Controle da traça-das-crucíferas com isolado de Bacillus thuringiensis Berliner sob ação da radiação ultravioleta.

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1 VIANA CLTP; DE BORTOLI SA; OTUKA, AK; VEIGA, ACP; PEDROSO, EC; VACARI AM; LEMOS MVF Controle da traça-das-crucíferas com isolado de Bacillus thuringiensis Berliner sob ação da radiação ultravioleta. Controle da traça-das-crucíferas com isolado de Bacillus thuringiensis Berliner sob ação da radiação ultravioleta Horticultura Brasileira 28: S558-S564. Controle da traça-das-crucíferas com isolado de Bacillus thuringiensis Berliner sob ação da radiação ultravioleta. Cácia Leila T. P. Viana 1 ; Sergio Antonio De Bortoli 1 ; Alessandra Karina Otuka 1 ; Ana Carolina Pires Veiga 1, Elizabeth do Carmo Pedroso 1 ; Alessandra Marieli Vacari 1 ; Manoel Victor Franco Lemos 2. 1 FCAV/Unesp - Departamento de Fitossanidade,Laboratório de Biologia e Criação de Insetos Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias; 2 Departamento de Biologia Aplicada a Agropecuária (Via de Acesso Paulo Donato Castellane s/n, CEP: Jaboticabal-SP), caciat@gmail.com, bortoli@fcav.unesp.br, ale_otuka@hotmail.com, anacarolpv@yahoo.com.br, bethcpo@hotmail.com, amarieli@ig.com.br, mvictor@fcav.unesp.br. RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da radiação ultravioleta sobre o isolado T08024 de B. thuringiensis var. kurstaki associado ao controle da traça-das-crucíferas. O experimento foi conduzido no Laboratório de Biologia e Criação de Insetos (LBCI), da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da FCAV-Unesp, em sala climatizada a 25±1ºC, umidade relativa de 70±10% e fotofase de 12 horas. A suspensão do isolado T08024 foi pulverizada sobre discos foliares, sendo 5 discos de couve com diâmetro de 8 cm por tratamento, e os tratamentos foram os diferentes períodos de exposição à radiação ultravioleta, em duas distâncias verticais, 30 e 15 cm. Os períodos utilizados foram: zero, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480, 600 e 720 minutos, sob radiação ultravioleta emitida pela lâmpada da marca Spectroline com capacidade de 192µwats/s. Os discos ficavam dispostos sob a radiação acondicionados em uma câmara úmida (algodão umedecido com água destilada) para evitar o ressecamento do tecido vegetal. Após a secagem, os discos foram colocados na câmara úmida sob a radiação ultravioleta e acompanhado os diferentes períodos. Ao término de cada período, os discos, sobre papel filtro levemente umedecido com água destilada, foram colocados em placas de Petri e sobre cada um colocou-se 12 lagartas de P. xylostella de segundo-terceiro ínstar para alimentação. A primeira avaliação de mortalidade larval foi feita com 24 horas, devido ao modo de ação da bactéria, e as demais diariamente. As lagartas que se alimentaram de folha exposta à radiação, independente da distância, porém sem estar tratada com a bactéria (testemunha), apresentaram uma mortalidade significativamente inferior, em relação aos demais tratamentos. Além desse fato a radiação não afetou as características fisiológicas do vegetal, uma vez que constatou-se o hábito de fitofagia pelas lagartas. Por outro lado, o tratamento do período zero minutos de exposição à radiação apresentou mortalidade igual aos demais tratamentos expostos à radiação. Este resultado mostra que a radiação ultravioleta não influiu na patogenicidade do isolado. Palavras-chave: Brassica oleracea var. acephala, radiação ultravioleta, bactéria. Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010 S 558

2 ABSTRACT Diamomdback moth control using Bacillus thuringiensis Berliner strain under action of ultraviolet radiation. The objective of this study was to evaluate the influence of ultraviolet radiation on the strain T08024 of B. thuringiensis var. kurstaki to control of the diamondback moth. The experiment was conducted in the Laboratório de Biologia e Criação de Insetos (LBCI), of the Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da FCAV-Unesp, in a room with 25±1ºC, relative humidity of 70±10% and photophase of 12 hours. The strain suspension was sprayed on leaf discs, being five discs of kale with a diameter of 8cm / treatment. The treatments were the different periods of exposure to ultraviolet radiation in two vertical distances, 30 and 15 cm. The periods used were: zero, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480, 600 and 720 minutes, under radiation emitted by Spectroline lamp of 192ìwats/s. The discs were arranged under to ultraviolet radiation in a wet chamber to prevent drying of plant tissue. After drying the discs were placed in a moist chamber under ultraviolet radiation and monitored the different periods. After each period the discs were placed in Petri dishes on filter paper moistened with water. On each leaf disc was placed 12 caterpillar of P. xylostella to feeding. The first assessment of larval mortality was made at 24 hours and others daily. The caterpillars that fed from exposed leaf to the radiation, independent of the distance, however without being treated with the bacteria, they presented a mortality significantly inferior, in relation to the other treatments. Beyond of that fact the radiation didn t affect the physiologic characteristics of the vegetable, because it verified to feed of leaf habit for the caterpillars. Moreover, treatment of the period zero minutes of exposure to radiation had similar mortality rates than other treatments exposed to radiation. This result shows that ultraviolet radiation does not influence the pathogenicity of the isolate. Keywords: Brassica oleracea var. acephala ultraviolet radiation, bactéria. Bacillus thuringiensis Berliner é uma bactéria com eficiência comprovada para diversas pragas de diferentes ordens, entretanto, tem sido relatado seleção de populações resistentes em todo o mundo, principalmente para a traça-das-crucíferas, Plutella xylostella L. (Lepidoptera: Plutellidae), cuja resistência foi observada por Perez & Shelton (1997), Wright et al. (1997) em populações nos USA (Florida, Hawaii e New York), América Central (Costa Rica, Guatemala, Honduras e Nicarágua) e Ásia (Japão, Malásia). No Brasil, Castelo Branco et al. (2003) observaram resistência da praga em populações provenientes de ambientes em que se usava o B. thuringiensis como método de controle, e também para regiões onde não se aplicava este bioinseticida. O critério que tem se buscado no manejo da resistência para os diferentes insetos-praga que apresentam com facilidade esta variação genética, é o controle com formulações a base de B. thuringiensis associado ao uso de outras táticas de controle (Maxwell et al., 2006). Entretanto, o uso destas formulações pode ficar comprometido pela ação da luz solar, em especial da radiação ultravioleta (UV) do espectro. A persistência dos produtos microbianos no campo é altamente influenciada por este fator abiótico. Esta radiação atua sobre os ácidos nucléicos dos organismos, alterando-os ou mesmo inativandoos, impedindo o processo de multiplicação e eficiência de controle (Alves & Lecuona, 1998). A radiação pode atuar de forma estimulante, neutra ou prejudicialmente aos patógenos. A influência é relativa, dependendo do microrganismo envolvido, da fase de desenvolvimento, Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010 S 559

3 da natureza e quantidade de radiação à qual é exposto. A bactéria B. thuringiensis apresenta numa ordem decrescente maior estabilidade à exposição quando comparado com alguns fungos e vírus (Alves & Lecuona, 1998). Os microrganismos esporulantes são mais resistentes ao efeito deletério dos raios UV, assim como os fungos produtores de conídios. Estes microrganismos apresentam em sua constituição genes com a capacidade de sintetizar substâncias que lhes conferem esta resistência. Na maioria das vezes a substância envolvida é a melania (Chen et al., 2004). A espécie B. thuringiensis var. dendrolimus tem a capacidade de produzir esta substância, entretanto, esta característica não está em todas as espécies, ou ainda não foi identificado à expressão pelas linhagens utilizadas nos produtos biológicos (Chen et al., 2004). Uma das maiores preocupações no processo de formulação é definir qual fotoprotetor adequado, que não causa influência sobre a patogenicidade do agente, uma vez que o microrganismo não tem como escapar da incidência dos raios sobre a folhagem do vegetal. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da radiação ultravioleta sobre o isolado T08024 de B. thuringiensis var. kurstaki associado ao controle da traça-dascrucíferas. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido no Laboratório de Biologia e Criação de Insetos (LBCI), da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da FCAV-Unesp, em sala climatizada a 25±1ºC, umidade relativa de 70±10% e fotofase de 12 horas. Para o preparo da suspensão esporo/cristal, o isolado foi cultivado em placas de Petri com meio de cultura Agar Nutriente NA (extrato de carne 3g/L, peptona bacteriológica 5g/ L e Ágar 15g/L) e incubados a 30 C, durante 5 dias. Após este período, o conteúdo bacteriano foi transferido, com auxílio de alça de platina, para tubo Falcon contendo 10 ml de água Milli- Q autoclavada e 0,05% de Tweem 20 (espalhante adesivo). A suspensão obtida foi homogeneizada em aparelho do tipo Vórtex e a partir desta foram feitas duas suspensões seriadas, sendo a primeira 10-1 e a segunda A suspensão seriada 10-2 foi utilizada para contagem de esporos em câmara de NeuBauer para posterior padronização da concentração 1,30x10 7 esporos/ml a ser utilizada no bioensaio. Após o preparo da suspensão trabalho, realizou-se a pulverização sobre discos foliares, sendo 5 discos de couve com diâmetro de 8 cm por tratamento, os quais foram representados pelos diferentes períodos de exposição à radiação ultravioleta. Foi pulverizado um volume de 0,5 ml da suspensão trabalho por face do disco e esta foi realizada com auxílio de uma pistola para pintura, tipo aerógrafo, acoplada a um compressor da marca Schulz Modelo MS 2.3, com pressão operacional de 25lbf/pol 2, sob capela de exaustão. Também realizou-se uma pulverização com água mais espalhante adesivo (Tween 20) como testemunha. Após a secagem sobre bancada, por 30 minutos a 25ºC, os discos foram colocados sobre uma câmara úmida (algodão umedecido com água destilada para evitar o ressecamento do tecido vegetal) e sob a radiação ultravioleta emitida pela lâmpada da marca Spectroline com capacidade de 192µwats/s. Os períodos de exposição à radiação foram de 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480, 600 e 720 minutos sob duas distâncias verticais, 30 e 15 cm, uma vez que a testemunha ficou exposta ao maior período em ambas as distâncias. Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010 S 560

4 Ao término de cada período, os discos foram acondicionados em placas de Petri, sobre papel filtro umedecido com água destilada. Sobre cada disco foliar colocou-se 12 lagartas de P. xylostella de segundo-terceiro ínstar para alimentação. A primeira avaliação de mortalidade larval foi com 24 horas, devido ao modo de ação da bactéria, e as demais diariamente. Aos dados de mortalidade (%) de lagartas de P. xylostella foi aplicada a análise de variância, sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. Para demonstrar o hábito de fitofagia das lagartas foi realizado fotografia do experimento. RESULTADOS E DISCUSSÃO As lagartas que se alimentaram de folha exposta à radiação, independente da distância, porém sem estar tratada com a bactéria (testemunha), apresentaram uma mortalidade significativamente inferior, em relação aos demais tratamento (Tabela 1). Além desse fato a radiação não afetou as características fisiológicas do vegetal, uma vez que constatou-se o hábito de fitofagia pelas lagartas (Figura 1). Por outro lado, o tratamento representado pelo período zero minutos de exposição à radiação apresentou mortalidade igual aos demais tratamentos expostos à radiação. Este resultado mostra que a radiação ultravioleta não influiu na patogenicidade do isolado, sendo que na maioria das vezes a literatura traz esta afirmação, ou seja, que esta faixa do espectro solar inviabiliza o cristal protéico, assim como o esporo. Entretanto, esta afirmativa não pode ser atribuída de forma generalista, pois muitos microrganismos já descritos em diversos trabalhos científicos apresentam características peculiares de resistência à radiação ultravioleta. Assim, como as plantas, os microrganismos (algas, bactérias e fungos) produzem diferentes macromoléculas polissacarídicas (melanina, por exemplo) com diversas e importantes aplicações biotecnológicas. No ambiente natural em que os microrganismos são encontrados, tais polímeros podem estar associados à virulência, como no caso de plantas ou patógenos animais, à interação planta-microrganismo, à proteção da célula microbiana contra dessecação ou, ainda, ao ataque por bacteriófagos e protozoários (Faria, 2008). Este assunto é também pouco explorado em virtude dos produtos químicos utilizados como fotoprotetores nas formulações apresentarem condições ótimas sem interferir na viabilidade do cristal protéico (Chen et al., 2004). Contudo, este fato hoje é questionável devido à ineficiência de muitas formulações ser atribuída aos produtos químicos envolvidos no processo de fabricação do inseticida biológico, haja vista que os teste de patogenicidade com as cepas antes do preparo do formulado são altamente eficientes sobre os organismos alvo. A melanina é um pigmento sintetizado a partir de um composto fitotóxico, ou aminoácido não-protéico chamado L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). Nas plantas, L-DOPA é precursor de muitos alcalóides, como catecolaminas, flavonóides, melanina e fenilpropenóides. A via dos fenilpropenóides é uma das mais importantes devido ao seu papel na síntese de compostos fenólicos e de uma ampla série de produtos secundários em plantas, incluindo lignina. As paredes celulares dos vegetais sob estresse abiótico, como a exposição à radiação ultravioleta, ou até mesmo biótico, se tornam lignificadas (Chen et al., 2004). Atualmente, as pesquisas têm trabalhado mais profundamente esta capacidade do microrganismo sintetizar a melanina. Os trabalhos são realizados com mutação de cepas de Bacillus que apresentam potencial tóxico sobre insetos-praga, porém com sensibilidade a Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010 S 561

5 radiação. Entretanto, o efeito tóxico desde Bacillus mutante é reduzido, provavelmente porque as vias metabólicas envolvidas na síntese da melanina podem interferir sobre as proteínas tóxicas. Por isso é que há a necessidade do conhecimento mais específico das diferentes cepas já estudadas com potencial para controle microbiano, porque esta característica pode estar presente em maior ou menor escala, como também o próprio microrganismo pode apresentar outras variações na estrutura, lhe conferindo resistência à radiação (Ruan et al., 2004). Os resultados apresentados anteriormente podem estar relacionados com a capacidade do isolado selvagem L-7601 de B. thuringiensis var dendrolimus, mesmo ele sendo espécie diferente. A capacidade do microrganismo em sintetizar a melanina, provavelmente em resposta ao estresse abiótico, radiação ultravioleta, que pode estar associada ao papel desempenhado pela substância nos vegetais, onde a síntese é resultante de um estresse de ordem biótica ou abiótica, em que faz a via dos fenilpropranóides atuar com as tirosinases para produzir a melanina, principalmente em casos de perda de água lignificando as paredes celulares. Dessa forma, o isolado T08024 de B. thuringiensis var. kurstaki que pertence ao banco de isolados do Laboratório de Bactérias e Biotecnologia Aplicada à Agropecuária, da Unesp Campus de Jaboticabal, SP, demonstra ser uma fonte com alto potencial de controle para lepidópteros-praga (Viana et al., 2009), bem como um importante manancial de estudos envolvidos nos processos de desenvolvimento de formulações. Por outro lado, também se faz necessário estudo sobre sua constituição protéica, para averiguar a presença da melanina, utilizando técnicas de biologia molecular, como também de cromatografias de suspensão. Se este isolado não sintetizar melanina, a autoproteção à radiação poderá estar associada à camada polissacarídica do esporo, ou à presença de maior quantidade protéica nesta membrana, ou até mesmo pela presença de outras substâncias desconhecidas na suspensão utilizada no bioensaio. REFERÊNCIAS ALVES, SB; LECUONA, R Epizootiologia aplicada ao controle microbiano de insetos. In: ALVES, S. B. (Ed.). Controle Microbiano de Insetos. 2.ed. Piracicaba: FEALQ, p.: CASTELO BRANCO, M; FRANÇA, FH; PONTES, LA; AMARAL, PST Avaliação da suscetibilidade a inseticidas em populações da traça-das-crucíferas de algumas áreas do Brasil. Horticultura Brasileira 21(3): CHEN, Y; DENG, Y; WANG, J; CAI, J; GAIXIN, R Characterization of melanin produced by a wild-type strain of Bacillus thuringiensis. Journal of Genetic Applied Microbiology 50: MAXWELL, E. M; FADAMIRO, HY; MCLAUGHLIN, JR Suppression of Plutella xylostella and Trichoplusia ni in cole crops with attracticide formulations. Journal of Economic Entomology 99(4): PEREZ, CJ; SHELTON, AM Resistance of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) to Bacillus thuringiensis Berliner in Central America. Journal of Economic Entomology 90: Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010 S 562

6 RIA, R. O. Análise de polissacarídeos e tirosinase de Lentinula boryana (Berk & Mont) Pegler: um macrofungo com potencial biotecnológico. 2008, 149f. Tese (Doutorado em Ciências) - Universidade Federal do Paraná, Curitiba. RUAN, L; YU, Z; FANG, B; HE. W; WANG, Y; SHEN, P Melanin pigment formation and increased UV resistance in Bacillus thuringiensis following high temperature induction. Systematic and Applied Microbiology 27: VIANA, CLTP; GOULART, RM; DE BORTOLI, SA; THULER, AMG; THULER, RT; LEMOS, MVF; FERRAUDO, SA Efeito de novos isolados de Bacillus thuringiensis Berliner em Plutella xylostella (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Plutellidae). Científica 37(1): WRIGHT, DJ; IQBAL, M; GRANERO, F; FERRÉ, J A change in a single midgut receptor in the diamondback moth (Plutella xylostella) is only part responsible for field resistance to Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki and Bacillus thuringiensis subsp. aizawai. Applied and Evironmental Microbiology 63(5): Tabela 1. Médias de mortalidade (%) de lagartas de Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) alimentadas com folha de couve tratadas e não tratadas com o isolado T08024 de Bacillus thuringiensis var. kurstaki, após a exposição à radiação ultravioleta sob duas distâncias verticais da lâmpada UV em condição de laboratório. Jaboticabal, SP, (Mean mortality (%) of larvae of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) fed on kale leaf treated and untreated with T08024 strain of Bacillus thuringiensis var. kurstaki after exposure to ultraviolet radiation in two vertical distances from the UV lamp in the laboratory). Período de exposição Radiação ultravioleta à radiação ultravioleta emitida porlâmpada (minutos) (192µwats/s) Mortalidade (%) Distância vertical Distância vertical de 30 cm de de 15 cm de altura da lâmpada UV da lâmpada UV ,00±0,00a 100,00±0,00a ,70±2,39a 80,66±2,36a ,33±1,84a 80,00±1,65a ,00±1,70a 88,33±1,44a ,00±1,70a 85,00±2,20a ,00±2,33a 61,66±2,91a ,33±3,35a 70,00±1,80a ,00±1,63a 75,00±1,70a ,00±1,23a 71,66±3,62a ,00±1,23a 76,66±3,26a ,00±2,31a 88,33±1,23a ,33±0,96b 12,93±0,58b CV (%) - 20,69 23,44 Legenda: 2 = Testemunhas com lagartas que se alimentaram de folhas sem bactéria exposta à radiação. Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 0,5 % de probabilidade (Means followed by the same letter in the column do not differ significantly, according to Tukey s test p<0.05). Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010 S 563

7 A B C Figura 1. (A1 e A2) Testemunha: folha sem bactéria exposta à radiação ultravioleta (UV); B: Lagarta de P. xylostella após alimentar de folha contaminada com bactéria e irradiada com UV; C) Aspecto necrosado da folha de couve após exposição à radiação UV em contraste com a folha em condição natural. Jaboticabal, SP, (A1 e A2-) negative control: leaf without bacteria exposed to ultaviolet radiation (UV); B1-) Larvae of P. xylostella after feeding on inoculated and irradiation leaves; C-) Kale leaf after UV irradiation in relation to natural leaf). Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010 S 564