Estas instruções aplicam-se ao Dako EnVision+, Peroxidase (Dako EnVision+, HRP).

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1 Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-mouse Código K ml Código K ml Utilização prevista Para utilização em diagnósticos in vitro. Estas instruções aplicam-se ao Dako EnVision+, Peroxidase (Dako EnVision+, HRP). Este produto destina-se a ser utilizado com anticorpos primários de ratinho fornecidos pelo utilizador para identificação qualitativa de antígenos, por microscopia óptica, em tecidos normais e patológicos envolvidos em parafina, tecidos em crióstato ou preparações de células. Podem ser utilizados tecidos processados em vários fixadores, incluindo etanol, B-5, líquido de Bouin, formalina de zinco e formalina tamponada neutra. Consultar "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (Instruções gerais para a coloração imunohistoquímica) ou "Instructions" (Instruções) dos procedimentos IHQ do sistema de detecção relativamente ao: (1) Princípio do procedimento, (2) Materiais necessários mas não fornecidos, (3) Armazenamento, (4) Preparação da amostra, (5) Procedimento de coloração, (6) Controlo de qualidade, (7) Resolução de problemas, (8) Interpretação da coloração, (9) Limitações gerais Resumo e explicação O EnVision+ System, HRP é uma técnica de coloração IHQ em duas etapas. Este sistema baseia-se num polímero marcado com HRP, que se conjuga com anticorpos secundários. O polímero marcado não contém avidina nem biotina. Em consequência, a coloração não específica resultante da actividade endógena de avidina-biotina no fígado, rins, tecidos linfóides e secções de crióstato é eliminada ou reduzida de forma significativa. O reagente do Dako EnVision+, HRP está pronto a ser utilizado. Este sistema é um método extremamente sensível e, em resultado, as diluições óptimas do anticorpo primário são até 20 vezes mais elevadas que as diluições utilizadas na técnica PAP tradicional e várias vezes superior às diluições utilizadas para os métodos ABC ou LSAB tradicionais. Este protocolo oferece um sistema de criação de sinal optimizado para detecção de antígenos presentes em baixas concentrações ou para títulos baixos de anticorpos primários. Os anticorpos primários produzidos em ratinhos reagem bem com o polímero marcado. A interpretação de qualquer coloração positiva ou da sua ausência deve ser complementada com estudos morfológicos e histológicos com controlos adequados. Princípios do procedimento Reagentes fornecidos Qualquer actividade da peroxidase endógena é interrompida ao incubar a amostra com um reagente de bloqueio da peroxidase endógena adequado. A amostra é depois incubada com um anticorpo primário de ratinho, adequadamente caracterizado e diluído, seguida pela incubação com o polímero marcado utilizando duas incubações sequenciais de 30 minutos. Deve notar-se que para os anticorpos que requerem digestão enzimática ou recuperação de alvos, pode ser necessário aumentar os tempos de incubação do anticorpo primário e do polímero marcado em 5 a 10 minutos. A coloração é concluída com uma incubação de 5 a 30 minutos com um substrato-cromogénio adequado. Código K4000: O material que se segue é suficiente para 150 secções de tecido, com base em 100 µl por secção: Quantidade Descrição 1 x 15 ml Labelled Polymer Polímero marcado com peroxidase conjugado com imunoglobulinas de cabra anti-ratinho em tampão Tris-HCl, contendo proteína estabilizadora e um agente antimicrobiano. Código K4001: O material que se segue é suficiente para 1100 secções de tecido, com base em 100 µl por secção: Quantidade Descrição 1 x 110 ml Labelled Polymer Polímero marcado com peroxidase conjugado com imunoglobulinas de cabra anti-ratinho em tampão Tris-HCl, contendo proteína estabilizadora e um agente antimicrobiano. ( ) PT_003 p. 1/6

2 Materiais necessários mas não fornecidos Papel absorvente Tecido de controlo, positivo e negativo Contracorante com base aquosa, como a Hematoxilina de Mayer ou Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (código S3309) Lamelas Água destilada Etanol, absoluto e a 95% Microscópio de luz (20x 800x) Meios de montagem, tal como Glycergel Mounting Medium (código C0563) ou Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (código S3025) ou meio de montagem permanente não aquoso, Ultramont (código S1964) Anticorpos primários e reagente de controlo negativo Lâminas, Poli-L-lisina revestidas ou Silanized Slides (código S3003) Frascos ou banhos de coloração Cronómetro (com capacidade para intervalos de 3 40 minutos) Frascos de lavagem Solução de tampão de lavagem Xileno, tolueno ou substitutos do xileno Além da lista anterior, para o K4000 ou K4001 EnVision+, Peroxidase, são necessários os seguintes reagentes: Reagente de bloqueio da peroxídase endógeno, como por exemplo o Dual Endogenous Enzyme Block (referência S2003) Solução de substrato-cromogénio, como por exemplo a AEC+ Substrate-Chromogen, Ready-to-Use (referência K3469) 110 ml, ou Liquid DAB+ (referência S2002) Materiais opcionais necessários mas não fornecidos Hidróxido de amónio, 0,015 mol/l diluído para 0,037 mol/l PAP Pen (código S2002) Precauções Preparação dos reagentes 1. Para utilizadores profissionais. 2. Não utilizar reagentes para além do fim do prazo de validade para o método de armazenamento indicado. Caso os reagentes sejam armazenados noutras condições além das que se encontram especificadas no folheto informativo do produto, o utilizador deve validar tais condições. 3. Não substituir os reagentes com reagentes de outros números de lotes ou de kits de outros fabricantes. 4. Caso sejam expostos a níveis de luz excessivos, as enzimas e os substratos-cromogénios podem ser afectados de forma adversa. Não armazenar os componentes do kit nem efectuar a coloração sob luz intensa, tal como luz solar directa. 5. Os tempos ou temperaturas de incubação diferentes dos especificados poderão fornecer resultados erróneos; qualquer eventual alteração deve ser validada pelo utilizador. 6. Tal como no caso de qualquer produto derivado de fontes biológicas, devem empregar-se processos de manuseamento apropriados. 7. Utilizar equipamento de protecção pessoal adequado para evitar o contacto com os olhos e a pele. 8. A solução que não tenha sido utilizada deve ser descartada em conformidade com os regulamentos locais, regionais e nacionais. Antes da coloração devem ser preparados os seguintes reagentes: Solução de tampão de lavagem TBST, Tris Buffered Saline with Tween (código S3006) 0,5 mol/l é o tampão de lavagem recomendado para a detecção IHQ manual e automatizada. TBS, Tris buffered Saline (código S1968) 0,05 mol/l e PBS, Phosphate Buffered Saline (code S3024) 0,02 mol/l são igualmente soluções tampão de lavagem adequadas para a coloração manual. Não se recomendam soluções tampão de lavagem com azida sódica. A azida sódica inactivará a peroxidase (HRP), produzindo uma coloração negativa. Armazenar o tampão não usado entre 2 e 8 C. Caso o tampão fique turvo, elimine-o. Pode ser utilizada água destilada para lavar o reagente de bloqueio da peroxidase, o substrato e o contracorante. Anticorpo primário A utilização dos anticorpos NP-Series Plus, prontos a serem utilizados, é optimizada e recomendada com os sistemas de detecção de sensibilidade elevada Dako Plus. A Dako disponibiliza igualmente anticorpos concentrados. A optimização dos anticorpos concentrados é requerida pelo utilizador final. As diluições devem ser preparadas utilizando Antibody Diluent (código S0809) ou um diluente contendo tampão Tris-HCI 0,05 mol/l com soroalbumina bovina (BSA) a 1%. Os anticorpos Dako N-Series, prontos a serem utilizados, não estão optimizados para utilização com os sistemas de detecção Dako Plus. Para a maior parte dos anticorpos primários utilizados com este kit, é suficiente um tempo de incubação de 30 minutos. Reagente de controlo negativo Quando utilizar os anticorpos Dako NP-Series Plus, prontos a serem utilizados, é recomendado como reagente de controlo negativo o Universal Negative Control+ (código NP015) optimizado para utilização com anticorpos NP-Series Plus de ratinho, prontos a serem utilizados. ( ) PT_003 p. 2/6

3 Um reagente de controlo negativo ideal contém um anticorpo que não exibe reactividade específica para tecidos humanos ou soro normal/não imune na mesma matriz/solução que o anticorpo primário diluído. O reagente de controlo negativo deve pertencer à mesma subclasse e espécie animal que o anticorpo primário, diluído com o mesmo diluente para uma concentração de imunoglobulina ou proteína igual à do anticorpo primário diluído. O período de incubação do reagente de controlo negativo deve corresponder ao do anticorpo primário. Contracorante O produto final corado da reacção de coloração é solúvel em álcool e deve ser utilizado apenas com contracorantes de base aquosa, tal como hematoxilina de Mayer ou Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (código S3309). Após a aplicação do contracorante de hematoxilina, efectuar uma lavagem completa em água destilada e, em seguida, mergulhar as lâminas de tecido num banho de amónia 0,037 mol/l ou num reagente de branqueamento semelhante. A solução aquosa de amónia 0,037 mol/l é preparada através da mistura de 2,5 ml de hidróxido de amónio 15 mol/l (concentrado) com 1 litro de água. A amónia 0,037 mol/l não usada pode ser armazenada à temperatura ambiente (20 25 C) num frasco bem fechado durante um período máximo de 12 meses. Consultar as orientações dos fabricantes relativamente a procedimentos de contraste alternativos. Meios de montagem São recomendados para montagem aquosa o Glycergel Mounting Medium (código C0563) ou o Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (S3025). Antes da utilização, o Glycergel deve ser aquecido a, pelo menos, 50 C. Pode ser igualmente utilizado o meio d e montagem permanente não aquoso Ultramount (código S1964). Armazenamento O EnVision+, HRP deve ser armazenado entre 2 e 8 C. Não congelar. Não utilizar após o fim do prazo de validade impresso nos frascos de reagente e no rótulo do produto. A alteração no aspecto de qualquer reagente, tal como precipitação, pode indicar instabilidade ou deterioração. Em tais casos, o(s) reagente(s) não deve(m) ser utilizado(s). Não há sinais óbvios que indiquem a instabilidade destes produtos. Por conseguinte, os controlos positivo e negativo devem ser testados em simultâneo com as amostras do doente. Caso se observe alguma coloração inesperada que não possa ser explicada por variações dos procedimentos de laboratório e se suspeite de um problema com o kit, contactar a Assistência Técnica da Dako. Preparação da amostra Tecidos envolvidos em parafina Consultar "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (Instruções gerais para a coloração imunohistoquímica) e/ou a Folha de especificações do anticorpo. Antes da coloração IHQ, os tecidos devem ser fixados e processados. A fixação impede a autólise e a putrefacção dos tecidos excisados, preserva a antigenicidade, melhora o índice de refracção dos constituintes dos tecidos e aumenta a resistência dos elementos celulares ao processamento dos tecidos. O processamento dos tecidos inclui a desidratação, limpeza de agentes desidratantes, infiltração de meios de impregnação, impregnação e corte dos tecidos. Os fixadores mais frequentes para as preparações de tecidos IHQ são discutidos em General Instructions for Immunohistochemical Staining (Instruções gerais para a coloração imunohistoquímica). Estas recomendações são fornecidas apenas como orientação. Os procedimentos óptimos devem ser determinados e verificados pelo utilizador. (Para obter informações específicas relativas à fixação e ao processamento de tecidos, consultar as referências bibliográficas 1 e 2.) Procedimento de coloração Notas do procedimento Antes da utilização, o utilizador deve ler estas instruções com cuidado e familiarizar-se com o conteúdo do produto. O reagente e as instruções fornecidas foram concebidos para um desempenho óptimo. A diluição subsequente do reagente do produto ou a alteração dos tempos ou temperaturas de incubação pode produzir resultados erróneos. Antes da imunocoloração, todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20 25 C). Do mesmo modo, todas as incubações devem ser efectuadas à temperatura ambiente. Durante o procedimento de coloração, não permitir a secagem das secções de tecido. As secções de tecido secas poderão apresentar um aumento da coloração não específica. Tapar as lâminas expostas a correntes de ar. Em caso de utilização de incubações prolongadas, colocar os tecidos em ambiente húmido. A sensibilidade do EnVision+, HRP pode ser ainda mais aumentada através do prolongamento dos tempos de incubação das etapas 2 e 3 em 5 a 10 minutos. ( ) PT_003 p. 3/6

4 Protocolo de coloração ETAPA 1 BLOQUEIO DE PEROXIDASE Remova o excesso de tampão com ligeiras pancadas. Utilizando um tecido sem fios (tal como Kimwipe ou uma compressa de gaze), limpe cuidadosamente em redor da amostra para remover qualquer resto de líquido e manter o reagente na área determinada. Aplique Peroxidase Block suficiente para cobrir a amostra. Incube 5 (±1) minutos. Lave suavemente com água destilada ou solução tampão de um frasco de lavagem (não incida o fluxo directamente sobre os tecidos) e coloque num banho de tampão recém-preparado. ETAPA 2 ANTICORPO PRIMÁRIO OU REAGENTE DE CONTROLO NEGATIVO Remova o excesso de tampão com ligeiras pancadas e limpe as lâminas, tal como anteriormente. Aplicar anticorpo primário com diluição óptima ou reagente de controlo negativo em quantidade suficiente para cobrir a amostra. Incube 30 (±1) minutos. Lave suavemente com solução tampão de um frasco de lavagem (não incida o fluxo directamente sobre o tecido) e coloque num banho de tampão recém-preparado. Se for necessário interromper o procedimento de coloração, as lâminas deverão ser conservadas num banho de tampão após a incubação do anticorpo primário (etapa 2), durante um período máximo de uma hora à temperatura ambiente (20 25 C), sem que tal afecte o desempenho da coloração. ETAPA 3 POLÍMERO MARCADO COM HRP ANTI-RATINHO Remova o excesso de tampão com ligeiras pancadas e limpe as lâminas, tal como anteriormente. Aplique Labelled Polymer suficiente para cobrir a amostra. Incube 30 (±1) minutos. Lave as lâminas como na etapa 2. ETAPA 4 SUBSTRATO-CROMOGÉNIO Limpe as lâminas como anteriormente. Aplique solução de substrato-cromogénio suficiente para cobrir a amostra. Incube durante 5 30 minutos. Lave suavemente com água destilada de um frasco de lavagem (não incida o fluxo directamente sobre o tecido). Recolha o restante substrato-cromogénio num recipiente para materiais perigosos, para uma eliminação correcta. ETAPA 5 CONTRACORANTE HEMATOXILINA (opcional) Mergulhe as lâminas num banho de hematoxilina aquosa (código S3309). A duração da incubação depende da concentração de hematoxilina utilizada. Lave, com cuidado, num banho de água destilada. Mergulhe as lâminas 10 vezes num banho de amónia 0,037 mol/l ou de um agente branqueador semelhante. Lave as lâminas num banho de água destilada ou desionizada durante 2 a 5 minutos. ETAPA 6 MONTAGEM As amostras podem ser montadas e cobertas com um meio de montagem com base aquosa, tal como Glycergel Mounting Medium (código C0563) ou Faramount (código S3025) ou um meio de montagem permanente não aquoso, Ultramount (código S1964). Nota: As lâminas podem ser lidas quando for conveniente. No entanto, poderá ocorrer algum esbatimento se as lâminas forem expostas a luz forte durante um período de uma semana. Para minimizar esta ocorrência, armazene as lâminas à temperatura ambiente (20 25 C ), em local escuro. Controlo de qualidade As diferenças no processamento dos tecidos e nas técnicas do procedimento no laboratório do utilizador podem produzir uma variabilidade significativa nos resultados, necessitando da execução regular de controlos internos em adição aos seguintes procedimentos. Para mais informações, consultar as orientações de controlo de qualidade do College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry (Programa de Certificação para Imunohistoquímica do Colégio de Patologistas Americanos) e as referências bibliográficas 3 a 5. Consultar a folha de especificações de cada um dos anticorpos primários utilizados, para obter pormenores relativamente à sensibilidade e à imunorreactividade. Consultar "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (Instruções gerais para a coloração imunohistoquímica) para obter mais informações sobre os controlos positivo e negativo. Interpretação da coloração Consultar General Instructions for Immunohistochemical Staining (Instruções gerais para a coloração imunohistoquímica) relativamente a orientações de interpretação. ( ) PT_003 p. 4/6

5 Limitações Consultar General Instructions for Immunohistochemical Staining (Instruções gerais para a coloração imunohistoquímica) relativamente às limitações gerais. A utilização de fixadores antigos ou não tamponados ou a exposição dos tecidos ao calor excessivo (superior a 60 C) durante o processamento, poderá originar um a diminuição da sensibilidade da coloração. A actividade da peroxidase endógena ou da pseudoperoxidase pode encontrar-se em proteínas heme, tais como a hemoglobina, mioglobina, citocromo e catalase, bem como em eosinófilos. 6,7 Esta actividade pode ser inibida através da incubação das amostras com reagente Peroxidase Block durante cinco minutos antes da aplicação do anticorpo primário. Os esfregaços de sangue e medula óssea e as secções de tecidos congeladas podem ser igualmente tratadas com este reagente. No entanto, este procedimento não elimina o pigmento castanho-avermelhado das proteínas heme. Em alternativa, pode ser utilizada uma solução de metanol-peróxido de hidrogénio. Alguns antígenos podem ser desnaturados com este procedimento. Os tecidos de pessoas infectadas pelo vírus da hepatite B que contenham o antígeno de superfície da hepatite B (AgHBs) podem exibir coloração não específica com a peroxidase de armorácio. 8 Os soros normais/não imunes provenientes da mesma fonte animal que os anti-soros secundários utilizados nas etapas de bloqueio podem originar resultados falsos negativos ou falsos positivos devido a autoanticorpos ou a anticorpos naturais. Os reagentes fornecidos neste kit foram diluídos para uma diluição óptima. A diluição subsequente pode originar falha na detecção do antígeno. Resolução de problemas Problema Causa provável Acção sugerida 1. Nenhuma lâmina está a ser corada. 2. Coloração fraca de todas as lâminas. 3. Coloração de fundo excessiva em todas as lâminas. 1a. Os reagentes não estão a ser utilizados na ordem correcta. 1b. Azida sódica. 2a. As secções retiveram demasiada solução após o banho de lavagem. 2b. As lâminas não foram incubadas durante um período de tempo suficiente. 3a. As amostras contêm elevada actividade da peroxidase endógena. 3b. A parafina não foi completamente removida. 3c. As lâminas não foram lavadas de forma adequada. 3d. Reacção com o substrato mais rápida que o normal devido, p. ex., a temperatura ambiente excessiva. 3e. As secções de tecido secaram durante o procedimento de coloração. 3f. Ligação não específica dos reagentes à secção de tecido. 3g. Anticorpo muito concentrado. 1a. Rever a aplicação dos reagentes. 1b. Utilizar tampão sem azida recém-preparado. 2a. Remover o excesso de solução com ligeiras pancadas antes de limpar em redor da secção de tecido. 2b. Rever os tempos de incubação recomendados. 3a.Utilizar tempo de incubação mais prolongado para bloqueio da peroxidase. 3b.Utilizar banhos de xileno ou tolueno recém-preparados. Caso sejam coradas várias lâminas em simultâneo, o segundo banho de xileno deve conter xileno recémpreparado. 3c. Utilizar soluções recémpreparadas nos banhos de tampão e frascos de lavagem. 3d. Utilizar um tempo de incubação mais curto com a solução de substratocromogénio. 3e. Utilizar uma câmara de atmosfera húmida. Limpar apenas três a quatro lâminas de cada vez, antes de aplicar o reagente. 3f. Aplicar uma solução de bloqueio contendo uma proteína não relacionada. 3g. Utilizar uma diluição superior do anticorpo primário. NOTA: Caso o problema não possa ser atribuído a qualquer uma das causas acima indicadas ou caso a acção correctiva sugerida não resolva o problema, contactar a Assistência Técnica da Dako para obter assistência. Informações adicionais sobre técnicas de coloração e preparação de amostras podem ser encontradas no Handbook -Immunochemical Staining Methods 2 (disponibilizado pela Dako), Atlas of Immunohistology 9 and Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 10 ( ) PT_003 p. 5/6

6 Referências Referências adicionais 1. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24 A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Edition 11/12 ( ) PT_003 p. 6/6