EGFR pharmdx. Referência K testes para utilização manual Edition 05/2015. Finalidade Para Utilização em Diagnóstico In Vitro.

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1 EGFR pharmdx Referência K testes para utilização manual Edition 05/2015 Finalidade Para Utilização em Diagnóstico In Vitro. O ensaio EGFR pharmdx consiste num sistema de kit de imuno-histoquímica (IHC) qualitativa para identificar a expressão do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) em tecidos normais e neoplásicos fixados por rotina para avaliação histológica. O EGFR pharmdx detecta especificamente a proteína EGFR (HER1) nas células que exprimem o EGFR. O EGFR pharmdx está indicado para auxiliar na identificação de doentes com cancro colorectal elegíveis para o tratamento com ERBITUX (cetuximab) ou Vectibix (panitumumab). Resumo e explicação Introdução O factor de crescimento epidérmico é um receptor de transmembrana de 170 kd codificado pelo gene HER1 humano. A proteína EGFR contém um domínio de ligação a ligando extracelular, uma região transmembrana e um domínio intracelular com actividade intrínseca da proteína tirosina cinase. O EGFR é homólogo de outros membros da família de receptores EGF/erbB, incluindo o HER2/erbB2 ou neu, HER3/erbB3 e HER4/erbB4. 1,2 A proteína EGFR é expressa por várias células normais, incluindo muitos tipos de células epiteliais e tumores derivados destas células. 3-9 Os tipos de células não epiteliais que expressam o EGFR incluem o músculo liso, fibroblastos e nervos. 10 Especificidade O EGFR anti-humano monoclonal de ratinho, clone 2-18C9 é fornecido como um sobrenadante da cultura de tecidos de hibridoma produzido a partir de um ratinho imunizado com EGFR precipitado imunologicamente da linha celular A431 (carcinoma epidermóide humano). Os estudos de mapeamento de epítopos indicaram que o anticorpo reconhece um epítopo na região extracelular rica em cisteína do subdomínio S2 gerador de moléculas e proximal ao domínio transmembrana. Um outro mapeamento dos aminoácidos críticos indica que o epítopo é conformacional e depende da formação de pontes de dissulfeto na molécula nativa. 11 Demonstrou-se que este clone de anticorpo monoclonal não apresenta uma reacção cruzada com o HER2, HER3, ou HER4 nem com o marcador vectorial, myc. Observa-se, normalmente, uma coloração citoplásmica; no entanto, o teste deverá ser repetido caso se verifique uma coloração citoplásmica significativa que dificulte a distinção da coloração da membrana de diagnóstico e a interpretação dos resultados. Princípio do procedimento O sistema de kit IHC EGFR pharmdx contém os reagentes necessários para completar um procedimento de coloração IHC para amostras fixadas por rotina e impregnadas em parafina. Após a incubação com o anticorpo monoclonal primário, clone 2-18C9, contra a proteína EGFR humana, este kit utiliza um reagente de visualização pronto para utilizar, baseado na tecnologia de dextrano. Este reagente é constituído por moléculas de anticorpo secundário de caprino anti-ratinho e moléculas de peroxidase de rábano (horseradish peroxidase) ligadas a uma estrutura base de polímero dextrano comum eliminando, assim, a necessidade de uma aplicação sequencial do anticorpo de ligação e do conjugado de peroxidase. A conversão enzimática do cromogénio posteriormente adicionado resulta na formação de um produto de reacção visível no local do antigénio. Em seguida, é possível aplicar um contrastante e uma lamela na amostra. Os resultados são interpretados utilizando um microscópio óptico. As lâminas de controlo contêm duas linhas celulares humanas fixadas em formol e impregnadas em parafina, com intensidades de coloração de 2+ e 0, e são fornecidas para controlo de qualidade do desempenho dos reagentes do kit. Reagentes EGFR pharmdx para utilização manual. Os materiais apresentados são suficientes para 35 testes (35 lâminas incubadas com Anticorpo primário contra a proteína EGFR e 35 lâminas incubadas com o Reagente de controlo negativo correspondente). O número de testes baseia-se na utilização de 3 gotas por lâmina de cada um dos reagentes prontos para utilizar. O kit fornece materiais suficientes para, no máximo, 5 processos de coloração individuais. ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 1/14

2 Materiais fornecidos Quantidade Descrição 1x8 ml Proteinase K < 0,1% Enzima proteolítica proteinase K diluída num tampão Tris-HCl com 0,015 mol/l de azida de sódio. 1x8 ml Bloqueio de peroxidase Peróxido de hidrogénio a 3%. 1x4 ml Anticorpo monoclonal IgG 1 de ratinho EGFR pharmdx Sobrenadante da cultura de tecidos de anticorpo monoclonal IgG 1 de EGFR anti-humano (clone 2-18C9) de ratinho num tampão Tris-HCl, com proteína estabilizadora e 0,015 mol/l de azida de sódio. 1x4 ml Reagente de controlo negativo IgG 1 de ratinho Sobrenadante da cultura de tecidos de anticorpo monoclonal IgG 1 de ratinho num tampão Tris-HCl, com proteína estabilizadora e 0,015 mol/l de azida de sódio. 1x8 ml Polímero marcado, HRP Polímero dextrano conjugado com peroxidase de rábano e imunoglobulinas de caprino anti-ratinho, isoladas por afinidade. Fornecido em tampão Tris-HCl, com proteína estabilizadora e um agente antimicrobiano. 1x10 ml Tampão de substrato DAB+ Solução tampão de substrato, ph 7,5, com peróxido de hidrogénio a < 0,1%, estabilizadores, intensificadores e um agente antimicrobiano. 1x1 ml Cromogénio líquido DAB+ 3,3'-diaminobenzidina a 5% em solução de cromogénio. 1x1 L Tampão de lavagem 10x Solução salina com tampão Tris com Tween 20, ph 7,6. 5 lâminas Lâminas de controlo EGFR pharmdx TM Cada lâmina contém secções de duas linhas celulares humanas aglomeradas, fixadas em formol e impregnadas em parafina, que representam um nível moderado de expressão da proteína EGFR e ausência de expressão de EGFR. As classificações de coloração IHC dos aglomerados de células são 2+ e 0. Linha celular: CAMA-1 Nível de expressão: 0 Linha celular: HT-29 Nível de expressão: 2+ ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 2/14

3 Materiais necessários, mas não fornecidos Hidróxido de amónio, 15 mol/l, diluído para 0,037 mol/l Contrastante: Hematoxilina com base alcoólica ou aquosa como, por exemplo, Dako Hematoxylin (referência S3302) ou Dako s Automation Hematoxylin (referência S3301) Lamelas Água destilada ou desionizada (água de qualidade reagente) Estufa de secagem, com capacidade para manter C Etanol, absoluto e a 95% Câmara de atmosfera húmida Microscópio óptico (ampliação de objectiva de 4x 40x) Meio de montagem como, por exemplo, Dako Faramount (referência S3025), ou Dako Glycergel (referência C0563) ou Dako Ultramount (referência S1964) Tecidos positivos e negativos para utilizar como controlos do processo (consultar a secção Controlo de qualidade) Lâminas, Fisher SuperFrost Plus, lâminas revestidas com poli-l-lisina, lâminas carregadas, ou Dako Silanized Slides (referência S3003) (consultar a secção Preparação das amostras) Frascos ou banhos de coloração Cronómetro (com intervalos de 2 a 30 minutos) Frasco de lavagem Xilol, tolueno ou substitutos de xilol Nota: Todos os reagentes incluídos ou disponíveis em separado como, por exemplo, o Dako Wash Buffer (referência S3006) são formulados especificamente para utilização com este teste. De forma que o teste tenha o desempenho especificado, não podem ser feitas substituições. Preparação das amostras As amostras de biópsias devem ser manuseadas de forma a preservar os tecidos para a coloração IHC. Devem ser utilizados para todas as amostras métodos padrão de processamento de tecidos. 13 As amostras conservadas nos seguintes agentes de fixação são adequadas para serem analisadas com o EGFR pharmdx: formol neutro tamponado a 10% (v/v), formol não tamponado a 10% (v/v), formol não tamponado a 25% (v/v), AFA (Álcool - Formol - Ácido acético), Fixador Pen-fix da Richard-Allen Scientific e Fixador de Bouin. Os tecidos fixados em Anatech PreFer não são adequados para serem analisados no EGFR pharmdx. A utilização do EGFR pharmdx em tecidos fixados com PreFer resulta numa conservação insatisfatória da morfologia e poderá provocar resultados erróneos. 14 Secções impregnadas em parafina Os tecidos processados por rotina e os tecidos impregnados em parafina são adequados para utilização. As amostras da biopsia devem ser divididas em blocos de 3 ou 4 mm de espessura e fixadas durante o período de tempo adequado para o agente de fixação. Os tecidos são depois desidratados e limpos numa série de álcoois e xilol, seguida pela infiltração com parafina derretida. A temperatura da parafina não deve exceder os 60 C. Os blocos de tecido adequadam ente fixados e impregnados que expressem a proteína EGFR manter-se-ão indefinidamente antes do seccionamento e da montagem na lâmina, desde que conservados em local fresco (15 25 C). 13,15 As amostras de tecido devem ser cortadas em secções de 3 5 µm. Após o seccionamento, os tecidos devem ser montados em lâminas e colocados em suportes de secagem. Recomenda-se a utilização das seguintes lâminas: Fisher SuperFrost Plus, Dako Silanized (referência S3003), lâminas revestidas com poli-l-lisina ou lâminas carregadas. Os suportes de lâminas devem ser colocados sobre papel absorvente, batendo para remover a água retida sob a parafina e no vidro e, em seguida, secos à temperatura ambiente durante uma hora. O suporte de lâminas deve, em seguida, ser colocado numa incubadora a C, durante uma hora. Qualquer excess o de água remanescente nas lâminas após a remoção da incubadora deve ser retirado batendo ligeiramente com as lâminas sobre papel e secando-as durante mais uma hora na incubadora. Depois de serem retiradas da incubadora, as lâminas devem manter-se à temperatura ambiente até arrefecerem e a parafina endurecer. Para preservar a antigenicidade, as secções de tecido montadas nas lâminas [Fisher SuperFrost Plus, lâminas revestidas com poli-l-lisina, lâminas carregadas ou Dako Silanized Slides (referência S3003)], devem ser coradas num período de 2 meses após o seccionamento, quando conservadas à temperatura ambiente (20 25 C). 14 Consultar o Manual da Dako: Immunochemical Staining Methods (Métodos de coloração imuno-histoquímica) 16 ou as referências bibliográficas 13 e 15 para obter mais pormenores sobre a preparação de amostras. A utilização deste teste em tecidos descalcificados não foi validada e, por sua vez, não é recomendada. Devem ser preparadas, na mesma altura, as lâminas necessárias para a avaliação de EGFR e a verificação da presença de tumores. Recomendam-se, no mínimo, 5 lâminas, 1 lâmina para a presença de tumores, 2 lâminas para a avaliação da proteína EGFR (uma lâmina para o anticorpo primário e outra para o Reagente de controlo negativo) e 2 lâminas de reserva. Precauções 1. Para utilizadores profissionais. 2. Este produto contém azida de sódio (NaN 3), um produto químico altamente tóxico na forma pura. Em situações de concentração do produto, embora não sendo classificadas como perigosas, as acumulações de NaN 3 podem reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar o produto, adicionar água abundante para evitar a acumulação de azida na canalização Tal como acontece com qualquer produto de origem biológica, deverão utilizar-se procedimentos de manuseamento adequados relativamente às amostras e reagentes. 4. Minimizar a contaminação microbiana dos reagentes para evitar uma coloração não específica. 5. Os tempos e as temperaturas de incubação ou métodos diferentes dos especificados podem originar resultados erróneos. 6. Os reagentes apresentam uma diluição óptima. A diluição subsequente pode originar a perda de coloração do antigénio. ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 3/14

4 7. Não substituir os anticorpos primários ou os reagentes de controlo negativo por anticorpos primários nem por reagentes de controlo negativo de lotes de fabrico diferentes (os números de lote são indicados nas etiquetas dos frascos) ou por reagentes de outros fabricantes. 8. Caso sejam expostos a níveis de luz excessivos, o Polímero marcado, o Cromogénio líquido DAB+ e a solução de Substratocromogénio DAB+ preparada podem ser afectados de forma adversa. Não conservar os componentes do sistema nem efectuar a coloração sob luz intensa como, por exemplo, luz solar directa. 9. Usar equipamento de protecção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. 18 A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações federais, estatais e locais. 10. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível para utilizadores profissionais, mediante pedido. 11. Regra geral, as pessoas com idade inferior a 18 anos não estão autorizadas a trabalhar com este produto. Os utilizadores devem ser cuidadosamente instruídos sobre os procedimentos de trabalho adequados, as propriedades perigosas do produto e as instruções de segurança necessárias. Consulte a Ficha de segurança (SDS) para obter informações adicionais. Perigo DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Pode provocar cancro. H341 Suspeito de provocar anomalias genéticas. P201 Pedir instruções específicas antes da utilização. P202 Não manuseie o produto antes de ter lido e percebido todas as precauções de segurança. P281 Usar o equipamento de protecção individual exigido. P308 + P313 EM CASO DE exposição ou suspeita de exposição: Consulte um médico. P405 Armazenar em local fechado à chave. P501 Eliminar o conteúdo e o recipiente em conformidade com a regulamentação local, regional, nacional e internacional. Atenção Wash Buffer (10X): 5-10% Sodium chloride, 5-10% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride H319 Provoca irritação ocular grave. P280 Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Usar vestuário de protecção. P264 Lavar as mãos cuidadosamente após manuseamento. P305 + P351 + P338 SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar. P337 + P313 Caso a irritação ocular persista: consulte um médico. Conservação Conservar o sistema de kit EGFR pharmdx entre 2 e 8 C. As lâminas de controlo devem ser igualmente conservadas entre 2 e 8ºC. Não utilizar o kit após o fim do prazo de validade impresso no exterior da embalagem. Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto, por isso, devem processar-se controlos positivos e negativos simultaneamente com as amostras de doente. Caso os reagentes sejam conservados noutras condições além das que se encontram especificadas no folheto informativo, o utilizador deve validar tais condições. 12 Preparação dos reagentes Antes da coloração devem ser preparados os seguintes reagentes: Solução tampão de lavagem Preparar uma quantidade suficiente de tampão de lavagem, diluindo Tampão de lavagem 10x, 1:10 utilizando água destilada ou desionizada (água de qualidade reagente) para as etapas de lavagem. Eliminar o tampão, caso este fique turvo. Solução de Substrato-cromogénio DAB+ Antes de ser utilizada, esta solução deve ser completamente misturada. O desenvolvimento de precipitado na solução não afecta a qualidade da coloração. O procedimento seguinte produz 1 ml de Solução de substrato-cromogénio DAB+. ETAPA 1. Transferir 1 ml de Tampão de substrato DAB+ para um tubo de ensaio. ETAPA 2. Adicionar uma gota de Cromogénio líquido DAB+. Misturar e aplicar nas secções de tecido com uma pipeta. A Solução de substrato-cromogénio (DAB) permanece estável durante, aproximadamente, 5 dias quando conservada entre 2 e 8 C. Nota importante: A cor do Cromogénio líquido DAB+ no frasco pode variar de incolor a castanho-lavanda claro. Tal não afectará o desempenho deste produto. Diluir de acordo com as orientações acima fornecidas. A adição de Cromogénio líquido DAB+ em excesso ao Tampão de substrato DAB+ resultará na deterioração do sinal positivo. ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 4/14

5 Contrastante Se necessário, preparar uma solução aquosa de amónia para dar uma cor azul ao contrastante. A solução aquosa de amónia (0,037 mol/l) é preparada através da mistura de 2,5 (±0,5) ml de hidróxido de amónio, 15 mol/l, (concentrado) com 1 litro de água de qualidade reagente. A solução aquosa de amónia 0,037 mol/l não usada pode ser conservada à temperatura ambiente (20 25 C), num frasco bem fechado, durante um período máximo de 12 meses. Meio de montagem São recomendados para montagem aquosa os meios de montagem como, por exemplo, o Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (referência S3025) ou o Dako Glycergel Mounting Medium (referência C0563). Antes da utilização, liquefazer o Glicerogel, aquecendo-o até atingir aproximadamente 40(±5) C. É igualmente adequado um meio de montagem permanente não aquoso como, por exemplo, o Dako Ultramount (referência S1964). Procedimento de coloração Notas do procedimento Antes da utilização, o utilizador deve ler estas instruções com cuidado e familiarizar-se com todos os componentes (consultar a secção Precauções). Antes da imunocoloração, todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente (20 25 C). Do mesmo mod o, todas as incubações devem ser realizadas à temperatura ambiente. Durante o procedimento de coloração, não permitir a secagem das secções de tecido. As secções de tecido secas poderão apresentar um aumento da coloração não específica. Para evitar a secagem dos tecidos, colocar as lâminas numa câmara de atmosfera húmida. Desparafinização e rehidratação Antes da coloração, as lâminas de tecido devem ser desparafinizadas, de forma a remover o meio de impregnação, e rehidratadas. Remover totalmente a parafina. A presença de resíduos de meio de impregnação aumentará a coloração não específica. ETAPA 1. Colocar as lâminas num banho de xilol e incubar durante 5 (±1) minutos. Mudar os banhos e repetir uma vez. ETAPA 2. Remover o excesso de líquido com ligeiras pancadas e colocar as lâminas em etanol absoluto durante 3 (±1) minutos. Mudar os banhos e repetir uma vez. ETAPA 3. Remover o excesso de líquido com ligeiras pancadas e colocar as lâminas em etanol a 95% durante 3 (±1) minutos. Mudar os banhos e repetir uma vez. ETAPA 4. Remover o excesso de líquido com ligeiras pancadas e colocar as lâminas em água de qualidade reagente durante 5 (±1) minutos. Iniciar o procedimento de coloração conforme delineado na Secção C, Protocolo de coloração. As soluções de xilol e álcool devem ser substituídas após 40 lâminas. Os substitutos do xilol ou tolueno como, por exemplo, o Histoclear podem ser utilizados em vez de xilol. Protocolo de coloração ETAPA 1. Digestão proteolítica da Proteinase K Remover o excesso de água de qualidade reagente com ligeiras pancadas. Utilizando um tecido sem fios (tal como um Kimwipe ou uma compressa de gaze), limpar cuidadosamente em redor da amostra para remover qualquer resto de líquido e manter os reagentes na área determinada. Aplicar solução de Proteinase K suficiente para cobrir a amostra (3 gotas no mínimo 100 µl). Incubar 5 (±0,5) minutos. Lavar suavemente com água de qualidade reagente a partir de um frasco de lavagem (não incidir o fluxo directamente sobre o tecido). Colocar num banho de água de qualidade reagente recém-preparado durante 5 (±1) minutos. O EGFR pharmdx inclui pré-tratamento através de uma etapa de digestão da enzima proteolítica. Ocasionalmente, poderá verificar-se uma digestão excessiva das secções de tecido, resultando na rotura das membranas celulares e da arquitectura global dos tecidos. Processar o ensaio, prestando especial atenção à duração da etapa de digestão proteolítica. Nota: Se a digestão excessiva continuar a ser um problema, os tecidos fixados em formol neutro tamponado a 10% podem ser pós-fixados em formol neutro tamponado a 10% durante 10 minutos após a desparafinização. Consultar procedimento seguinte: Procedimento pós-fixação 1. Desparafinizar as secções e imergir em água de qualidade reagente. 2. Imergir as lâminas em formol neutro tamponado a 10% durante 10 minutos. 3. Lavar as lâminas duas vezes em água desionizada ou destilada. 4. Prosseguir com o procedimento de coloração EGFR pharmdx. ETAPA 2. Bloqueio de peroxidase Remover o excesso de água com ligeiras pancadas e limpar as lâminas, tal como anteriormente. Aplicar solução de Bloqueio de peroxidase suficiente para cobrir a amostra (3 gotas no mínimo 100 µl). Incubar 5 (±1) minutos. Lavar suavemente com Tampão de lavagem a partir de um frasco de lavagem (não incidir o fluxo directamente sobre o tecido). Colocar num banho de Tampão de lavagem recém-preparado durante 5 (±1) minutos. ETAPA 3. Anticorpo primário ou Reagente de controlo negativo Colocar as lâminas numa câmara de atmosfera húmida durante as incubações com o Anticorpo primário/reagente de controlo negativo e Polímero marcado para evitar a secagem dos tecidos. Remover o excesso de tampão com ligeiras pancadas e limpar as lâminas, tal como anteriormente. ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 5/14

6 Aplicar solução de Anticorpo primário ou Reagente de controlo negativo suficiente para cobrir a amostra (3 gotas no mínimo 100 µl). Incubar 30 (±1) minutos numa câmara de atmosfera húmida. Lavar as lâminas como na etapa 2. ETAPA 4. Polímero marcado, HRP Remover o excesso de tampão com ligeiras pancadas e limpar as lâminas, tal como anteriormente. Aplicar solução de Polímero marcado suficiente para cobrir a amostra (3 gotas no mínimo 100 µl). Incubar 30 (±1) minutos numa câmara de atmosfera húmida. Lavar as lâminas como na etapa 2. ETAPA 5. Solução de Substrato-cromogénio DAB+ Remover o excesso de tampão com ligeiras pancadas e limpar as lâminas, tal como anteriormente. Aplicar Solução de substrato-cromogénio DAB+ suficiente para cobrir a amostra (3 gotas no mínimo 100 µl). Incubar 10 (±1) minutos. Lavar suavemente com água de qualidade reagente a partir de um frasco de lavagem (não incidir o fluxo directamente sobre o tecido). Recolher os resíduos de Solução de substrato-cromogénio DAB+ para um recipiente para materiais perigosos, para uma eliminação correcta. Colocar num banho de água de qualidade reagente durante 2 a 5 minutos. Contrastante (instruções para a hematoxilina) O produto final colorido da reacção de coloração é insolúvel em água e álcool. Pode ser utilizada a hematoxilina com base alcoólica ou aquosa como, por exemplo, Dako Hematoxylin (referência S3302) ou Dako Automation Hematoxylin (referência S3301). Não utilizar contrastantes regressivos. ETAPA 1. Imergir as lâminas num banho de hematoxilina. Incubar durante 2 a 5 minutos, dependendo da concentração de hematoxilina utilizada. ETAPA 2. Lavar, com cuidado, num banho de água de qualidade reagente. Certificar-se de que foram removidos todos os resíduos de hematoxilina. Opcional: Mergulhar as lâminas 10 vezes num banho de 0,037 mol/l de solução aquosa de amónia (consultar a secção Preparação Preparação dos reagentes). Esta etapa não é necessária quando for utilizada Dako Hematoxylin (referência S3302) ou Dako Automation Hematoxylin (referência S3301). Nota: Recomenda-se vivamente a utilização de Dako Hematoxylin (referência S3302) ou Dako Automation Hematoxylin (referência S3301). Utilizando uma incubação de 5 minutos, este contrastante produz um produto final de cor púrpura clara/azul que não oculta a imunocoloração específica. Uma contrastação intensa poderá ocultar uma expressão de EGFR fraca. ETAPA 3. Lavar, com cuidado, num banho de água de qualidade reagente durante 2 a 5 minutos. Montagem São recomendados para montagem aquosa os meios de montagem como, por exemplo, o Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (referência S3025) ou o Dako Glycergel Mounting Medium (referência C0563). Antes da utilização, liquefazer o Glicerogel, aquecendo-o até atingir aproximadamente 40(±5) C. É igualmente adequado um meio de montagem permanente não aquoso como, por exemplo, o Dako Ultramount (referência S1964). Nota: As lâminas podem ser lidas quando for conveniente. No entanto, poderá ocorrer algum esbatimento se as lâminas forem cobertas com um meio de montagem aquoso e expostas a luz intensa. Para minimizar o esbatimento, conservar as lâminas à temperatura ambiente (20 25 C), em local escuro. Controlo de qualidade Quaisquer desvios dos procedimentos recomendados para a fixação de tecidos, processamento e impregnação no laboratório do utilizador podem produzir uma variabilidade significativa nos resultados, sendo necessária a execução regular de controlos internos, em adição às Lâminas de controlo fornecidas pela Dako. Nos EUA, consultar as orientações do controlo de qualidade do College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry. Consultar igualmente a CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline, 19 e as referências bibliográficas 20 a 23 para mais informações. Lâminas de controlo EGFR pharmdx (fornecidas) Cada uma das lâminas de controlo fornecidas contém duas linhas celulares humanas aglomeradas, fixadas em formol e impregnadas em parafina, com intensidades de coloração de 2+ e 0. Em cada procedimento de coloração deve ser corada uma lâmina. A avaliação das linhas celulares das lâminas de controlo fornecidas pela Dako indica a validade do processo de coloração. Estas lâminas não deverão ser utilizadas para auxiliar a interpretação dos resultados dos doentes. Tecido de controlo positivo Os controlos devem consistir em amostras de autópsia/biopsia/cirúrgicas frescas fixadas, processadas e impregnadas logo que possível, da mesma forma que a(s) amostra(s) do doente. Os controlos de tecido positivo são indicadores de tecidos correctamente preparados e de técnicas de coloração correctas. Em cada processo de coloração deve ser incluído um controlo de tecido positivo para cada conjunto de condições de teste. Os tecidos utilizados para os controlos de tecido positivos devem exibir uma coloração positiva fraca, de forma a que seja possível detectar alterações subtis na sensibilidade do anticorpo primário. As lâminas de controlo fornecidas com este sistema ou as amostras processadas de forma diferente em relação à(s) amostra(s) dos doentes validam apenas o desempenho do reagente e não confirmam a preparação dos tecidos. ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 6/14

7 Os controlos de tecidos positivos conhecidos devem ser utilizados apenas para monitorização do desempenho correcto dos tecidos processados e dos reagentes de teste, NÃO para auxiliar na formulação de um diagnóstico específico das amostras dos doentes. Caso os controlos de tecidos positivos não demonstrem uma coloração positiva apropriada, devem considerar-se inválidos os resultados obtidos com as amostras de teste. Entre os tipos de células normais que podem ser utilizadas como um EGFR positivo fraco encontram-se células epiteliais glandulares da próstata e o epitélio normal brônquico e pulmonar. Uma vez que o padrão de coloração de EGFR é heterogéneo, os elementos de tecidos normais que apresentem uma coloração fraca também podem ser negativos. O perineuro constitui um forte controlo de tecido interno positivo. As células normais que demonstram uma coloração positiva de EGFR moderada incluem as células do colo uterino e pele. Tecido de controlo negativo Utilizar um controlo de tecido negativo (conhecido como sendo negativo para a proteína EGFR) fixado, processado e impregnado de forma idêntica à(s) amostra(s) dos doentes com cada processo de coloração para confirmar a especificidade do anticorpo primário e fornecer uma indicação da coloração de fundo específica. A variedade de diferentes tipos de células presentes na maior parte das secções de tecido oferece locais de controlo negativo interno (tal deve ser confirmado pelo utilizador). Caso ocorra coloração específica no tecido de controlo negativo, devem considerar-se inválidos os resultados obtidos com as amostras dos doentes. Os elementos de tecidos que podem ser utilizados como controlos negativos incluem os miócitos cardíacos. As células acinosas pancreáticas são também negativas para a EGFR, ao passo que o epitélio do canal biliar e pancreático apresenta uma coloração positiva. Os linfócitos, quando presentes, não coram com EGFR pharmdx e podem ser utilizados como um controlo interno negativo. Reagente de controlo negativo não específico Utilizar o Reagente de controlo negativo fornecido, em vez do anticorpo primário, com uma secção de cada uma das amostras dos doentes para avaliar a coloração não específica e permitir uma melhor interpretação da coloração específica do local do antigénio. O período de incubação do Reagente de controlo negativo deve corresponder ao do anticorpo primário. Verificação do ensaio Antes da utilização inicial de um sistema de coloração num procedimento de diagnóstico, o utilizador deve verificar o desempenho do ensaio, testando-o numa série de tecidos internos com características de desempenho IHC conhecidas, representando tecidos positivos e negativos conhecidos. Estes procedimentos de verificação devem ser repetidos para cada novo lote. Consultar os procedimentos de controlo de qualidade, previamente delineados nesta secção do folheto informativo do produto, e os requisitos de controlo de qualidade do CAP Certification Program for Immunohistochemistry e/ou a CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline. 19 Os carcinomas com intensidades de coloração conhecidas para a proteína EGFR e os tecidos negativos são adequados para verificação do ensaio. Tabela 1: O objectivo do controlo de qualidade diário Tecido: Fixado e processado tal como uma amostra de doente Lâmina de controlo fornecida pela Dako. Controlo positivo: Tecidos ou células que contenham o antigénio alvo a ser detectado (podem situar-se em tecidos do doente). O controlo ideal é um tecido com coloração positiva fraca para ser mais sensível ao anticorpo ou à degradação antigénio. Controlo negativo: Tecidos ou células que se esperam que sejam negativos (podem situar-se nos tecidos do doente ou nos tecidos de controlo positivo). Anticorpo específico e sistema de detecção Controla apenas o procedimento de coloração. A avaliação das linhas celulares das lâminas de controlo fornecidas pela Dako indica a validade do processo de coloração. Controla todas as etapas da análise. Valida os reagentes e procedimentos utilizados para a coloração EGFR. Detecção de reactividade cruzada não intencional com anticorpos a células/componentes celulares. Fundo: Anticorpo não específico (Reagente de controlo negativo, IgG 1 de ratinho) fornecido Detecção de coloração de fundo não específica. Detecção de coloração de fundo não específica. Tecido do doente. Detecção de coloração específica. Detecção de coloração de fundo não específica. Interpretação do procedimento de coloração A avaliação da lâmina deve ser efectuada por um patologista, utilizando um microscópio óptico. Todas as avaliações devem ser realizadas na região tumoral da amostra. Para avaliação da coloração imuno-histoquímica e dos seus resultados, é apropriada uma amplificação com objectiva de 10x ou 20x. Utilizar células intactas para a interpretação dos resultados de coloração; as células necróticas ou degeneradas apresentam, normalmente, uma coloração não específica. 19 Em cada kit EGFR pharmdx estão incluídas linhas celulares positivas e negativas para validar os processos de coloração, sempre que se efectua um ensaio. Uma coloração apropriada das linhas celulares de controlo demonstra que o ensaio EGFR pharmdx está a funcionar correctamente. A ausência de coloração da membrana da linha celular de controlo CAMA-1 (0) e uma coloração de membrana castanha clara completa ou incompleta na linha celular de controlo HT-29 (2+) indicam que o processo de coloração é válido. Se a intensidade de ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 7/14

8 coloração da linha celular de controlo positivo for demasiado fraca ou demasiado forte poderá ocorrer um resultado falso negativo ou falso positivo e o teste deve ser repetido. No Guia de Interpretação EGFR pharmdx estão disponíveis imagens de referência. O EGFR pharmdx cora principalmente as membranas celulares, demonstrando quer uma coloração circunferencial incompleta como completa. O padrão de imunocoloração é, frequentemente, heterogéneo, exibindo várias intensidades de coloração num único neoplasma. Foi igualmente observada uma coloração do citoplasma e espaços extracelulares. Observa-se, normalmente, uma coloração citoplásmica, no entanto, o teste deverá ser repetido caso se verifique uma coloração citoplásmica significativa que dificulte a distinção da coloração da membrana e a interpretação dos resultados. Os tumores devem ser apresentados como positivos ou negativos para o EGFR, utilizando a coloração da membrana como estrutura de avaliação. Uma célula tumoral é considerada positiva para o EGFR se possuir qualquer coloração de membrana superior ao nível de fundo, com ou sem uma circunferência completa. Um tumor sem nenhuma coloração de membrana superior ao nível de fundo em qualquer célula tumoral é apresentado como um tumor negativo para o EGFR. Consoante a duração da incubação e a potência da hematoxilina utilizada, a contrastação irá resultar numa coloração azul pálido a escuro dos núcleos das células. Uma contrastação excessiva ou incompleta poderá comprometer a interpretação dos resultados. Tabela 2: Resultados da coloração EGFR pharmdx Comunicar o resultado ao médico responsável pelo tratamento Tumor negativo para EGFR Tumor positivo para EGFR Definição Ausência de coloração de membrana superior ao nível de fundo em todas as células tumorais. A coloração positiva para o EGFR é definida como qualquer coloração IHC das membranas das células tumorais superior ao nível de fundo; quer se trate de uma coloração em forma de circunferência incompleta ou completa. Intensidade da coloração Percentagem de coloração de células tumorais 1+, 2+ ou 3+ >0% Estas definições de resultados positivos e negativos estão de acordo com a literatura publicada, 24 mas poderão implicar uma modificação num contexto específico. (Consultar Limitações específicas do produto abaixo) Limitações Limitações gerais A IHC é um processo de diagnóstico com várias etapas que requer uma formação especializada na selecção dos reagentes apropriados; selecções de tecidos, fixação e processamento; preparação da lâmina de IHC e interpretação dos resultados da coloração. A coloração de tecidos depende do manuseamento e processamento dos tecidos antes da coloração. A fixação, congelação, descongelação, lavagem, secagem, aquecimento e seccionamento incorrectos ou a contaminação com outros tecidos ou fluidos poderá produzir artefactos, aprisionamento de anticorpos ou resultados falsos negativos. Os resultados inconsistentes podem dever-se a variações nos métodos de fixação e impregnação ou a irregularidades inerentes aos tecidos. Uma contrastação excessiva ou incompleta poderá comprometer a interpretação adequada dos resultados. A interpretação clínica de qualquer coloração positiva ou a sua ausência deve ser realizada no contexto da apresentação clínica, morfologia e outros critérios histopatológicos. A interpretação clínica de qualquer coloração positiva ou a sua ausência deve ser complementada com estudos morfológicos e controlos adequados, bem como outros testes de diagnóstico. A interpretação da preparação corada é responsabilidade de um patologista qualificado que esteja familiarizado com anticorpos, reagentes e métodos utilizados. A coloração deve ser efectuada por um laboratório licenciado certificado sob a supervisão de um patologista responsável pelo exame das lâminas coradas e garantia da adequação dos controlos positivos e negativos. Os tecidos de pessoas infectadas pelo vírus da hepatite B que contenham o antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg) podem exibir coloração não específica com a peroxidase de rábano. 25 Os reagentes podem demonstrar reacções inesperadas em tecidos não testados previamente. A possibilidade de reacções inesperadas, mesmo em grupos de tecidos testados, não pode ser completamente eliminada devido à variabilidade biológica da expressão de antigénios em neoplasmas ou noutros tecidos patológicos. 22 Contactar a assistência técnica da Dako para comunicar as reacções inesperadas documentadas. Podem observar-se resultados falsos-positivos devido à ligação não imunológica de proteínas ou a produtos de reacção do substrato. Poderão ser também causados pela actividade da pseudoperoxidase (eritrócitos) e actividade da peroxidase endógena (citocromo C). 21 Nota: Os reagentes e instruções fornecidos neste sistema foram concebidos para se obter um desempenho óptimo. A diluição subsequente dos reagentes ou a alteração dos tempos ou temperaturas de incubação podem originar resultados erróneos ou discordantes. Limitações específicas do produto Não se conhece a taxa de resposta de cetuximab para os doentes negativos para o EGFR e doentes com coloração positiva para o EGFR em menos do que um por cento de células tumorais, uma vez que não se verificou a presença de doentes deste tipo nos ensaios clínicos farmacológicos. Os tumores com coloração positiva para o EGFR em >1% das respectivas células são considerados tumores que exprimem o EGFR em relação às indicações de utilização actuais relativas ao cetuximab. ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 8/14

9 Os doentes com coloração da membrana EGFR em menos do que um por cento de células tumorais não foram incluídos no ensaio controlado aleatório com panitumumab e, por essa razão, a actividade do panitumumab nesta população de doentes não é conhecida. Os tumores com coloração positiva para o EGFR em >1% das respectivas células são considerados tumores que exprimem o EGFR em relação às indicações de utilização actuais relativas ao panitumumab. Os resultados falsos negativos poderão ser causados pela degradação do antigénio presente nos tecidos ao longo do tempo. As amostras devem ser coradas num período de 2 meses após a montagem dos tecidos nas lâminas, quando conservadas à temperatura ambiente (20-25 C). 14,26 Para resultados óptimos e reprodutíveis, a proteína EGFR requer a digestão proteolítica quando os tecidos forem fixados por rotina e impregnados em parafina. Características de desempenho Especificidade A reactividade do anticorpo EGFR, clone 2-18C9 (2-18C9) foi testada em relação a linhas celulares que expressam o EGFR, HER2, HER3 e HER4. Em análises Western Blot de lisados celulares SKBR3 e A431, o 2-18C9 reconheceu uma banda de 170 kd que é consistente com o peso molecular conhecido do EGFR. Verificou-se igualmente que o clone 2-18C9 reconhece a forma EGFRvIII (145 kd) do receptor em imuno-histoquímica, citometria de fluxo e análise Western Blot de linhas celulares transfectadas com EGFRvIII. Nas experiências de análises Western blot, o 2-18C9 não foi reactivo com lisados celulares CAMA-1 positivos para HER2, extractos de proteína E. coli BL-21 transformados pelo HER3 e lisados celulares transfectados CHO-HER4. Além disso, transfectantes de ovário de hamster chinês (CHO) que expressam o myc (marcador vectorial), isoladamente ou em conjunto com um dos membros da família HER, desenvolveram-se em lâminas fixadas em formol e impregnadas em parafina, em câmaras, coradas com anti-myc e 2-18C9. O anticorpo myc corou todos os cinco transfectantes CHO, ao passo que o 2-18C9 apenas corou as células CHO transfectadas com HER1. Ensaios clínicos Ensaios clínicos com cetuximab Foram realizados três ensaios sobre o fármaco cetuximab em casos de carcinoma colorectal (CRC) (EMD , IMCL CP IMCL CP ), nos quais os resultados do teste de coloração de imuno-histoquímica (IHC) que exprime o EGFR da Dako foram utilizados como um critério de elegibilidade para o estudo. Em 2 de 3 estudos, incluindo o ensaio principal (EMD ), o limiar para os tumores que exprimem o EGFR foi de 1+, num intervalo possível entre 0 e 3+ para a intensidade da coloração positiva para o EGFR, em 1% do total de células tumorais. Este limiar foi seleccionado uma vez que uma análise de subgrupo de um intervalo completo de limiares diferentes de critério de coloração da membrana, assim como outros critérios de diferenciação poderiam não detectar qualquer diferença significativa nos resultados clínicos. Ensaio principal com cetuximab O ensaio principal (EMD ), permitia a participação de doentes com tumores para os quais tivessem sido detectadas quaisquer células positivas para o EGFR utilizando o teste Dako EGFR pharmdx. Todos os tumores com estas condições encontrados no estudo tinham pelo menos 1% de células positivas para o EGFR, e tais tumores foram designados como apresentando expressão do EGFR. Os doentes com tumores que exprimiam o EGFR foram tratados com cetuximab em conjunto com irinotecan ou apenas com cetuximab. Foram testadas 577 amostras de tumores. 474/577 (82%, 95% IC = 78,1%, 86,1%) das amostras CRC testadas apresentaram expressão do EGFR. Estavam disponíveis 329 doentes para EGFR pharmdx para uma randomização de 2:1 relativamente aos dois braços do ensaio do fármaco principal. Neste ensaio, os doentes que receberam irinotecan e cetuximab obtiveram uma taxa de resposta de 50/218 (22,9%, IC 95% = 17,5%, 29,1%). Os doentes que receberam cetuximab isolado obtiveram uma taxa de resposta de 12/111 (10,8%, IC 95% = 5,7%, 18,1%). Apenas os doentes com tumores que exprimiam o EGFR da Dako, conforme acima descrito, receberam o tratamento com cetuximab. Não se conhece a taxa de resposta para os tumores que não exprimem o EGFR e, por sua vez, não pode ser comparada. Não se verificou qualquer correlação entre o grau de resposta do tumor e a percentagem de células positivas para o EGFR ou intensidade de coloração de EGFR. (Consultar Tabela 3) Tabela 3: Taxas de resposta do ensaio principal de cetuximab (EMD ) Total de doentes testados Taxa de resposta # de casos tratados com cetuximab e irinotecan Taxa de resposta # de casos tratados com cetuximab isolado 12/111 (10,8%, IC 95% = 5,7%, 18,1%) EGFR pharmdx + (>1%) 474* 50/218 (22,9%, IC 95% = 17,5%, 29,1%) EGFR pharmdx Nenhum caso tratado Nenhum caso tratado *Estavam disponíveis 329 doentes para uma randomização de 2:1 relativamente aos dois braços do ensaio do fármaco. # O n.º de taxas de resposta consistia na proporção de doentes em toda a população de estudo com uma redução de 50% na soma do diâmetro perpendicular de todo o tumor mensurável (ou seja, uma redução de 50% ou superior no tumor na área superficial) que persistiu durante, pelo menos, 28 dias. Estudos corroborantes do cetuximab O ensaio EGFR pharmdx foi utilizado para inscrever os doentes no ensaio principal (EMD ) e num estudo corroborante (IMCL CP ) durante o desenvolvimento de cetuximab. No estudo IMCL CP , foram testadas 140 amostras. Destas amostras, 105 /140 (75%, IC 95% = 66,9%, 83,1%) amostras apresentavam tumores que exprimiam o EGFR. Neste estudo, estavam inscritos 61 doentes no total, em que 57 doentes receberam cetuximab. Num estudo corroborante adicional (IMCL CP ), utilizou-se um protótipo do kit EGFR pharmdx (composto pelo mesmo anticorpo primário e sistema de detecção) para a participação dos doentes. No total, foram testadas 412 amostras de 401 doentes. 292/401 (72,8%, ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 9/14

10 IC 95% = 68,0%, 77,6%) dos doentes apresentaram um resultado de teste positivo. Estavam inscritos 139 doentes, dos quais 138 receberam cetuximab e irinotecan. Tabela 4: Resumo da percentagem de expressão de EGFR nos doentes com cancro do cólon ID do estudo Ensaio principal EMD Estudo corroborante IMCL CP Estudo com protótipo de EGFR IMCL CP Razão de expressão de EGFR (n.º que exprimem/n.º testados) % de expressão de EGFR Intervalos de confiança de 95% 474/577 82,1% 78,1 86,1% 105/140 75,0% 66,9 83,1% 292/401 72,8% 68,0 77,6% Estudos clínicos com panitumumab Os dados de eficácia que suportam a utilização do panitumumab no tratamento de doentes com cancro colorectal metastásico refractário (mcrc) foram fornecidos por estudos de doentes cujos tumores eram considerados tumores que exprimiam o EGFR, conforme avaliado pelo ensaio EGFR pharmdx. Ensaio controlado aleatório com panitumumab Este estudo multicêntrico, aleatório, de rótulo aberto, comparativo do panitumumab ( , estudo de extensão compatível ) com melhor cuidado de suporte (BSC) versus doentes mcrc BSC isolado inscritos com falha nos regimes de quimioterapia com oxaliplatina e irinotecan e cujos tumores expressaram coloração da membrana de EGFR em 1% das células tumorais avaliadas. Em ambos os grupos de tratamento, a percentagem média das células tumorais com coloração da membrana EGFR positiva foi de 20% (escala: 1% a 100%). No estudo , foi observada uma melhoria estatisticamente significativa no objectivo final primário de sobrevivência sem progressão (PFS) para o panitumumab com o grupo BSC comparado com o grupo BSC isolado (p < 0,0001, teste log-rank estratificado). Neste ensaio controlado aleatório, a taxa de resposta foi de 8,3% (19/229, 95% CI: 5,1%, 12,6%) e foi definida como resposta completa ou parcial (critérios RECIST modificados), com uma duração confirmada de pelo menos 4 semanas. A taxa de resposta correspondente nos 174 doentes que transitaram do BSC para o panitumumab no estudo de extensão compatível foi de 9,8% (17/174, 95% CI: 5,8%,15,2%). Não se verificou qualquer correlação entre os efeitos do tratamento na PFS e a percentagem de coloração da membrana de tumor EGFR ou a intensidade de coloração de EGFR. (Consultar Tabela 5, abaixo) Tabela 5: Efeitos do tratamento na sobrevivência sem progressão por coloração EGFR Estudo Doentes N/ Eventos Razão do perigo a Intervalo de confiança de 95% para a razão do perigo Todos aleatórios 463 / 401 0,54 (0,44, 0,66) <0,0001 % Coloração da membrana EGFR b 1-<10% 114 / 91 0,46 (0,30, 0,71) 0, % 182 / 157 0,55 (0,40, 0,76) 0,0004 >35% 164 / 150 0,56 (0,40, 0,78) 0,0007 Intensidade máxima de coloração da membrana EGFR c / 113 0,61 (0,41, 0,90) 0, / 206 0,49 (0,37, 0,65) <0, / 80 0,61 (0,39, 0,97) 0,0379 Valor p a As razões do perigo para o panitumumab com BSC relativamente ao BSC isolado são calculadas a partir de um modelo de perigos proporcionais Cox ajustado à classificação do desempenho ECOG e à região geográfica. Um valor < 1,0 indica uma taxa de eventos de média inferior e um tempo mais longo até ao evento para o panitumumab com BSC relativamente ao BSC isolado. b Foram excluídos 3 doentes cujos tumores expressavam < 1 % de coloração da membrana EGFR (violações de protocolo) c Foram excluídos 2 doentes cujos tumores expressavam < 1 % de coloração da membrana EGFR e < 1+ de intensidade máxima de coloração da membrana EGFR (violações de protocolo) Tabela 6: Resumo da percentagem de expressão de EGFR nos doentes com cancro do cólon ID do estudo Ensaio principal Razão de expressão de EGFR (n.º que exprimem/n.º testados) % de expressão de EGFR Intervalos de confiança de 95% 735/ ,2% 70,4 75,9% ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 10/14

11 Reprodutibilidade Reprodutibilidade inter-ensaio A reprodutibilidade inter-ensaio foi testada, utilizando uma metodologia manual, em dois laboratórios por dois técnicos em cada laboratório durante 3 dias com 5 amostras diferentes (4 positivas, 1 negativa em cada laboratório), com diferentes intensidades de coloração, seleccionadas aleatoriamente e ocultadas. Foi observada uma reprodutibilidade excelente (100%) para os resultados positivos para o EGFR versus resultados negativos para o EGFR (0 vs. 1+, 2+ e 3+). A intensidade da coloração variou 1+ em duas das amostras positivas e 2+ numa amostra (num dos testes o elemento de tecido positivo foi praticamente lavado da lâmina). As duas amostras negativas permaneceram negativas. Reprodutibilidade da coloração entre laboratórios A reprodutibilidade entre laboratórios foi testada em três laboratórios com localizações geográficas diferentes, com 30 amostras seleccionadas aleatoriamente e ocultadas com várias intensidades de coloração IHC. As lâminas recém-preparadas foram enviadas para os laboratórios de teste, para coloração manual e automatizada e avaliação por um patologista. A concordância da percentagem entre laboratórios foi de 100% para uma determinação positiva/negativa dicotómica, em que 0 foi negativo e 1+, 2+ e 3+ foram positivos relativamente à expressão da proteína EGFR em procedimentos de teste automatizado e manual. Imunoreactividade Na Tabela 7 é apresentado um resumo da imunoreactividade do EGFR pharmdx no painel de tecidos normais recomendado. Todos os tecidos foram fixados em formol e impregnados em parafina. ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 11/14

12 Tabela 7: Avaliação da coloração de tecidos normais com EGFR pharmdx* Tipo de tecido (nº testados) Supra-renal (2) Medula óssea (3) Mama (2) Encéfalo/cerebelo (3) Encéfalo/cérebro (3) Colo uterino (3) Cólon (3) Esófago (2) Coração (3) Rim (3) Fígado (3) Pulmão (3) Células mesoteliais (3) Ovários (3) Pâncreas (3) Paratiróide (1) Nervos periféricos (3) Hipófise (3) Próstata (3) Glândula salivar (3) Músculo-esquelético (3) Pele (3) Intestino delgado (3) Baço (3) Estômago (3) Testículos (3) Timo (3) Tiróide (3) Amígdalas (3) Útero (3) Coloração do elemento de tecido positivo para o EGFR e padrão de coloração Células corticais (2+): Citoplásmica Células epiteliais lobulares (2+): Membranar e citoplásmica Camada molecular (1+): Extracelular Células epiteliais escamosas basais (2+): Membranar ** Células epiteliais escamosas basais (2+): Membranar Túbulos (1+): Coloração citoplásmica (granular) Hepatócitos (sinusóides) (3+); Canais biliares (3+): Membranar e citoplásmica Células do revestimento alveolar/células brônquicas basais (células mioepiteliais) (2+): Membranar e citoplásmica Células mesoteliais (2+): Membranar e citoplásmica Ductos (2+): Membranar Processos das células nervosas (1+): Fibrosa Células epiteliais glandulares (2+): Membranar Elementos dos ductos (1+): Citoplásmica Células escamosas, estruturas anexas (2+): Membranar e citoplásmica Epitélio escamoso (3+): Membranar e citoplásmica Epitélio das glândulas endometriais (2+): Membranar e citoplásmica Células estromais do endométrio (2+): Membranar e citoplásmica Miométrio: *A maioria dos tecidos testados apresentou uma coloração dos fibroblastos no tecido do estroma (1+, fibroso), bem como células do perineuro e células mioepiteliais. Foi observada ocasionalmente a coloração de eosinófilos induzida pela peroxidase endógena. **Foi observada uma imunocoloração variável do epitélio do cólon normal. ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 12/14

13 Resolução de problemas Tabela 8: Resolução de problemas Problema Causa provável Acção sugerida 1. lâmina está a ser corada. 2. Coloração fraca das lâminas. 3. Coloração de fundo excessiva das lâminas. 4. Os tecidos separam-se das lâminas. 5. Coloração específica excessivamente forte. 6. Coloração fraca da linha celular 2+ da lâmina de controlo. 7. Digestão excessiva dos tecidos. 1a. Os reagentes não estão a ser utilizados na ordem correcta. 1b. Azida de sódio em banho de tampão de lavagem. 2a. Digestão proteolítica da Proteinase K inadequada. 2b. As secções retiveram demasiada solução após o banho de lavagem. 2c. As lâminas não foram incubadas o tempo suficiente com os anticorpos ou a Solução de substrato-cromogénio DAB+. 2d. Foi utilizado um método de fixação inapropriado. 3a. A parafina não foi completamente removida. 3b. Foram utilizados aditivos com amido na montagem das secções nas lâminas. 3c. As lâminas não foram totalmente lavadas. 3d. As secções secaram durante o procedimento de coloração. 3e. Ligação não específica dos reagentes à secção de tecido. 1a. Rever a aplicação dos reagentes. 1b. Utilizar o tampão de lavagem sem azida recém-preparado fornecido no kit. 2a. Verificar se a solução de Proteinase K é incubada durante um período completo de 5 minutos. 2b. Remover o excesso de solução com ligeiras pancadas antes de limpar em redor da secção. 2c. Rever os tempos de incubação recomendados. 2d. Certificar-se de que o tecido do doente não foi fixado em excesso e que está a ser utilizado um agente de fixação aprovado. (Consultar a secção Preparação das amostras) 3a. Utilizar soluções de limpeza recém-preparadas e cumprir o procedimento descrito na secção Desparafinização e rehidratação. 3b. Evitar utilizar quaisquer aditivos para aderência das secções às lâminas de vidro. Muitos destes aditivos são imunoreactivos. 3c. Utilizar soluções recém-preparadas nos banhos de tampão e nos frascos de lavagem. 3d. Utilizar uma câmara de atmosfera húmida. Verificar se está a ser aplicado às lâminas um volume de reagente adequado. Limpar apenas 3 a 4 lâminas de cada vez antes de aplicar o reagente. 3e. Verificar se a amostra foi correctamente fixada e/ou se existe necrose. 4a. Utilização de lâminas incorrectas. 4a. Utilizar lâminas carregadas (Fisher SuperFrost Plus), ou silanizadas, como as Dako Silanized Slides (referência S3003). 5a. Foi utilizado um método de fixação inapropriado. 5b. Os tempos de incubação dos reagentes foram demasiado longos. 5c. Foi utilizada uma solução de lavagem inadequada. 6a. Digestão proteolítica da Proteinase K inadequada. 6b. As lâminas não foram incubadas o tempo suficiente com os anticorpos ou a Solução de substrato-cromogénio DAB+. 6c. Degradação da lâmina de controlo. 7a. Incubação excessiva com Proteinase K. 7b. Fixação inadequada. 5a. Certificar-se de que são utilizados apenas métodos e agentes de fixação aprovados. (Consultar a secção Preparação das amostras) 5b. Rever as instruções do protocolo de coloração. 5c. Utilizar apenas o tampão de lavagem diluído fornecido com o kit. 6a. Verificar se a solução de Proteinase K é incubada durante um período completo de 5 minutos. 6b. Rever os tempos de incubação recomendados. 6c. Verificar o prazo de validade e as condições de conservação do kit impressos na etiqueta da embalagem. 7a. Verificar se a solução Proteinase K não é incubada por um período superior a 5 minutos. 7b. Utilizar o procedimento de pós-fixação indicado no protocolo de coloração, nas lâminas novas e proceder à coloração utilizando o procedimento existente. Nota: Consultar também a secção Resolução de problemas no Manual da Dako: Immunochemical Staining Methods, 3ª Edição 16 o Atlas of Immunohistology, 23 ou Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 20 Contactar a Assistência Técnica da Dako para comunicar casos de coloração invulgares. ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 13/14

14 Referências 1. Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. J Biol Chem 1990; 265: Riese DJ, Stern DF. Specificity within the EGF family/erbb receptor family signaling network. Bioessays 1998; 20:41 3. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, Seeburg PH, Libermann TA, Schlessinger J, Francke U, Levinson A, Ullrich A. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985; 230: Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, Saito T, Toyoshima K. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986; 319: Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, Ullrich A, Coussens L. The neu gene: An erbbhomologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985; 229: Gusterson B, Cowley G, Smith JA, Ozanne B. Cellular localization of human epidermal growth factor receptor. Cell Biol Intl Rpts 1984; 8(8): Gullick WJ. Prevalence of aberrant expression of the epidermal growth factor receptor in human cancers. Br Med Bull 1991; 47(1):87 8. Sainsbury JRC, Farndon JR, Sherbet GV, Harris AL. Epidermal-growth-factor receptors and oestrogen receptors in human breast cancer. Lancet 1985; 1(8425): Ozanne B, Richards CS, Hendler F, Burns D, Gusterson B. Over-expression of the EGF receptor is a hallmark of squamous cell carcinomas. J Pathol 1986; 149:9 10. Werner MH, Nanney LB, Stoscheck CM, King LE. Localization of immunoreactive epidermal growth factor receptors in human nervous system. J Histochem Cytochem 1988; 36: Pii K, Andersen FG, Jensen S, Spaulding B. Characterization of a new monoclonal antibody, clone 2-18C9, for the measurement of Epidermal Growth Factor Receptor expression in solid tumors. Am Assoc Canc Res 95 th annual meeting, Abst #5029 Orlando, Fl Mar Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co Atkins D, Reiffen KA, Tegtmeier CL, Winther H, Bonato MS and Störkel S. Immunohistochemical detection of EGFR in paraffinembedded tumor tissues: Variation in staining intensity due to choice of fixative and storage time of tissue sections. J Histochem Cytochem 2004; 52: Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, CLSI (formerly NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)). Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved guideline. Villanova, PA Order code M29-A2 19. CLSI (formerly NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. Villanova, PA Order code MM4-A. 20. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special report: quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech Histochem 1991; 66: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immuno-histology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986; Goldstein NS, Armin M. Epidermal growth factor receptor immunohistochemical reactivity in patients with American Joint Committee on Cancer Stage IV colon adenocarcinoma: implications for a standardized scoring system. Cancer 2001; 92: Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1980; 73: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: Potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994; 54:2771 ( ) P04035PT_01/K1492/ p. 14/14