autor (2010) Figura 9: Seleção e acondicionamento dos exemplares: (a) recipiente para triagem dos animais, (b) e (c) recipientes para manutenção dos exemplares no laboratório Fonte: Acervo do autor

32 CONDIÇÕES DE LABORATÓRIO Fotoperíodo e Temperatura Os animais foram submetidos a um fotoperíodo de 12 horas de luz e 12 horas com ausência de luz durante o tempo de manutenção em laboratório. A temperatura do laboratório foi mantida em torno de (17 C ± 1 C) Água de manutenção e alimentação A água de poço artesiano para manutenção dos espécimes, não deve ter presença de cloro (Cl), devido à sensibilidade destes organismos ao elemento químico. Os animais foram alimentados uma vez por semana com fígado bovino cru. O alimento era colocado na água de manutenção e após aproximadamente cinco horas os restos de fígado eram retirados e a água de manutenção trocada. 4.4 SELEÇÃO DOS EXEMPLARES PARA EXPOSIÇÃO A HIPERGRAVIDADE Os exemplares do grupo experimental foram seccionados individualmente com o auxílio de um bisturi n 12 e posicionados com a superfície ventral virada para cima e anestesiados em uma superfície com gelo e papel filtro e em seguida seccionados na região pré-faringeal e pós-faringeal, originando três fragmentos (Figura 10). Imediatamente os fragmentos foram colocados em placas de Petri com água e esta em cima de um papel milímetrado para mensuração. Conforme o animal se deslocava sobre a placa era realizada a mensuração e registrado em planilha de controle o comprimento em milímetros. Após a mensuração os animais foram acondicionados em tubos de ensaio de 50 ml com água de manutenção e centrifugados. A centrífuga utilizada (modelo C3i/CR3i da marca Jouan), pertence ao laboratório de Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Univap (Figura 11). Para atingir a gravidade de 3.3xG, utilizou-se a centrífuga em 550 rpm (rotações por minuto). Os tubos de ensaio foram mantidos durante nove dias consecutivos, centrifugando-se por 8 horas /dia e 16 horas/repouso, a uma temperatura