Estas instruções aplicam-se ao Dako EnVision+ Dual Link System-HRP (DAB+).

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1 Dako EnVision + Dual Link System-HRP (DAB+) Referência K4065 Finalidade Para utilização em diagnóstico In Vitro. Estas instruções aplicam-se ao Dako EnVision+ Dual Link System-HRP (DAB+). Este kit é indicado para utilização com anticorpos primários de ratinho e coelho fornecidos pelo utilizador, para a identificação qualitativa de antigénios através de microscopia óptica, em tecidos normais e patológicos impregnados em parafina e tecidos criostatos ou preparações celulares. Podem ser utilizados tecidos processados em diversos agentes de fixação, como o etanol, B-5, fixador de Bouin, formol de zinco e formol neutro tamponado. Resumo e explicação Princípios do Procedimento Reagentes fornecidos O EnVision+ Dual Link System-HRP consiste numa técnica de coloração IHC em duas etapas. Este sistema baseia-se num polímero marcado com HRP, que é conjugado com anticorpos secundários. O polímero marcado não contém avidina nem biotina. Consequentemente, a coloração não específica resultante da actividade endógena da avidina-biotina no fígado, rim, tecidos linfóides e secções de criostato, é eliminada ou significativamente reduzida. Todos os reagentes no EnVision+ Dual Link System-HRP com substrato (excluindo a solução de substrato-cromogénio líquido DAB+) estão prontos a utilizar. Este sistema constitui um método extremamente sensível e, como resultado, as diluições ideais do anticorpo primário são até 20 vezes superiores às utilizadas para a técnica de PAP tradicional e muitas vezes superiores às utilizadas nos métodos ABC ou LSAB tradicionais. Este protocolo oferece um sistema de geração de sinal melhorado, para a detecção de antigénios presentes em concentrações baixas ou para anticorpos primários de titulação baixa. Os anticorpos primários produzidos no ratinho ou no coelho reagem bem com o polímero marcado. A interpretação de qualquer coloração positiva ou da sua ausência deve ser complementada por estudos morfológicos e histológicos, realizados com controlos adequados. Qualquer actividade da peroxidase endógena é inibida pela incubação da amostra com Dual Endogenous Enzyme Block durante 5 10 minutos. A amostra é então incubada com um anticorpo de ratinho ou coelho, caracterizado e diluído de forma apropriada, a que se segue a incubação com o polímero marcado utilizando uma incubação recomendada de 30 minutos para cada. De salientar que, para os anticorpos que requerem digestão da enzima ou recuperação de alvo, poderá ser necessário aumentar os tempos de incubação do anticorpo primário e do polímero marcado em 5 10 minutos. A coloração é completada por uma incubação de 5 10 minutos com substrato-cromogénio (DAB+) 3,3 -diaminobenzidina, que resulta num precipitado acastanhado no local do antigénio. (DAB é um potencial agente carcinogénico; consultar a secção Precauções.) Referência K4065 Neste kit estão incluídos os seguintes materiais em quantidade suficiente para 150 secções de tecidos, com base num valor de 100 µl por secção: Quantidade Descrição 1 x 15 ml Dual Endogenous Enzyme Block peróxido de hidrogénio a 0,3% com azida de sódio e Levamisole. 1 x 15 ml Polímero marcado Polímero marcado com peroxidase, conjugado com imunoglobulinas de caprino anti-coelho e de caprino anti-ratinho, em tampão Tris-HCl contendo proteína estabilizante e um agente antimicrobiano. 1 x 18 ml Tampão substrato Solução tampão de substrato, ph 7,5, contendo peróxido de hidrogénio e um conservante. 1 x 1 ml Cromogénio DAB+ Solução de cromogénio 3,3 -diaminobenzidina. ( ) P04048PT_01/K4065/ p. 1/7

2 Materiais necessários, mas não fornecidos Precauções Água desionizada ou destilada Etanol, absoluto e a 95% Xilol, tolueno ou substitutos de xilol Anticorpos primários e reagente de controlo negativo Lâminas revestidas com poli-l-lisina ou Silanized Slides (referência S3003) (consultar a aderência de tecidos impregnados em parafina) Tecido de controlo, positivo e negativo Hidróxido de amónio, 15 mol/l, diluído para 0,037 mol/l Contrastante, base aquosa como, por exemplo, Mayer s Hematoxylin ou Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (referência S3002 para processamento automatizado; referência S3001 para processamento manual) (consultar a secção Preparação dos reagentes) O Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use (referência S3025) é recomendado para montagem aquosa; ou meio de montagem permanente não aquosa, Ultramount (referência S1964) ou Permanent Mounting Medium (referência S3026) Lamelas Microscópio óptico (20x 800x) Panos absorventes Frascos ou banhos de coloração Cronómetro (com intervalos de 3 40 minutos) Frascos de lavagem Solução tampão de lavagem como, por exemplo, Automation Buffer (referência S3006), TBS (referência S3001) ou PBS (referência S3024) 1. Para utilizadores profissionais. 2. Este produto contém azida de sódio (NaN 3), um produto químico altamente tóxico na forma pura. Em situações de concentração do produto, embora não sendo classificadas como perigosas, a NaN 3 pode reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando acumulações de azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar o produto, adicionar água abundante para evitar a acumulação de azidas metálicas na canalização. 3. Não substituir os reagentes deste kit por outros de lotes diferentes ou por kits de outros fabricantes. 4. As enzimas e as soluções de substrato-cromogénio podem ser afectadas de forma adversa, se expostas a níveis de luz excessivos. Não conservar os componentes do kit nem efectuar a coloração sob luz intensa como, por exemplo, luz solar directa. 5. Tempos ou temperaturas de incubação diferentes dos especificados poderão originar resultados erróneos; tais alterações têm que ser validadas pelo utilizador Tal como acontece com qualquer produto de origem biológica, deverão utilizar-se procedimentos de manuseamento adequados. 7. Usar equipamento de protecção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. 8. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações locais e nacionais. 9. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível para utilizadores profissionais, mediante pedido. Perigo Dual Endogenous Enzyme Block: <0.1% 3(2H)-Isothiazolone, 5-chloro-2-methyl-, mixt. with 2-methyl- 3(2H)-isothiazolone H314 Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves. H317 Pode provocar uma reacção alérgica cutânea. P280 Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Usar vestuário de protecção. P261 Evitar respirar os vapores. P264 Lavar as mãos cuidadosamente após manuseamento. P272 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P330 + P331 P303 + P361 + P353 + P363 + P310 P302 + P352 P333 + P313 P305 + P351 + P338 + P310 P405 A roupa de trabalho contaminada não pode sair do local de trabalho. EM CASO DE INALAÇÃO: Retirar a vítima para uma zona ao ar livre e mantê-la em repouso numa posição que não dificulte a respiração. Contacte imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. EM CASO DE INGESTÃO: Contacte imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. Enxaguar a boca. NÃO provocar o vómito. SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo): Retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água ou tomar um duche. Lavar a roupa contaminada antes de a voltar a usar. Contacte imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE: lavar abundantemente com água/ Em caso de irritação ou erupção cutânea: consulte um médico. SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: Enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continue a enxaguar. Contacte imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. Armazenar em local fechado à chave. ( ) P04048PT_01/K4065/ p. 2/7

3 P501 Eliminar o conteúdo e o recipiente em conformidade com a regulamentação local, regional, nacional e internacional. Perigo DAB+ Chromogen: 1 5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Pode provocar cancro. H341 Suspeito de provocar anomalias genéticas. P201 Pedir instruções específicas antes da utilização. P202 Não manuseie o produto antes de ter lido e percebido todas as precauções de segurança. P280 Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Usar vestuário de protecção. P308 + P313 EM CASO DE exposição ou suspeita de exposição: Consulte um médico. P405 Armazenar em local fechado à chave. P501 Eliminar o conteúdo e o recipiente em conformidade com a regulamentação local, regional, nacional e internacional. Como regra, as pessoas com idade inferior a 18 anos não estão autorizadas a trabalhar com este produto. Os utilizadores devem ser cuidadosamente instruídos sobre o procedimento de trabalho adequado, as propriedades perigosas do produto e as instruções de segurança necessárias. Conservação Os reagentes do EnVision+ Dual Link System-HRP devem ser conservados entre 2 8 C. Não congelar. Não utilizar após o prazo de validade impresso nos frascos de reagente e no rótulo do kit. Se os reagentes forem conservados em condições diferentes das especificadas, o utilizador deverá verificar essas mesmas condições. 1 A alteração no aspecto de qualquer reagente, como precipitação, pode indicar instabilidade ou deterioração. Nestes casos, o(s) reagente(s) não deve(m) ser usado(s). Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade destes produtos. Por isso, devem testar-se controlos positivos e negativos simultaneamente com as amostras do doente. Caso se observe uma coloração inesperada que não possa ser explicada pela variação nos procedimentos laboratoriais e se suspeite da existência de um problema com o kit, contactar a Assistência Técnica da Dako. Preparação das amostras Preparação dos reagentes Antes da coloração IHC, os tecidos deverão ser fixados e processados. A fixação evita a autólise e putrefacção dos tecidos excisados, preserva a antigenicidade, melhora o índice de refracção dos constituintes dos tecidos e aumenta a resistência dos elementos celulares ao processamento dos tecidos. O processamento dos tecidos inclui a desidratação, a remoção dos agentes desidratantes, a infiltração dos meios de impregnação, a impregnação e o seccionamento dos tecidos. Estas indicações servem apenas de orientação. O utilizador deverá determinar e verificar os procedimentos ideais. Para obter informação específica sobre a fixação e processamento de tecidos, consultar General Instructions for Immunohistochemical Staining (Instruções Gerais para Coloração Imunohistoquímica) da Dako. Solução tampão de lavagem A investigação demonstrou que o tampão Tris-HCl de 0,05 mol/l, ph 7,6, contendo 0,15 mol/l NaCl e Tween 20 a 0,05% sem azida de sódio, ajuda significativamente a minimizar a coloração de fundo com este sistema. Um tampão de lavagem recomendado é o Automation Buffer (referência S3006). Os tampões de lavagem que contêm peroxidase de rábano inactivada com azida de sódio apresentam resultados de coloração negativa. Conservar o tampão não utilizado entre 2 8 C. Elim inar o tampão, caso este fique turvo. COLORAÇÃO MANUAL As secções de tecido devem ser lavadas em, no máximo, três banhos de Automation Buffer (referência S3006), TBS (referência S3001) ou PBS (referência S3024) durante 3 5 minutos entre cada etapa do protocolo de coloração do EnVision+ Dual Link System. Anticorpo primário A Dako possui disponíveis anticorpos prontos a utilizar no EnVision+ Dual Link System. A Dako também tem disponíveis anticorpos concentrados; no entanto, o utilizador deverá determinar as diluições ideais. Devido à elevada sensibilidade do EnVision+ Dual Link System, as diluições dos anticorpos primários podem variar entre 5 a 20 vezes mais do que as utilizadas para os métodos IHC tradicionais. Se for necessário utilizar anticorpos concentrados, as diluições devem ser preparadas utilizando Antibody Diluent (referência S0809). Para a maior parte dos anticorpos primários utilizados com este kit, é suficiente um tempo de incubação de 30 minutos. ( ) P04048PT_01/K4065/ p. 3/7

4 Reagente de controlo negativo Idealmente, um reagente de controlo negativo contém um anticorpo que exibe actividade não específica com tecidos humanos ou soro normal/não imune, na mesma matriz/solução que o anticorpo primário diluído. O reagente de controlo negativo deve ser da mesma subclasse e espécie animal que o anticorpo primário, diluído na mesma concentração de proteínas ou imunoglobulinas que o anticorpo primário diluído utilizando o mesmo diluente. O período de incubação do reagente de controlo negativo deve corresponder ao do anticorpo primário. Por motivos de conveniência, a Dako possui à disposição, como produtos prontos a utilizar, um reagente de controlo negativo universal para anticorpos primários de ratinho e um reagente de controlo negativo universal para anticorpos primários de coelho. Para obter informação específica sobre a preparação dos reagentes de controlo negativo, consultar General Instructions for Immunohistochemical Staining (Instruções Gerais para Coloração Imunohistoquímica) da Dako. Solução de substrato-cromogénio O protocolo que se segue para a preparação de 1 ml de solução de substrato-cromogénio DAB+ é suficiente para até 10 sessões de tecido ou até 5 esfregaços de células. ETAPA 1 Consoante o número de lâminas que se pretende corar, transferir alíquotas suficientes de 1 ml de tampão de substrato para um recipiente de tamanho adequado. ETAPA 2 Para cada 1 ml de tampão, adicionar 1 gota (20 µl) de cromogénio líquido DAB+. Misturar imediatamente. A solução de substrato-cromogénio DAB+ preparada permanece estável durante, aproximadamente, 5 dias quando conservada entre 2 8 C. Antes de ser utiliz ada, esta solução deve ser completamente misturada. O desenvolvimento de precipitado na solução não afecta a qualidade da coloração. Utilizado na totalidade, os 18 ml de tampão de substrato fornecido, resultará num volume adequado para 150 testes. Poderá permanecer um excedente de volume. Meios de montagem Para a montagem aquosa, é recomendado Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (referência S3025). Para a montagem permanente, utilizar o Ultramount (referência S1964) ou o Permanent Mounting Medium (referência S3026). Procedimento de coloração Notas do procedimento Antes da utilização, o utilizador deve ler estas instruções com cuidado e familiarizar-se com o conteúdo do kit. Consultar a secção Precauções. A Dual Endogenous Enzyme Blocking Solution e o polímero EnVision+ Dual Link System devem ser colocados à temperatura ambiente antes da imunocoloração. Do mesmo modo, todas as incubações obtêm o melhor desempenho à temperatura ambiente. Os reagentes e instruções fornecidos neste kit foram concebidos para se obter um desempenho óptimo. A diluição subsequente dos reagentes do kit ou a alteração dos tempos ou temperaturas de incubação podem originar resultados erróneos. Durante o procedimento de coloração, não permitir a secagem das secções de tecido. As secções de tecido secas poderão apresentar um aumento da coloração não específica. Cobrir as lâminas expostas a correntes de ar. Caso sejam utilizados tempos de incubação prolongados, colocar os tecidos num ambiente húmido. A sensibilidade do EnVision+ Dual Link System-HRP pode ser ampliada, aumentando os tempos de incubação das etapas 2 e 3 para 5 10 minutos. PROTOCOLO DE COLORAÇÃO MANUAL ETAPA 1 BLOCO DE ENZIMAS ENDÓGENAS Remover o tampão em excesso com pequenas pancadas. Utilizando um tecido sem fios (tal como um Kimwipe ou uma compressa de gaze), limpar cuidadosamente em redor da amostra para remover qualquer resto de líquido e manter o reagente na área determinada. Aplicar uma quantidade suficiente de Dual Endogenous Enzyme Block de modo a cobrir a amostra. Incubar 5 10 (±1) minutos. Lavar cuidadosamente com água destilada ou solução tampão de um frasco de lavagem (não incidir o fluxo directamente no tecido) e colocar num banho de tampão de lavagem recém-preparado. ETAPA 2 ANTICORPO PRIMÁRIO OU REAGENTE DE CONTROLO NEGATIVO Remover o excesso de tampão com ligeiras pancadas e limpar as lâminas, tal como anteriormente. Aplicar uma quantidade suficiente de anticorpo primário com uma diluição ideal ou reagente de controlo negativo de modo a cobrir a amostra. Incubar 30 (±1) minutos. Lavar cuidadosamente com solução tampão de um frasco de lavagem (não incidir o fluxo directamente no tecido) e colocar num banho de tampão de lavagem recém-preparado. Se o procedimento de coloração tiver que ser interrompido, as lâminas poderão ser mantidas num banho de tampão, após a incubação do anticorpo primário (etapa 2), durante até uma hora à temperatura ambiente sem que tal afecte o desempenho da coloração. ETAPA 3 POLÍMERO MARCADO - HRP Remover o excesso de tampão com ligeiras pancadas e limpar as lâminas, tal como anteriormente. Aplicar uma quantidade suficiente de polímero marcado de modo a cobrir a amostra. ( ) P04048PT_01/K4065/ p. 4/7

5 Incubar 30 (±1) minutos. Lavar as lâminas como indicado na etapa 2 e colocar num banho de tampão durante 5 (±1) minutos. ETAPA 4 SUBSTRATO-CROMOGÉNIO Limpar as lâminas, tal como anteriormente. Aplicar solução de substrato-cromogénio em quantidade suficiente para cobrir a amostra (consultar a secção Preparação dos reagentes). Incubar 5 10 (±1) minutos. Lavar suavemente com água destilada de um frasco de lavagem (não incidir o fluxo directamente sobre o tecido). Recolher os resíduos de substrato-cromogénio num recipiente para materiais perigosos, para uma eliminação correcta. ETAPA 5 CONTRASTANTE DE HEMATOXILINA (opcional) Imergir as lâminas num banho de hematoxilina aquosa. O tempo de incubação depende da concentração de hematoxilina utilizada. Lavar, com cuidado, num banho de água destilada. Mergulhar as lâminas 10 vezes num banho de 0,037 mol/l de amónia ou um agente corante azul semelhante. Lavar as lâminas num banho de água destilada ou desionizada durante 2 5 minutos. Prosseguir com a montagem. Montagem As amostras podem ser montadas e cobertas com um meio de montagem aquosa, como o Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (referência S3025). Para a montagem permanente, utilizar o Ultramount (referência S1964) ou o Permanent Mounting Medium (referência S3026). Nota: as lâminas podem ser interpretadas quando for conveniente. No entanto, pode ocorrer esbatimento se as lâminas estiverem expostas a luz forte durante um período de uma semana. Para minimizar o esbatimento, conservar as lâminas à temperatura ambiente (20 25 C), em local escuro. Controlo de qualidade Quaisquer diferenças no processamento dos tecidos e nos procedimentos técnicos introduzidas no laboratório do utilizador podem produzir uma variabilidade significativa nos resultados, sendo necessário a execução regular de controlos internos. Consultar as directrizes de controlo de qualidade do American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry e as referências de 3 a 5, para obter informações adicionais. Consultar a folha de especificações de cada anticorpo primário utilizado para obter informações mais detalhadas sobre a sensibilidade e imunoreactividade. Consultar General Instructions for Immunohistochemical Staining (Instruções Gerais para Coloração Imunohistoquímica) da Dako para obter informações adicionais sobre controlos positivos e negativos. Interpretação da coloração Limitações gerais Limitações específicas do produto Consultar General Instructions for Immunohistochemical Staining (Instruções Gerais para Coloração Imunohistoquímica) da Dako para obter as normas de interpretação. Consultar General Instructions for Immunohistochemical Staining (Instruções Gerais para Coloração Imunohistoquímica) da Dako relativamente às limitações gerais. A utilização de agentes de fixação velhos ou não tamponados, ou a exposição de tecidos a calor excessivo (acima de 60 ºC) durante o processamento podem resultar numa sensibilidade de coloração diminuída. A actividade da peroxidase endógena ou da pseudoperoxidase pode ser observada nas hemoproteínas, como a hemoglobina, mioglobina, citocromo, catalase e nos eosinófilos. 2,3 Esta actividade pode ser inibida através da incubação das amostras com o Dual Endogenous Enzyme Block do EnVision+ Dual Link System-HRP cinco a dez minutos antes da aplicação do anticorpo primário. Os esfregaços de sangue e medula óssea, bem como os tecidos congelados, podem ser tratados com este reagente. Como alternativa, pode ser utilizada uma solução de peróxido de hidrogénio/metanol. Alguns antigénios poderão ficar desnaturados com este procedimento. Os tecidos de pessoas infectadas pelo vírus da hepatite B que contenham o antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg) podem exibir coloração não específica com a peroxidase de rábano. 4 Os soros normais/não imunes, da mesma origem animal que o anti-soro secundário utilizado nas etapas de bloqueio, podem causar resultados falsos negativos ou falsos positivos, devido à presença de auto-anticorpos ou anticorpos naturais. Os reagentes fornecidos neste kit apresentam uma diluição ideal. A diluição subsequente pode originar a perda de detecção do antigénio. ( ) P04048PT_01/K4065/ p. 5/7

6 Resolução de problemas MANUAL Problema Causa provável Acção sugerida 1. Ausência de 1a. Os reagentes não estão a 1a. Rever a aplicação dos reagentes. coloração de qualquer uma das lâminas. ser utilizados na ordem correcta. 1b. Azida de sódio no banho 1b. Utilizar tampão, sem azida, recém-preparado. 2. Coloração fraca de todas as lâminas. 3. Coloração de fundo excessiva em todas as lâminas. de tampão. 2a. As secções retiveram demasiada solução após o banho de lavagem. 2b. O tempo de incubação das lâminas com anticorpos ou substrato não foi suficiente. 3a. As amostras contêm uma actividade de peroxidase elevada. 3b. A parafina não foi completamente removida. 3c. As lâminas não foram devidamente lavadas. 3d. Reacção ao substrato mais rápida do que o normal devido, por exemplo, à temperatura ambiente demasiado elevada. 3e. As secções secaram durante o procedimento de coloração. 3f. Ligação não específica dos reagentes à secção de tecido. 3g. Anticorpo demasiado 2a. Remover o excesso de solução com ligeiras pancadas antes de limpar em redor da secção. 2b. Rever os tempos de incubação recomendados. 3a. Utilizar um maior tempo de incubação de Dual Endogenous Enzyme Block. 3b. Utilizar banhos de tolueno ou xilol recémpreparados. Se forem coradas várias lâminas em simultâneo, o segundo banho de xilol deverá conter xilol recém-preparado. 3c. Utilizar soluções recém-preparadas nos banhos de tampão e nos frascos de lavagem. Utilizar Automation Buffer como tampão de lavagem (consultar a secção Preparação dos reagentes). 3d. Utilizar um tempo de incubação mais curto com a solução de substrato-cromogénio. 3e. Utilizar uma câmara húmida. Limpar apenas três a quatro lâminas de cada vez, antes de aplicar o reagente. 3f. Aplicar uma solução de bloqueio contendo uma proteína irrelevante (consultar a secção Interpretação da coloração). 3g. Utilizar uma maior diluição do anticorpo primário. concentrado. NOTA: contactar a Assistência Técnica da Dako e solicitar assistência, caso não seja possível atribuir o problema a uma das causas acima indicadas ou se a acção de correcção sugerida não solucionar o problema. É possível encontrar mais informação sobre técnicas de coloração e preparação das amostras no Handbook Immunochemical Staining Methods 5 (disponíveis na Dako), no Atlas of Immunohistology 6 e no Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 7 Bibliografia 1. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order Code C24-A:4 2. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook-immunochemical staining methods. Carpinteria 3rd Edition. Dako Tubbs RR, et al. Atlas of Immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Bibliografia adicional Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3-8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12 th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12 th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Bisgaard K. EnVision Plus-Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct ( ) P04048PT_01/K4065/ p. 6/7

7 Edition 07/15 ( ) P04048PT_01/K4065/ p. 7/7