Solução tamponada que contém peróxido de hidrogénio, detergente e 0,015 mol/l de azida de sódio.

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1 PD-L1 IHC 22C3 pharmdx SK testes para utilização no Autostainer Link 48 Finalidade Para utilização em diagnóstico in vitro. O PD-L1 IHC 22C3 pharmdx é um ensaio de imuno-histoquímica qualitativa que utiliza o anticorpo Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 para a deteção da proteína PD-L1 em tecido de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) fixado em formol e impregnado em parafina (FFPE) através do sistema de visualização EnVision FLEX no Autostainer Link 48. A expressão da proteína PD-L1 é determinada utilizando a classificação da proporção tumoral (TPS), que é a percentagem de células tumorais viáveis que apresentam uma coloração parcial ou completa da membrana a qualquer intensidade. O PD-L1 IHC 22C3 pharmdx está indicado como auxiliar na identificação de doentes com NSCLC para tratamento com KEYTRUDA (pembrolizumab). Consulte no rótulo do produto KEYTRUDA os valores de corte de expressão que orientam a terapia em circunstâncias clínicas específicas. Resumo e explicação A ligação dos ligandos da PD-1, PD-L1 e PD-L2 ao recetor da PD-1 encontrado nas células T inibe a proliferação de células T e a produção de citoquina. A regulação superior dos ligandos da PD-1 ocorre em alguns tumores e a sinalização através desta via pode contribuir para a inibição da vigilância a células T imunes ativas dos tumores. O KEYTRUDA é um anticorpo monoclonal humanizado que se liga ao recetor da PD-1 e bloqueia a interação deste com a PD-L1 e a PD-L2, libertando a inibição mediada pela via da PD-1 da resposta imune, incluindo a resposta imune antitumoral. Em modelos tumorais de ratinhos singeneicos, o bloqueio da atividade da PD-1 resultou num menor crescimento do tumor (1). Princípio do procedimento O PD-L1 IHC 22C3 pharmdx contém os reagentes e o protocolo otimizados necessários para concluir um procedimento de coloração IHC de amostras FFPE no Autostainer Link 48. Após a incubação com o anticorpo monoclonal primário à PD-L1 ou com o Negative Control Reagent (NCR), as amostras são incubadas com um anticorpo de ligação específico às espécies hospedeiras do anticorpo primário, sendo depois incubadas com um reagente de visualização pronto a usar, que consiste em moléculas do anticorpo secundário e em moléculas de peroxidase de rábano associadas a uma estrutura base de polímero dextrano. A conversão enzimática do cromogénio posteriormente adicionado resulta na precipitação de um produto de reação visível no local do antigénio. A cor da reação cromogénica é modificada por um reagente de intensificação do cromogénio. Em seguida, é possível aplicar um contraste e uma lamela na amostra. Os resultados são interpretados utilizando um microscópio ótico. Materiais fornecidos Cada kit inclui 19,5 ml de anticorpo primário da PD-L1 (aproximadamente 3 µg/ml de concentração de proteínas) e contém os reagentes necessários à realização de 50 testes num máximo de 15 processamentos individuais. Os materiais apresentados abaixo são suficientes para 50 testes (50 lâminas incubadas com anticorpo primário contra a proteína PD-L1 e 50 lâminas incubadas com o reagente de controlo negativo correspondente, 100 lâminas no total). O número de testes baseia-se na utilização de 2 x 150 µl de cada reagente por lâmina, exceto para DAB+ e para a Target Retrieval Solution. O kit fornece materiais suficientes para, no máximo, 15 processos de coloração individuais. Quantidade Descrição 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Solução tamponada que contém peróxido de hidrogénio, detergente e 0,015 mol/l de azida de sódio. 1 x 19,5 ml Primary Antibody: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Anticorpo monoclonal de ratinho (IgG 1 ) anti PD-L1 numa solução tamponada, que contém proteína estabilizadora e 0,015 mol/l de azida de sódio. 1 x 15 ml Negative Control Reagent NEGATIVE CONTROL REAGENT Anticorpo monoclonal de ratinho contra a IgG de controlo numa solução tamponada, que contém proteína estabilizadora e 0,015 mol/l de azida de sódio. P03928PT_04/SK / p. 1/16

2 1 x 34,5 ml Mouse LINKER LINKER, ANTI-MOUSE Anticorpo monoclonal de coelho contra imunoglobulinas de ratinho numa solução tamponada, que contém proteína estabilizadora e 0,015 mol/l de azida de sódio. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextrano associado a moléculas de peroxidase e moléculas de anticorpo secundário de caprino contra imunoglobulinas de coelho e ratinho numa solução tamponada, que contém proteína estabilizadora e um agente antimicrobiano. 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Solução tamponada, que contém peróxido de hidrogénio e um agente antimicrobiano. 1 x 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloreto em solvente orgânico. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Sulfato cúprico em água. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Solução tamponada, ph 6,1, que contém detergente e um agente antimicrobiano. 15 lâminas PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Control Slides CONTROL SLIDES Cada lâmina contém cortes de duas linhas celulares aglomeradas, fixados em formol e impregnados em parafina: NCI-H226* com expressão da proteína PD-L1 moderada e MCF-7 com expressão da proteína PD-L1 negativa. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx XXXXX MCF-7: negativo à PD-L1 NCI-H226: positivo à PD-L1 *É reconhecido o contributo do Dr. AF Gazdar e do Dr. JD Minna nos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para o desenvolvimento da NCI-H226 (número ATCC: CRL-5826 ) (2). Nota: Todos os reagentes incluídos são especialmente formulados para a utilização com este kit. Para que o teste tenha o desempenho especificado, não podem ser feitas substituições, à exceção da EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x (Referência K8005). O PD-L1 IHC 22C3 pharmdx foi concebido para ser usado com o Autostainer Link 48. Consulte os manuais de utilizador do Autostainer Link 48 e do PT Link para obter mais informação. Materiais necessários, mas não fornecidos PT Link Pre-treatment Module (Referências PT100/PT101/PT200) Autostainer Link 48 (Referência AS480) EnVision FLEX Wash Buffer, 20x (Referência K8007) Hematoxylin (Referência K8008) Água destilada ou desionizada (água de qualidade reagente) Cronómetro Tecidos positivos e negativos para utilizar como controlos do processo (consultar a secção Controlo de qualidade) Lâminas de microscópio: Dako FLEX IHC Microscope Slides (Referência K8020) ou lâminas carregadas com Fisherbrand Superfrost Plus Lamelas Meio de montagem permanente e reagentes acessórios necessários para a montagem de lamelas Microscópio ótico (ampliação de objetiva de 4x-40x) P03928PT_04/SK / p. 2/16

3 Precauções 1. Para utilização em diagnóstico in vitro. 2. Para utilizadores profissionais. 3. Este produto contém azida de sódio (NaN3), uma substância química altamente tóxica na forma pura. Em situações de concentrações do produto, embora não sendo classificada como perigosa, a NaN3 pode reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando acumulações de azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar o produto, adicionar água abundante para evitar a acumulação de azida metálica na canalização (3). 4. O Primary Antibody, o Negative Control Reagent, o Linker e o Visualization Reagent contêm material de origem animal. 5. As amostras, antes e depois da fixação, assim como todos os materiais expostos às amostras, deverão ser manuseados como sendo potencialmente infeciosos e eliminados com as precauções adequadas (4). 6. Os tempos e as temperaturas de incubação ou métodos diferentes dos especificados podem originar resultados erróneos. 7. Os reagentes apresentam uma diluição ideal. A diluição subsequente pode originar a perda de coloração do antigénio. 8. Caso sejam expostos a níveis de luz excessivos, o Visualization Reagent, o Liquid DAB+ Chromogen e a solução DAB+ Substrate-Chromogen preparada podem ser afetados de forma adversa. Não conservar os componentes do sistema nem efetuar a coloração sob luz intensa como, por exemplo, luz solar direta. 9. Os resíduos de parafina podem dar origem a resultados falsos negativos. 10. Utilizar volumes de reagentes diferentes dos recomendados pode resultar na perda da imunorreatividade visível da PD-L Resultados de um pequeno estudo mostraram um intervalo dinâmico semelhante da expressão da PD-L1 em pares de amostras NSCLC primárias e metastáticas. É possível que haja diferenças na expressão da PD-L1 entre tumores primários e locais metastáticos de um mesmo doente. 12. Cortes de tecido de grandes dimensões podem necessitar de 3 x 150 µl de reagente. 13. Geralmente, pessoas com idade inferior a 18 anos não estão autorizadas a trabalhar com este produto. Os utilizadores devem ser cuidadosamente instruídos sobre os procedimentos de trabalho adequado, as propriedades perigosas do produto e as instruções de segurança necessárias. Consultar a Ficha de dados de segurança (FDS) para obter informações adicionais. 14. Usar equipamento de proteção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. 15. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações locais, nacionais e comunitárias. 16. A ficha de dados de segurança encontra-se disponível para utilizadores profissionais mediante pedido. Perigo DAB+ Chromogen: Bifenil-3,3,4,4 -tetrailtetraamónio tetracloreto a 1-5% H350 Pode provocar cancro. H341 Suspeito de provocar anomalias genéticas. P201 Pedir instruções específicas antes da utilização. P202 Não manuseie o produto antes de ter lido e percebido todas as precauções de segurança. P280 Usar luvas de proteção. Usar proteção ocular ou facial. Usar vestuário de proteção. P308 + P313 EM CASO DE exposição ou suspeita de exposição: Consulte um médico. P405 Armazenar em local fechado à chave. P501 Eliminar o conteúdo/recipiente em conformidade com as regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. Aviso EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1-5% de ácido cítrico H319 Provoca irritação ocular grave. H411 Tóxico para os organismos aquáticos com efeitos duradouros. P280 Usar proteção ocular ou facial. P273 Evitar a libertação para o ambiente. P264 Lavar cuidadosamente as mãos após manuseamento. P305 + P351 + P338 SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: Enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continue a enxaguar. P337 + P313 Caso a irritação ocular persista: Consulte um médico. P501 Eliminar o conteúdo/recipiente em conformidade com as regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. Conservação Conservar todos os componentes do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, incluindo as Lâminas de controlo, no escuro a 2-8 C quando não estiverem a ser utilizados no Autostainer Link 48. Não utilizar o kit após o fim da data de validade impressa no exterior da embalagem. Se os reagentes forem conservados sob outras condições que não as especificadas no folheto informativo, estas deverão ser validadas pelo utilizador. Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto, por isso, devem processar-se controlos positivos e negativos simultaneamente com as amostras de doente. Preparação das amostras As amostras devem ser manuseadas de forma a preservar os tecidos para a coloração IHC. Devem ser utilizados para todas as amostras métodos padrão de processamento de tecidos. Cortes impregnados em parafina Os tecidos fixados em formol e impregnados em parafina são adequados para utilização. Agentes de fixação alternativos não foram validados e podem originar resultados erróneos. Recomenda-se um tempo de fixação de horas em 10% de formol neutro tamponado (NBF); contudo, um estudo com amostras limitadas mostrou que tempos de fixação de horas em 10% de NBF não alterou a deteção da PD-L1 de forma sistemática. Tempos de fixação 3 horas podem originar variação na deteção da PD-L1. As amostras devem ser bloqueadas numa espessura de 3 ou 4 mm, fixadas em formol, e desidratadas e limpas numa série de álcoois e P03928PT_04/SK / p. 3/16

4 xilol, seguida pela infiltração com parafina derretida. A temperatura da parafina não deve exceder os 60 C. Os blocos de tecido FFPE com 5 anos ou mais podem resultar na perda da imunorreatividade da PD-L1. As amostras de tecido devem ser cortadas em secções de 4-5 µm. Após o seccionamento, os tecidos devem ser montados nas lâminas do microscópio Dako FLEX IHC (Referência K8020) ou em lâminas Fisherbrand Superfrost Plus e, em seguida, colocados num forno a 58 ± 2 C durante 1 hora. Para preservar a antigenicidade, depois de montados nas lâminas, os cortes de tecido devem ser conservados num local escuro a 2-8 C (preferencial), ou a uma temperatura ambiente até 25 C, e devem ser corados num prazo de 6 meses após o seccionamento. As condições de conservação e o manuseamento das lâminas não devem exceder os 25 C em qualquer momento posterior à montagem para garantir a integridade e a antigenicidade do tecido. A utilização de PD-L1 IHC 22C3 pharmdx em tecidos descalcificados não foi validada e não é recomendada. Preparação dos reagentes Antes da coloração devem ser preparados os seguintes reagentes: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Preparar uma quantidade suficiente de 1x Target Retrieval Solution, Low ph diluindo a Target Retrieval Solution, Low ph (50x) 1:50 com água destilada ou desionizada (água de qualidade reagente); o ph da solução 1x Target Retrieval Solution deve ser de 6,1 ± 0,2. A 1x Target Retrieval Solution com um ph abaixo de 5,9 pode originar resultados erróneos. Um frasco de 30 ml de Target Retrieval Solution, Low ph (50x) com uma diluição de 1:50, resultará em 1,5 L de 1x reagente, suficiente para encher um depósito do PT Link para tratar até 24 lâminas por utilização. Eliminar a 1x Target Retrieval Solution após três utilizações e não utilizar nos 5 dias seguintes à diluição. Se for necessária mais EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), está disponível com a Referência K8005. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Preparar uma quantidade suficiente de Wash Buffer, diluindo o Wash Buffer (20x) 1:20 utilizando água destilada ou desionizada (água de qualidade reagente) para os passos de lavagem. Conservar a solução 1x não utilizada a 2-8 C durante não mais de um mês. Eliminar o tampão, caso este fique turvo. Consultar mais informações no Manual de Utilizador do seu Autostainer Link 48. O EnVision FLEX Wash Buffer (20x) está disponível com a Referência K8007. DAB+ Substrate-Chromogen Solution Antes de ser utilizada, esta solução deve ser completamente misturada. O desenvolvimento de precipitado na solução não afeta a qualidade da coloração. Para preparar a DAB+ Substrate-Chromogen Solution, adicionar 1 gota de Liquid DAB+ Chromogen por ml de DAB+ Substrate Buffer e misturar. O substrato-cromogénio preparado é estável durante 5 dias se conservado em local escuro a 2-8 C. Notas importantes: Se utilizar um frasco inteiro de DAB+ Substrate Buffer, adicionar 9 gotas de DAB+ Chromogen. Apesar de a etiqueta indicar 7,2 ml, trata-se do volume utilizável e não tem em conta o "volume morto" do frasco. A cor do Liquid DAB+ Chromogen no frasco pode variar de incolor a castanho-lavanda. Tal não afetará o desempenho deste produto. Diluir de acordo com as orientações acima fornecidas. A adição de Liquid DAB+ Chromogen em excesso ao DAB+ Substrate Buffer resultará na deterioração do sinal positivo. Procedimento de coloração na solução Autostainer Link 48 Notas do procedimento Antes da utilização, o utilizador deve ler estas instruções com cuidado e familiarizar-se com todos os componentes e instrumentação (consultar a secção Precauções). Antes da imunocoloração, todos os reagentes devem ser equilibrados à temperatura ambiente (20-25 C). Do mesmo modo, todas as incubações devem ser realizadas à temperatura ambiente. Durante o procedimento de coloração, não permitir a secagem dos cortes de tecido. Os cortes de tecido secos poderão apresentar um aumento da coloração não específica. Todos os passos necessários e os tempos de incubação para a coloração são pré-programados no software Dako Link. Consultar os Manuais de Utilizador do Autostainer Link 48 e do PT Link para obter informações sobre os protocolos de programação e colocação das lâminas e dos reagentes. Nota: Os reagentes e instruções fornecidos com este sistema foram concebidos para se obter um desempenho ótimo quando utilizados com os reagentes e materiais recomendados. A diluição subsequente dos reagentes ou a alteração dos tempos ou temperaturas de incubação podem originar resultados erróneos ou discordantes. Protocolo de coloração Selecionar o protocolo de coloração para o PD-L1 IHC 22C3 pharmdx das opções do menu pendente do Dako Link. Todos os passos necessários e os tempos de incubação para a coloração são pré-programados no Autostainer Link 48. Se os protocolos adequados para o PD-L1 IHC 22C3 pharmdx não estiverem presentes no servidor, contactar o representante local do serviço técnico para obtê-los. Passo 1: Procedimento de desparafinação, reidratação e recuperação do alvo (3 em 1) Para informações detalhadas, consultar o manual do utilizador do PT Link. Definir Preheat (Pré-aquecimento) e Cool (Frio) do PT Link (Referências PT100/PT101/PT200) para 65 C. Definir Heat (Aquecimento) para 97 C durante 20 minutos. Encher os depósitos do PT Link com 1,5 L por depósito de solução de trabalho Target Retrieval Solution, Low ph, 1x para cobrir os cortes de tecido. P03928PT_04/SK / p. 4/16

5 Pré-aquecer a Target Retrieval Solution até 65 C. Mergulhar os suportes do Autostainer que contenham cortes de tecido FFPE montados na Target Retrieval Solution, Low ph, (1x solução de trabalho) pré-aquecida no depósito do PT Link. Incubar durante 20 minutos a 97 C. Quando a incubação de recuperação do alvo estiver concluída e a temperatura tiver arrefecido até 65 C, retirar todos os suportes de lâminas Autostainer com as respetivas lâminas do depósito do PT Link e colocar de imediato o suporte do Autostainer com as lâminas num depósito (ex., PT Link Rinse Station, Referência PT109) que contenha Wash Buffer (Referência K8007) diluído à temperatura ambiente. Incubar as lâminas no Wash Buffer, diluído e à temperatura ambiente, durante 5 minutos. Passo 2: Procedimento de coloração Após o procedimento de desparafinação, reidratação e recuperação do alvo (3 em 1), os suportes do Autostainer com as lâminas são colocados no Autostainer Link 48. O instrumento realiza o procedimento de coloração aplicando o reagente apropriado, monitorizando o tempo de incubação e lavando as lâminas entre a colocação dos reagentes. Os tempos do reagente são pré-programados no software Dako Link. Passo 3: Contraste O contraste deve ser aplicado às lâminas durante 5 minutos com Hematoxylin (Link) (Referência K8008). O tempo de incubação da hematoxilina está pré-programado no protocolo. Passo 4: Montagem É necessário um meio de montagem permanente não aquoso. Nota: Poderá ocorrer algum esbatimento das lâminas consoante diversos fatores, incluindo, entre outros, aplicação de contraste, materiais e métodos de montagem, e condições de conservação das lâminas. Para minimizar o desvanecimento, armazenar as lamelas num local escuro e à temperatura ambiente (20-25 C). Controlo de qualidade O controlo de qualidade dos reagentes do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx foi realizado por intermédio de imuno-histoquímica, utilizando os procedimentos de recuperação do alvo e coloração destacados anteriormente. Quaisquer desvios dos procedimentos recomendados para a fixação de tecidos, processamento e impregnação no laboratório do utilizador podem produzir uma variabilidade significativa nos resultados. Em cada processo de coloração, devem ser incluídos controlos de qualidade. Estes controlos de qualidade são especificados na Tabela 1 e incluem: uma amostra de tecido do doente corada com H&E; tecidos de controlo positivo e negativo fornecidos pelo laboratório e uma Control Cell Line Slide (5) fornecida pela Dako. Nos Estados Unidos, consultar as diretrizes de controlo de qualidade do College of American Pathologists (CAP) Accreditation Program for Immunohistochemistry e consultar também a CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (5, 6, 7) para obter mais informações. Verificação do ensaio Antes da utilização inicial de um sistema de coloração num procedimento de diagnóstico, o utilizador deve verificar o desempenho do ensaio, testando-o numa série de tecidos fornecidos pelo laboratório com características de desempenho IHC conhecidas, representando tecidos positivos e negativos conhecidos. Consultar os procedimentos de controlo de qualidade indicados na secção Controlo de qualidade acima. Estes procedimentos de controlo de qualidade devem ser repetidos para cada novo lote de anticorpo, ou sempre que houver alterações nos parâmetros do ensaio. As opções de resolução de problemas para potenciais problemas, as suas causas e ações de correção sugeridas são indicadas na Tabela 12. Interpretação dos resultados - NSCLC Todas as células tumorais viáveis em toda a lâmina devem ser avaliadas e incluídas na avaliação dos resultados da PD-L1. Devem estar presentes na lâmina corada com PD-L1, no mínimo, 100 células tumorais viáveis para que a amostra seja considerada adequada para a avaliação da PD-L1. Para classificar corretamente amostras coradas com o PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, é fundamental que sejam avaliadas células apropriadas, que a localização celular devida seja identificada e que a intensidade da coloração seja adequadamente interpretada. A avaliação da lâmina deve ser efetuada por um patologista, utilizando um microscópio ótico. Para avaliação da coloração imuno-- histoquímica e dos seus resultados, é apropriada uma amplificação com objetiva de 10-40x. Qualquer coloração da membrana de células tumorais percetível deve ser incluída na classificação. Classificar colorações de membranas celulares parciais ou completas ( 1+) que sejam distinguíveis da coloração citoplasmática. A coloração citoplasmática deve ser considerada como coloração não específica e deve ser excluída na avaliação da intensidade da coloração. As células normais e as células imunes associadas aos tumores, tais como linfócitos infiltrantes ou macrófagos, não devem ser incluídas na classificação para a determinação da positividade da PD-L1. As amostras tumorais coradas com NCR devem ter 0 de coloração específica e 1+ de coloração de fundo. A Classificação da proporção tumoral (TPS) é a percentagem de células tumorais viáveis que apresentam uma coloração da membrana parcial ou completa ( 1+). A amostra deve ser considerada com expressão da PD-L1 caso a TPS 1% das células tumorais viáveis apresente coloração da membrana a qualquer intensidade. A amostra deve ser considerada com expressão da PD-L1 elevada caso a TPS 50% das células tumorais viáveis apresente coloração da membrana a qualquer intensidade. Em cada processo de coloração, as lâminas devem ser examinadas na ordem apresentada na Tabela 1, para se determinar a validade do processo de coloração e permitir a avaliação da coloração da amostra de tecido. Consultar o Manual para a interpretação do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx para ter mais orientações. Recomendações adicionais para a interpretação da coloração do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx 1. Para verificar a coloração da membrana celular, utilize uma ampliação de objetiva de 10 40x. 2. Diversos elementos não-alvo, tais como as células imunes associadas ao tumores (ex. macrófagos) e o estroma, podem também apresentar uma coloração positiva à PD-L1; contudo, não devem ser incluídas na classificação. P03928PT_04/SK / p. 5/16

6 Tabela 1. Ordem recomendada de avaliação das lâminas Amostras Racional Requisitos 1. H&E (Fornecidas pelo laboratório) Uma coloração da amostra de tecido com hematoxilina e eosina (H&E) é avaliada em primeiro lugar para avaliar a histologia do tecido e a qualidade da preservação. 2. Control Cell Line Slide (Fornecida pela Dako) A Control Cell Line Slide corada com o anticorpo primário da PD-L1 do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx deve ser examinada a fim de determinar se todos os reagentes estão a funcionar devidamente. A Control Cell Line Slide contém o aglomerado da linha celular positiva à PD-L1 e o aglomerado da linha celular negativa à PD-L1. O PD-L1 IHC 22C3 pharmdx e a coloração H&E devem ser realizados em cortes em série do mesmo bloco de parafina da amostra. As amostras de tecido devem estar intactas, bem preservadas e devem confirmar a indicação de tumor. Em cada procedimento de coloração, deve ser corada uma Control Cell Line Slide com o anticorpo primário contra a PD-L1. Critérios de aceitação da NCI-H226 (Linha celular de controlo positiva à PD-L1): Coloração da membrana celular de 70% das células a 2+ da intensidade de coloração média. Intensidade de coloração não específica < 1+. Critérios de aceitação da MCF-7 (Linha celular de controlo negativa à PD-L1): Sem coloração específica. Intensidade de coloração não específica < 1+. De notar que pode ser ocasionalmente observada a coloração de algumas células nos aglomerados de células de MCF-7. São aplicáveis os seguintes critérios de aceitação: a presença de 10 células totais com coloração distinta da membrana de plasma ou a coloração citoplasmática com 1+ de intensidade dentro dos limites do aglomerado de células de MCF-7 são aceitáveis. 3. Positive Control Tissue Slides (Fornecidas pelo laboratório) 4. Negative Control Tissue Slides (Fornecidas pelo laboratório) As Positive Control Tissue Slides coradas com o anticorpo primário da PD-L1 e com o Negative Control Reagent devem ser examinadas em seguida. Estas lâminas verificam se o método de fixação e o processo de recuperação antigénica são eficazes. Os controlos de tecidos positivos conhecidos devem ser utilizados apenas para monitorização do desempenho correto dos tecidos processados e dos reagentes de teste, NÃO para auxiliar na formulação de um diagnóstico específico das amostras dos doentes. As Negative Control Tissue Slides (conhecidas como sendo negativas para a PD-L1) coradas com o anticorpo primário da PD-L1 e com o Negative Control Reagent devem ser examinadas a seguir para verificar a especificidade da marcação do antigénio alvo pelo anticorpo primário. Em alternativa, as porções negativas do tecido de controlo positivo podem servir como tecido de controlo negativo, mas tal deverá ser validado pelo utilizador. Se os resultados das linhas celulares de controlo não corresponderem a estes critérios, todos os resultados obtidos com as amostras do doente deverão ser considerados inválidos. Os controlos devem consistir em amostras de biopsia/cirúrgicas da mesma indicação de tumor da amostra do doente, fixadas, processadas e impregnadas logo que possível, da mesma forma que a(s) amostra(s) do doente. Utilizar amostras intactas para a interpretação dos resultados de coloração, já que as células necróticas ou degeneradas apresentam, normalmente, uma coloração não específica. Os tecidos selecionados para utilização como controlos de tecido positivo devem demonstrar uma coloração positiva fraca a moderada, quando corados com PD-L1, para ajudar na deteção de alterações subtis na sensibilidade do ensaio. Em cada processo de coloração, devem ser incluídas duas lâminas de controlo de tecido positivo. Lâmina corada com PD-L1: Deve ser observada presença de coloração castanha na membrana de plasma. A coloração não específica deve ser 1+ Lâmina corada com Negative Control Reagent: Sem coloração da membrana. A coloração não específica deve ser 1+. Caso os controlos de tecidos positivos não demonstrem uma coloração positiva apropriada, devem considerar-se inválidos os resultados obtidos com as amostras de teste. Os controlos devem consistir em amostras de biopsia/cirúrgicas da mesma indicação de tumor da amostra do doente, fixadas, processadas e impregnadas logo que possível, da mesma forma que a(s) amostra(s) do doente. Em cada processo de coloração, devem ser incluídas duas lâminas de controlo de tecido negativo. Lâmina corada com PD-L1: Sem coloração da membrana em células tumorais. A coloração não específica deve ser 1+. Lâmina corada com Negative Control Reagent: Sem coloração da membrana. A coloração não específica deve ser 1+. Caso ocorra coloração específica da membrana celular nas Negative Control Tissue Slides, os resultados obtidos com a amostra do doente devem ser considerados inválidos. P03928PT_04/SK / p. 6/16

7 5. Tecido de controlo das amígdalas (opcional) (Fornecidas pelo laboratório) 6. A lâmina do tecido do doente corou com o reagente de controlo negativo 7. A lâmina do tecido do doente corou com o anticorpo primário da PD-L1 Utilizar tecido de amígdalas humano fixo, processado e impregnado de forma semelhante às amostras de doentes como material de controlo adicional para verificar a sensibilidade, a especificidade e a coloração de fundo não específica do ensaio. Examinar amostras de doentes coradas com o Negative Control Reagent do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. O Negative Control Reagent é utilizado em vez do anticorpo primário e auxilia na interpretação da coloração específica do local do antigénio. Examinar por último toda a lâmina das amostras do doente coradas com o anticorpo primário da PD-L1 do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Consultar as secções Resumo e explicação, Limitações e Características de desempenho para obter informação específica sobre a imunorreatividade do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Deve ser detetada uma coloração positiva forte nos cortes de tecido do epitélio da cripta e uma coloração fraca a moderada nos macrófagos foliculares dos centros germinativos. Deve ser observada uma coloração negativa no endotélio, nos fibroblastos, assim como no epitélio superficial. A ausência da coloração da membrana celular verifica a pontuação específica do antígeno alvo pelo anticorpo primário. A coloração não específica deve ser 1+. A intensidade da coloração positiva deve ser avaliada no contexto de qualquer coloração de fundo não específica observada na lâmina do Negative Control Reagent do doente no mesmo processamento. À semelhança do que acontece com qualquer teste de imuno-histoquímica, um resultado negativo significa que o antigénio não foi detetado e não necessariamente que este estava ausente nas células/tecido analisado. Todas as células tumorais viáveis em toda a lâmina do doente corada com PD-L1 devem ser avaliadas e incluídas na avaliação dos resultados da PD-L1. Devem estar presentes, no mínimo, 100 células tumorais viáveis para que a amostra seja considerada adequada para a avaliação da PD-L1. Limitações gerais 1. A imuno-histoquímica é um processo de diagnóstico com vários passos que requer uma formação especializada na seleção dos reagentes apropriados; seleções de tecidos, fixação e processamento; preparação da lâmina de imuno-histoquímica e interpretação dos resultados da coloração. 2. A coloração de tecidos depende do manuseamento e processamento dos tecidos antes da coloração. A fixação, congelação, descongelação, lavagem, secagem, aquecimento e seccionamento incorretos ou a contaminação com outros tecidos ou fluidos poderá produzir artefactos, aprisionamento de anticorpos ou resultados falsos negativos. Os resultados inconsistentes podem dever-se a variações nos métodos de fixação e impregnação ou a irregularidades inerentes aos tecidos. 3. Uma contrastação excessiva ou incompleta poderá comprometer a interpretação adequada dos resultados. 4. A interpretação clínica de qualquer coloração positiva ou a sua ausência deve ser avaliada no contexto da apresentação clínica, morfologia e outros critérios histopatológicos. A interpretação clínica de qualquer coloração positiva ou a sua ausência deve ser complementada com estudos morfológicos e controlos adequados, bem como outros testes de diagnóstico. A interpretação da preparação corada é responsabilidade de um patologista qualificado que esteja familiarizado com anticorpos, reagentes e métodos utilizados. A coloração deve ser efetuada por um laboratório licenciado certificado sob a supervisão de um patologista responsável pelo exame das lâminas coradas e garantia da adequação dos controlos positivos e negativos. 5. Os tecidos de pessoas infetadas pelo vírus da hepatite B que contenham o antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg) podem exibir coloração não específica com a peroxidase (7). 6. Os reagentes podem demonstrar reações inesperadas em tipos de tecidos não testados previamente. A possibilidade de reações inesperadas mesmo nos tipos de tecido testados não podem ser completamente eliminadas devido a variabilidade biológica de expressão do antigénio nos neoplasmas ou outros tecidos patológicos. Contactar a Assistência técnica Dako com reações inesperadas devidamente documentadas. 7. Podem observar-se resultados falsos positivos devido à ligação não imunológica de proteínas ou a produtos de reação do substrato. Poderão ser também causados pela atividade da pseudoperoxidase (eritrócitos) e atividade da peroxidase endógena (citocromo C) (7). 8. Os reagentes e instruções fornecidos neste sistema foram concebidos para se obter um desempenho ótimo. A diluição subsequente dos reagentes ou a alteração dos tempos ou temperaturas de incubação podem originar resultados erróneos ou discordantes. Limitações específicas do produto 1. Os resultados falsos negativos poderão ser causados pela degradação do antigénio presente nos tecidos ao longo do tempo. As amostras devem ser coradas num período de seis meses após a montagem dos tecidos nas lâminas, quando conservadas em local escuro a 2-8 C (preferencial) ou a uma temperatura ambiente até 25 C. 2. Para resultados ótimos e reprodutíveis, a proteína PD-L1 requer o pré-tratamento da recuperação do alvo quando os tecidos forem rotineiramente fixados (formol neutro tamponado) e impregnados em parafina. 3. Não substituir por reagentes de números de lote diferentes deste produto ou por kits de outros fabricantes. A única exceção é a EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), que, se necessário, está disponível com a Referência K As linhas celulares de controlo coradas apenas devem ser utilizadas para validação do processo de coloração e não para classificar a reação da coloração nos cortes de tecido. 5. A utilização de PD-L1 IHC 22C3 pharmdx em tecidos com agentes de fixação que não sejam o formol não foi validada. 6. A utilização de PD-L1 IHC 22C3 pharmdx em aspirados com agulha fina não foi validada. Avaliação do desempenho clínico KEYNOTE-024: Ensaio controlado de doentes com CPNPC sem tratamento prévio A segurança e eficácia de pembrolizumab foi investigada no KEYNOTE-024, um estudo multicêntrico controlado para o tratamento de CPNPC metastático sem tratamento prévio. Os doentes tiveram uma expressão da PD-L1 com uma classificação da proporção tumoral (TPS) de 50% com base no PD-L1 IHC 22C3 pharmdx (9). Os doentes foram aleatorizados (1:1) para receberem uma dose de 200 mg de pembrolizumab a cada 3 semanas (n = 154) ou quimioterapia com platina escolhida pelo investigador (n = 151; incluindo P03928PT_04/SK / p. 7/16

8 pemetrexed+carboplatina, pemetrexed+cisplatina, gemcitabine+cisplatina, gemcitabine+carboplatina ou paclitaxel+carboplatina. Os doentes não escamosos poderiam receber manutenção de pemetrexed). Os doentes foram tratados com pembrolizumab até uma toxicidade inaceitável ou à progressão da doença. O tratamento poderia continuar para além da progressão da doença se o doente estivesse clinicamente estável e o investigador tivesse considerado que obteria um benefício clínico. Foram excluídos do estudo doentes com aberrações tumorais genómicas EGFR ou ALK; doenças autoimunes que requeiram terapia sistémica no espaço de 2 anos de tratamento; uma condição médica que requeira imunossupressão; ou que tenham recebido mais de 30 Gy de radiação torácica nas 26 semanas anteriores. A avaliação do estado do tumor foi realizada a cada 9 semanas. Os doentes em quimioterapia que tenham sofrido uma progressão independentemente verificada da doença foram capazes de transitar e receber pembrolizumab. Dos 305 doentes no KEYNOTE-024, as características de base foram: idade média de 65 anos (54% com idade igual ou superior a 65 anos); 61% do sexo masculino; 82% brancos e 15% asiáticos; e um estado de desempenho ECOG de 0 e 1 em 35% e 65%, respetivamente. Quanto às características da doença: escamosa (18%) e não escamosa (82%); M1 (99%); e metástases cerebrais (9%). O principal resultado de eficácia foi a sobrevivência sem progressão (PFS), conforme avaliada pela revisão central independente cega (BICR) utilizando os critérios Response Evaluation Criteria on Solid Tumors Version 1.1 (RECIST 1.1). Os resultados de eficácia secundários foram a sobrevivência global (SO) e a taxa de resposta objetiva (ORR) conforme avaliada pela BICR utilizando RECIST 1.1. A Tabela 2 apresenta um resumo das principais medidas de eficácia de toda a população com intenção de tratar (ITT). Tabela 2: Resultados de eficácia no KEYNOTE-024 Parâmetro de avaliação final KEYTRUDA 200 mg a cada 3 semanas n = 154 Quimioterapia n = 151 PFS* Número (%) de doentes com evento 73 (47%) 116 (77%) Rácio de risco 0,50 (0,37, 0,68) --- Valor p < 0, Mediana em meses 10,3 (6,7, n.d.) 6,0 (4,2, 6,2) Sobrevivência global Número (%) de doentes com evento 44 (29%) 64 (42%) Rácio de risco 0,60 (0,41, 0,89) --- Valor p 0, Mediana em meses Não atingido (n.d., n.d.) Não atingido (9,4, n.d.) Taxa de resposta objetiva* % de ORR 45% (37, 53) 28% (21, 36) % de resposta completa 4% 1% % de resposta parcial 41% 27% Duração da resposta Média em meses (intervalo) Não atingido (1,9+, 14,5+) % com duração > 6 meses 88% 59%# * Avaliação por BICR utilizando RECIST 1.1 Rácio de risco (KEYTRUDA em comparação com quimioterapia) com base no modelo Cox de riscos proporcionais estratificados Com base no teste log-rank estratificado Com base em doentes com a melhor resposta global, conforme confirmado pela resposta completa ou parcial Com base em estimativas de Kaplan-Meier; inclui 43 doentes com respostas de 6 ou mais meses # Com base em estimativas de Kaplan-Meier; inclui 16 doentes com respostas de 6 ou mais meses n.d. = não disponível 6,3 (2,1+, 12,6+) P03928PT_04/SK / p. 8/16

9 Figura 1: Curva de Kaplan-Meier para a sobrevivência global no KEYNOTE Sobrevivência Overall Survival global (%) (%) Treatment Grupo de tratamento arm KEYTRUDA Chemotherapy Quimioterapia Número em Tempo Time em in Months meses risco Number at Risk KEYTRUDA: Quimioterapia: Chemotherapy: KEYNOTE-010: Ensaio controlado de doentes com CPNPC previamente tratados com quimioterapia O benefício clínico do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx foi investigado no KEYNOTE-010, um estudo clínico multicêntrico, sem dupla ocultação e aleatorizado, conduzido para avaliar a segurança e a eficácia do KEYTRUDA em doentes com NSCLC avançado previamente tratados com quimioterapia com platina (10) (9). Os doentes tiveram uma expressão da PD-L1 com uma TPS de 1% com base numa versão de ensaio de teste clínico (CTA) do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Os doentes com mutação de ativação de EGFR ou translocação de ALK também tiveram uma progressão da doença na terapia aprovada para estas mutações antes de receber pembrolizumab. Os doentes foram aleatorizados (1:1:1) para receberem uma dose de 2 de pembrolizumab (n = 344) ou 10 mg/kg (n = 346) a cada 3 semanas ou uma dose de 75 mg/m 2 de docetaxel a cada 3 semanas (n = 343) até à progressão da doença ou uma toxicidade inaceitável. Foram excluídos do ensaio os doentes com doenças autoimunes; uma condição médica que requeira imunossupressão; ou que tenham recebido mais de 30 Gy de radiação torácica nas 26 semanas anteriores. A avaliação do estado do tumor foi realizada a cada 9 semanas. Os principais resultados de eficácia foram a sobrevivência global (SO) e a sobrevivência sem progressão (PFS) conforme avaliado pela BICR utilizando RECIST 1.1. Com base no CTA, foi aleatorizado no estudo um total de 1033 doentes com NSCLC. Para avaliar a utilidade clínica do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, as amostras do estudo clínico arquivadas foram testadas a posteriori num laboratório de referência, localizado nos EUA, com PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Dos 1033 doentes, o tecido tumoral de 529 doentes foi testado a posteriori com o teste PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Amostras de 413 doentes possuíam expressão da PD-L1 ( 1% das células tumorais viáveis apresentava coloração da membrana a qualquer intensidade) e amostras de 94 doentes não possuíam expressão da PD-L1 (< 1% das células tumorais viáveis apresentava coloração da membrana a qualquer intensidade). Destes 413 doentes com expressão da PD-L1, as amostras de 163 doentes tiveram uma expressão da PD-L1 elevada ( 50% das células tumorais viáveis apresentava coloração da membrana a qualquer intensidade). O nível de concordância alcançado entre o CTA e o PD-L1 IHC 22C3 pharmdx é apresentado na Tabela 3. Tabela 3: Concordância de CTA vs. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Percentagens de concordância Corte de PD-L1 Percentagem de concordância negativa (intervalo de confiança [IC] de 95%) CTA vs. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Percentagem de concordância positiva (intervalo de confiança [IC] de 95%) TPS 1% 94,5% [91,4%-96,6%] 80,0% [76,9%-82,8%] TPS 50% 98,3% [97,1%-99,0%] 73,2% [67,9%-77,9%] Entre os doentes aleatorizados com expressão da PD-L1 pelo PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, as características demográficas e outras características de base estavam bem equilibradas entre os grupos de tratamento. A idade mediana era de 63 anos (44% com 65 anos ou mais). A maioria dos doentes era caucasiana (77%) e do sexo masculino (58%); o estado de desempenho ECOG de referência era 0 (29%) ou 1 (71%). Setenta e oito por cento (78%) dos doentes tinham sido/eram ainda fumadores. Vinte e dois por cento (22%) dos doentes tinha histologia escamosa e 69% tinha histologia não escamosa. As características de base e demográficas foram bem equilibradas de forma similar nos grupos de pembrolizumab e de docetaxel na totalidade do estudo clínico. Os resultados da eficácia estão resumidos nas Tabelas 4 e 5. O KEYTRUDA demonstrou um benefício clínico durável em doentes com NSCLC com expressão da PD-L1 (TPS 1%), o qual foi superior em doentes com expressão da PD-L1 elevada (TPS 50%), tal como determinado pelo PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. A magnitude do benefício foi comparável com a do ensaio clínico global. As tabelas abaixo apresentam um resumo dos resultados de eficácia na população geral com expressão da PD-L1 (TPS 1%) e no subconjunto com expressão da PD-L1 elevada (TPS 50%) da totalidade do estudo clínico (TPS 1% pelo CTA) e na população com expressão da PD-L1 pelo PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. A curva de Kaplan-Meier para a sobrevivência global (TPS 1%), tal como determinado pelo PD-L1 IHC 22C3 pharmdx) é apresentada na Figura 2. Os resultados de eficácia foram semelhantes para os grupos de 2 mg/kg e 10 mg/kg do KEYTRUDA. P03928PT_04/SK / p. 9/16

10 Tabela 4: Resposta ao KEYTRUDA em doentes com NSCLC previamente tratados: Totalidade do estudo clínico e doentes positivos ao PD-L1 IHC 22C3 pharmdx: PD-L1 TPS 1% Parâmetro de avaliação final KEYTRUDA 2 mg/kg a cada 3 semanas KEYTRUDA 10 mg/kg a cada 3 semanas Docetaxel 75 mg/m 2 a cada 3 semanas Ensaio clínico PD-L1 IHC PD-L1 IHC PD-L1 IHC Ensaio clínico Ensaio clínico 22C3 pharmdx 22C3 pharmdx 22C3 pharmdx Número de doentes Sobrevivência global Mortes (%) 172 (50%) 59 (42%) 156 (45%) 59 (42%) 193 (56%) 67 (51%) Rácio de risco* 0,71 (0,58, 0,88) 0,54 (0,37, 0,78) 0,61 (0,49, 0,75) 0,57 (0,39, 0,82) Valor p < 0,001 < 0,001 < 0,001 0, Mediana em meses 10,4 (9,4, 11,9) 11,8 (9,6, n.d.) 12,7 (10,0, 17,3) 12,0 (8,7, n.d.) 8,5 (7,5, 9,8) 7,5 (6,3, 9,9) PFS Eventos (%) 266 (77%) 97 (63%) 255 (74%) 103 (73%) 257 (75%) 94 (72%) Rácio de risco* 0,88 (0,73, 1,04) 0,68 (0,50, 0,92) 0,79 (0,66, 0,94) 0,79 (0,59, 1,06) Valor p 0,068 0, ,005 0, Mediana em meses Taxa de resposta global % de ORR 3,9 (3,1, 4,1) 18% (14, 23) 4,9 (4,1, 6,2) 24% (17, 32) 4,0 (2,6, 4,3) 18% (15, 23) 4,0 (2,2, 4,6) 20% (14, 28) 4,0 (3,1, 4,2) 9% (7, 13) 3,8 (2,2, 4,2) 5% (2, 11) * Rácio de risco (KEYTRUDA em comparação com docetaxel) com base no modelo Cox de riscos proporcionais estratificados Com base no teste log-rank estratificado Avaliação por BICR utilizando RECIST 1.1 Todas as respostas foram respostas parciais Tabela 5: Resposta ao KEYTRUDA em doentes com NSCLC previamente tratados: Totalidade do estudo clínico e doentes positivos ao PD-L1 IHC 22C3 pharmdx: PD-L1 TPS 50% Parâmetro de avaliação final KEYTRUDA 2 mg/kg a cada 3 semanas KEYTRUDA 10 mg/kg a cada 3 semanas Docetaxel 75 mg/m 2 a cada 3 semanas Ensaio clínico PD-L1 IHC PD-L1 IHC PD-L1 IHC Ensaio clínico Ensaio clínico 22C3 pharmdx 22C3 pharmdx 22C3 pharmdx Número de doentes Sobrevivência global Mortes (%) 58 (42%) 18 (32%) 60 (40%) 19 (32%) 86 (57%) 25 (53%) Rácio de risco* 0,54 (0,38, 0,77) 0,45 (0,24, 0,84) 0,50 (0,36, 0,70) 0,29 (0,15, 0,56) Valor p < 0,001 0,00541 < 0,001 < 0, Mediana em meses PFS 14,9 (10,4, n.d.) Não atingida (9,3, n.d.) 17,3 (11,8, n.d.) Não atingida (8,3, n.d.) 8,2 (6,4, 10,7) 7,2 (4,4, 8,3) Eventos (%) 89 (64%) 33 (59%) 97 (64%) 34 (57%) 118 (78%) 33 (70%) Rácio de risco* 0,58 (0,43, 0,77) 0,47 (0,28, 0,80) 0,59 (0,45, 0,78) 0,41 (0,24, 0,70) Valor p < 0,001 0,00221 < 0,001 < 0, Mediana em meses Taxa de resposta global % de ORR 5,2 (4,0, 6,5) 30% (23, 39) 5,9 (4,2, 9,0) 37% (25, 52) 5,2 (4,1, 8,1) 29% (22, 37) 4,8 (2,8, n.d.) 28% (18, 41) 4,1 (3,6, 4,3) 8% (4, 13) 3,9 (2,0, 4,3) 4% (1, 15) * Rácio de risco (KEYTRUDA em comparação com docetaxel) com base no modelo Cox de riscos proporcionais estratificados Com base no teste log-rank estratificado Avaliação por BICR utilizando RECIST 1.1 Todas as respostas foram respostas parciais P03928PT_04/SK / p. 10/16

11 Figura 2: A curva Kaplan-Meier para a sobrevivência geral por grupo de tratamento (TPS 1% pelo PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, população com intenção de se tratar) Sobrevivência global (%) Docetaxel 75 mg/m 2 Q3W MK mg/kg Q3W MK mg/kg Q3W n em risco Docetaxel 75 mg/m2 Q3W 131 Tempo em meses MK mg/kg Q3W 140 MK mg/kg Q3W 142 Foram realizadas análises de robustez adicionais para avaliar o potencial impacto da falta de dados decorrentes de doentes com expressão da PD-L1 (TPS 1%) pelo PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, mas que podem não ter tido expressão da PD-L1 (TPS < 1%) pelo CTA. Os doentes com estes resultados de teste fazem parte da população de utilização prevista/intenção de diagnóstico (ITD) do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx; no entanto, foram excluídos do ensaio clínico devido à inexistência de expressão da PD-L1 através da análise do CTA. Para dar reposta a estes dados em falta, foi realizada uma análise de sensibilidade para se compreender o intervalo plausível do rácio de risco (HR) estimado com base nas subpopulações de PD-L1 IHC 22C3 pharmdx na TPS 1% e TPS 50% sob um enquadramento da ITD para verificação da consistência em relação ao HR observado com base na inscrição com o CTA. Os resultados da análise de sensibilidade do HR mostraram que as estimativas de HR são fortes para qualquer atenuação assumida do efeito do tratamento sob o enquadramento da ITD. Avaliação do desempenho não clínico Sensibilidade/especificidade analítica A sensibilidade analítica do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx foi testada em 127 casos únicos de amostras FFPE de carcinoma do pulmão de células pequenas (NSCLC) de estádio I a IV utilizando um lote de produção fabricado. A avaliação da expressão da PD-L1 demonstrou coloração num intervalo de células tumorais positivas de 0-100% e de intensidade de coloração de 0-3. Tecidos normais: A Tabela 6 resume a imunorreatividade do Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 no painel recomendado de tecidos normais. Foi observada a presença de coloração da membrana de plasma em células imunes e em células de origem epitelial. Foi notada coloração citoplasmática em alguns tipos de células, não tendo sido registada como coloração positiva. Todos os tecidos foram fixados com formol e impregnados em parafina, e corados com PD-L1 IHC 22C3 pharmdx de acordo com as instruções deste folheto informativo. Não foram observados resultados inesperados nos tipos de células ou tipos de tecidos testados. A coloração observada era consistente com a literatura reportada para a expressão da PD-L1 por IHC em tecidos normais (11, 12). Tabela 6: Resumo da reatividade do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx em tecido normal Tipo de tecido (n.º testados) Coloração de membrana de plasma positiva: Elementos de tecido Coloração citoplasmática positiva: Elementos de tecido Coloração não específica Amígdalas (3) 3/3 Epitélio da cripta 0/3 0/3 2/3 Centro germinativo (macrófagos) Baço (3) 2/3 Macrófagos 0/3 0/3 Células mesoteliais (2) 0/2 0/2 0/2 Cerebelo (3) 0/3 0/3 0/3 Cérebro (3) 0/3 0/3 0/3 Colo do útero (3) 1/3 Epitélio 0/3 0/3 Cólon (3) 2/3 Macrófagos 0/3 0/3 Esófago (3) 0/3 0/3 0/3 Estômago (3) 2/3 Linfócitos 1/3 Glândulas gástricas 0/3 1/3 Glândulas gástricas Fígado (3) 1/3 Macrófagos 0/3 0/3 1/3 Heptatócitos Glândula salivar (3) 0/3 0/3 0/3 Hipófise (3) 1/3 Hipófise anterior 1/3 Hipófise anterior 0/3 1/3 Hipófise posterior 1/3 Hipófise posterior Intestino delgado (3) 0/3 0/3 0/3 P03928PT_04/SK / p. 11/16

12 Tipo de tecido (n.º testados) Coloração de membrana de plasma positiva: Elementos de tecido Coloração citoplasmática positiva: Elementos de tecido Mama (3) 0/3 0/3 0/3 Medula óssea (3) 3/3 Megacariócitos 3/3 Megacariócitos 0/3 Músculo, cardíaco (3) 0/3 0/3 0/3 Músculo, esquelético (3) 0/2 0/2 0/2 Nervos, periféricos (3) 0/3 1/3 Tecido conjuntivo/vasos 0/3 Ovário (3) 0/3 0/3 0/3 Pâncreas (3) 0/3 0/3 0/3 Paratiroide (3) 1/3 Epitélio glandular 0/3 0/3 Pele (3) 0/3 0/3 0/3 Próstata (2) 2/2 Epitélio 0/2 0/2 Pulmão (3) 3/3 Macrófagos alveolares 0/3 0/3 Rim (3) 1/3 Epitélio tubular 0/3 0/3 Suprarrenal (3) 0/3 1/3 Células medulares 0/3 Testículos (3) 0/3 0/3 0/3 Timo (3) 3/3 Epitélio medular 0/3 0/3 Tiroide (3) 0/3 0/3 0/3 Útero (3) 0/3 0/3 0/3 Coloração não específica Tecidos neoplásicos: A Tabela 7 resume a imunorreatividade do Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 no painel de tecidos neoplásicos. Foi observada a presença de coloração da membrana de plasma em células imunes e em células de origem epitelial. Foi notada coloração citoplasmática em alguns tipos de células, não tendo sido registada como coloração positiva. Todos os tecidos foram fixados com formol e impregnados em parafina, e corados com PD-L1 IHC 22C3 pharmdx de acordo com as instruções deste folheto informativo. Não foram observados resultados inesperados nas amostras tumorais testadas. A coloração observada era consistente com a literatura reportada para a expressão da PD-L1 por IHC em tecidos neoplásicos (11-14). Tabela 7: Resumo da reatividade do PD-L1 IHC 22C3 pharmdx em tecido neoplásico Tipo de tumor Localização Positivo a PD-L1/total N = 159 Apêndice 0/1 Cabeça e pescoço, palato duro 0/1 Colo do útero, tipo endocervical 0/1 Cólon 0/5 Cólon, metastático para o fígado 0/1 Cólon, mucinoso 0/1 Esófago 0/1 Estômago 0/6 Estômago, mucinoso 0/1 Glândula salivar/parótida 0/2 Intestino delgado 0/2 Mama, DCIS 0/2 Mama, ductal invasivo 0/7 Mama, metastático ductal invasivo para nódulo linfático 0/1 Adenocarcinoma Ovário 0/1 Ovário, endometrioide 0/1 Ovário, mucinoso 0/1 Ovário, seroso 0/1 Pâncreas 0/2 Pâncreas, ductal 0/3 Próstata 0/5 Pulmão 1/4 Reto 0/4 Tiroide, folicular 0/1 Tiroide, folicular-papilar 0/1 Tiroide, papilar 0/3 Útero, célula clara 0/1 Útero, endométrio 0/3 Vesícula biliar 1/5 Vesícula biliar, metastático para o pulmão 0/1 Astrocitoma Cérebro 0/3 Carcinoma Nasofaríngeo, NPC 0/1 Carcinoma adrenocortical Suprarrenal 0/1 Carcinoma das células de transição Bexiga 0/6 Rim 0/1 Carcinoma das células em anel de sinete Carcinoma das células em anel de sinete metastático para o ovário 0/1 Carcinoma das células escamosas Cólon 0/1 Cabeça e pescoço 0/2 Carcinoma das células escamosas esofágicas metastático para o nódulo 0/1 linfático Colo do útero 2/5 P03928PT_04/SK / p. 12/16