Histology FISH Accessory Kit Referência K5799

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1 Histology FISH Accessory Kit Referência K ª edição Para a hibridização in situ fluorescente (FISH) em secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina. O kit contém reagentes suficientes para 20 testes. ( ) P04094PT_02_K / p. 1/28

2 Índice Finalidade... 3 Introdução... 3 Reagentes... 3 Materiais fornecidos... 3 Materiais necessários mas não fornecidos... 4 Precauções... 5 Conservação... 7 Preparação das amostras... 8 Secções impregnadas em parafina... 8 INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO... 9 A. Preparação do reagente... 9 A.1 Pre-Treatment Solution... 9 A.2 Stringent Wash Buffer... 9 A.3 Wash Buffer... 9 A.4 Série de etanol... 9 A.5 Solução de pepsina... 9 B. Procedimento de coloração B.1 Notas do procedimento B.2 Tratamento dos tecidos antes da coloração B.3 Protocolo de coloração B.3.a. Protocolo de coloração para sondas FISH diluídas num tampão de hibridização à base de carbonato de etilieno B.3.b. Protocolo de coloração para sondas FISH diluídas num tampão de hibridização à base de formamida Controlo de qualidade Interpretação dos resultados Resolução de problemas Apêndice Apêndice Referências Explicação dos símbolos ( ) P04094PT_02_K / p. 2/28

3 PORTUGUÊS Finalidade Para utilização em diagnóstico in vitro. O Histology FISH Accessory Kit destina-se a ser utilizado na técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH) em amostras de secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina. Os reagentes fornecidos neste Histology FISH Accessory Kit podem também ser utilizados com a HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (referência K5731, frasco 3). Se se utilizarem reagentes do Dako Histology FISH Accessory Kit, referência K5799, com reagentes da referência K5731, tem de seguir o procedimento descrito no folheto informativo da referência K5731. Introdução O Histology FISH Accessory Kit contém todos os principais reagentes, excluindo a sonda, necessários para realizar um procedimento FISH em amostras de secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina. A seguir à desparafinação e reidratação, as amostras são aquecidas em Pre-Treatment Solution, seguida de digestão proteolítica utilizando Pepsin. Após as etapas de aquecimento e pré-tratamento proteolítico, são aplicadas sondas FISH providenciadas pelo utilizador e as amostras são seladas com Coverslip Sealant antes de serem submetidas a desnaturação e hibridização. Após a hibridização, é realizada uma lavagem adstringente, que assegura a remoção de sondas FISH não ligadas e ligadas não especificamente antes da desidratação com etanol. Por fim, as amostras são montadas com Fluorescence Mounting Medium contendo um contrastante fluorescente azul. Os resultados são interpretados utilizando um microscópio de fluorescência equipado com filtros adequados (consultar o Apêndice 1). Reagentes Materiais fornecidos Os materiais abaixo indicados são suficientes para 20 testes (define-se um teste como uma área alvo de 22 mm x 22 mm). O kit fornece materiais suficientes para um máximo de 10 processos de FISH individuais (quatro processos separados quando se utiliza o método de imersão em Pepsin). O Histology FISH Accessory Kit é expedido em gelo seco. Para garantir que os componentes do kit não foram expostos a temperaturas elevadas durante o transporte, deve verificar-se se o gelo seco ainda se encontra presente aquando da receção do kit. Alguns componentes do kit poderão permanecer não congelados, o que não afetará o desempenho do Histology FISH Accessory Kit. Frasco 1 Frasco 2A Frasco 2B Pre-Treatment Solution (20 x) 150 ml, concentrado 20 x Tampão MES (ácido 2-[N-morfolino] etanossulfónico). Pepsin 4 x 6,0 ml, pronto a usar Solução de pepsina, ph 2,0; contém um estabilizador e um agente antimicrobiano. Pepsin Diluent (10 x) 24 ml, concentrado 10 x Tampão de diluição, ph 2,0; contém um agente antimicrobiano. ( ) P04094PT_02_K / p. 3/28

4 Frasco 4 Frasco 5 Frasco 6 Item 7 Stringent Wash Buffer (20 x) 150 ml, concentrado 20 x Tampão SSC (citrato sódio-salino) com detergente Tween-20. Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml Fluorescence Mounting Medium pronto a usar com 500 µg/l de DAPI (4,6-diamidina-2-fenilindol). Wash Buffer (20 x) 500 ml, concentrado 20 x Tampão Tris/HCl. Coverslip Sealant 1 tubo Solução pronta a usar para a selagem amovível da lamela. NOTA: Todos os reagentes podem ser substituídos pelos reagentes correspondentes no Dako HER2 IQFISH pharmdx (referência K5731). Se se utilizarem reagentes do Dako Histology FISH Accessory Kit, referência K5799, com reagentes da referência K5731, tem de seguir o procedimento descrito no folheto informativo da referência K5731. Materiais necessários mas não fornecidos Reagentes de laboratório Água destilada ou desionizada Etanol, 96% Xileno ou substitutos de xileno Equipamento de laboratório Panos absorventes Pipetas ajustáveis Termómetro de imersão parcial, calibrado (intervalo de C) Lamelas (18 mm x 18 mm ou 22 mm x 22 mm e 24 mm x 50 mm ou 24 mm x 60 mm) Fórceps Campânula de extração de fumos Dako Hybridizer (referência S2450/S2451)* Bloco térmico ou estufa de hibridização* Câmara húmida de hibridização* Microcentrífuga Lâminas, Dako Silanized Slides, referência S3003, lâminas revestidas com poli-l-lisina ou lâminas SuperFrost Plus Frascos ou banhos de coloração Suportes de metal ou plástico Cronómetro (com intervalos de 0 60 minutos) Banho de água com tampa (com capacidade para manter uma temperatura de 37 (±2) C, 63 (±2) C, 65 (±2) C e de 95 C a 99 C ( ) P04094PT_02_K / p. 4/28

5 Forno de micro-ondas com capacidade de deteção se o pré-tratamento for efetuado utilizando um forno de micro-ondas** (consultar a Etapa 1 na Secção B.3.a. ou B.3.b., Protocolo de coloração, Método B). Recipiente próprio para micro-ondas, cuja tampa deve apresentar perfurações com um diâmetro de cerca de um cm. * Pode utilizar-se um bloco térmico para digestão (37 (±2) C), um bloco térmico ou uma estufa de hibridização para desnaturação (66 (±2) C (B.3.a.) ou 82 (±2) C) (B.3.b.) e uma câmara húmida de hibridização para hibridização (45 (±2) C), mas recomenda-se o Dako Hybridizer, referência S2450/S2451. ** Pode utilizar-se um banho de água com tampa (com capacidade para manter uma temperatura de C) ou uma panela de pressão controlada por um microprocessador como a Dako Pascal, referência S2800, em vez de um forno de micro-ondas. Equipamento e acessórios de microscópio Filtros para microscópio de fluorescência: Filtro DAPI e outros adequados para o fluorocromo utilizado, por exemplo, o filtro duplo FITC/Texas Red ou os filtros individuais FITC e Texas Red para as sondas FISH da Dako consultar o Apêndice 1 para mais informações. Deve ser utilizado um microscópio de fluorescência com uma lâmpada de mercúrio de 100 watts como fonte de luz para as sondas FISH da Dako. Não se recomendam outras fontes de luz com estes filtros. Dobrador de lâminas de microscópio (tabuleiro de cartão para 20 lâminas com tampa articulada ou dispositivo semelhante). Precauções 1. Para utilização em diagnóstico in vitro. 2. Para utilizadores profissionais. 3. O frasco 1 não necessita de rotulagem de perigo. A ficha de dados de segurança encontra-se disponível para utilizadores profissionais, mediante pedido. 4. Frasco 2A, Pepsin, contém 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsina A e <0.1% mistura de 5-cloro-2-metil-2H-isotiazole-3-ona [número CE ] e 2-metil-2H-isotiazole- 3-ona [número CE ]. Frasco 2A está rotulado como: Perigo H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves. Pode provocar uma reacção alérgica cutânea. Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Usar vestuário de protecção. EM CASO DE INALAÇÃO: Retirar a pessoa para uma zona ao ar livre e mantê-la numa posição que não dificulte a respiração. Contactar imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. EM CASO DE INGESTÃO: Contactar imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. NÃO provocar o vómito. SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo): Retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água ou tomar um duche. Contactar imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: Contactar imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. Armazenar em local fechado à chave. Descartar o conteúdo e os recipientes de acordo com todas ( ) P04094PT_02_K / p. 5/28

6 as regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. 5. Frasco 2B, Pepsin Diluent (10 x), contém 50-<75% propan-2-ol e 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Frasco 2B está rotulado como: Danger H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 Líquido e vapor facilmente inflamáveis. Provoca irritação ocular grave. Pode provocar sonolência ou vertigens. Usar luvas de proteção. Usar proteção ocular ou facial. Manter afastado do calor, superfícies quentes, faísca, chama aberta e outras fontes de ignição. Não fumar. Utilizar equipamento eléctrico/de ventilação/de iluminação/.../à prova de explosão. EM CASO DE INALAÇÃO: Retirar a pessoa para uma zona ao ar livre e mantê-la numa posição que não dificulte a respiração. SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo): Retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água/tomar um duche. Conservar em ambiente fresco. Descartar o conteúdo e os recipientes de acordo com todas as regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. 6. Frasco 4, Stringent Wash Buffer (20x), contém 10-<25% Cloreto de sódio e 10-<20% 2- amino-2-(hidroximetil)propano-1, 3-diol, cloridrato. Frasco 4 está rotulado como: Atenção H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Provoca irritação ocular grave. Provoca irritação cutânea. Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Lavar as mãos cuidadosamente após manuseamento. SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: Enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retireas, se tal lhe for possível. Continue a enxaguar. 7. Frasco 6, Wash Buffer (20x), contém 10-<25% cloreto de sódio e 10-<20% trometamol. Frasco 6 está rotulado como: Atenção H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Provoca irritação ocular grave. Provoca irritação cutânea. Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Lavar as mãos cuidadosamente após manuseamento. SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: Enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retireas, se tal lhe for possível. Continue a enxaguar. ( ) P04094PT_02_K / p. 6/28

7 8. Item 7, Coverslip Sealant, contém 100% nafta (petróleo), leve tratada com hidrogénio e está rotulado como: Perigo H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Líquido e vapor facilmente inflamáveis. Pode ser mortal por ingestão e penetração nas vias respiratórias. Tóxico para os organismos aquáticos com efeitos duradouros. Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Manter afastado do calor, superfícies quentes, faísca, chama aberta e outras fontes de ignição. Não fumar. Utilizar equipamento eléctrico, de ventilação, de iluminação e de manuseamento de material à prova de explosão. Evitar a libertação para o ambiente. EM CASO DE INGESTÃO: Contactar imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. NÃO provocar o vómito. SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo): Retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água ou tomar um duche. Conservar em ambiente fresco. Descartar o conteúdo e os recipientes de acordo com todas as regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. 9. Para mais informações, consultar a Ficha de Dados de Segurança do Material (SDS). 10. Métodos de fixação de tecidos e espessuras da amostra diferentes das especificadas poderão afetar a morfologia tecidular e/ou a intensidade dos sinais. 11. Tempos e temperaturas de incubação ou métodos diferentes dos especificados podem originar resultados pouco credíveis. 12. Os reagentes apresentam uma diluição ideal. Qualquer diluição adicional poderá resultar num desempenho fraco. 13. Deve utilizar-se apenas frascos de coloração limpos para o método de imersão em Pepsin (Etapa 2, Método C). Conservação Conservar entre 2 e 8 C num local escuro. Alternat ivamente, todos os reagentes poderão ser congelados. A Pepsin (Frasco 2A) poderá ser afetada negativamente pela exposição ao calor. Não deixar este componente à temperatura ambiente. O Fluorescence Mounting Medium (Frasco 5) poderá ser afetado negativamente pela exposição a níveis de luz excessivos. Conservar este componente em local escuro. Não utilizar o kit após o fim do prazo de validade impresso na caixa do kit. Caso os reagentes sejam conservados noutras condições para além das especificadas, o utilizador deve verificar o desempenho dos reagentes (1). Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto. Por conseguinte, é importante avaliar o tecido normal anteriormente submetido ao poço FISH como medida de controlo da série de ensaios. Caso se observe algum padrão de fluorescência inesperado que não possa ser explicado por variações dos procedimentos laboratoriais e se suspeite de um problema com o Histology FISH Accessory Kit, contactar o Serviço Técnico da Dako. ( ) P04094PT_02_K / p. 7/28

8 Preparação das amostras As amostras resultantes de biopsias, excisões ou ressecções devem ser manuseadas de modo a preservar o tecido para a análise FISH. Seguir o método de processamento de tecidos recomendado para a coloração imunocitoquímica descrita abaixo. Para mais informações, consultar a referência (2). A utilização de tecido exposto à descalcificação ácida não se recomenda para a FISH (3-6). Foi referido que a utilização de EDTA enquanto descalcificante preserva melhor o ADN (6) para técnicas de (F)ISH (3, 4, 7). NOTA: O desempenho do Dako Histology FISH Accessory Kit não foi validado em tecido descalcificado. Secções impregnadas em parafina Apenas os tecidos conservados em formol tamponado neutro e impregnados em parafina são adequados para serem utilizados. As amostras devem, por exemplo, ser bloqueadas a uma espessura de 3 ou 4 mm e fixadas durante horas em formol tamponado neutro. Os tecidos devem então ser desidratados fazendo-os passar por uma série de concentrações de etanol e xileno, seguindo-se a infiltração com parafina derretida, mantida a uma temperatura não superior a 60 C. Se forem corretamente mantidos (15-25 C), os tecidos devidamente fixados e impregnados conservar-se-ão por um período indefinido antes de serem seccionados e montados em lâminas (2, 8). Os outros fixadores não são apropriados. Um tempo de fixação prolongado poderá aumentar o tempo de incubação necessário na etapa de digestão da Pepsin. As amostras de tecido devem ser cortadas em secções de 2-6 µm, colocadas em lâminas após um banho de água e depois secas ao ar. A espessura ideal das secções de tecido é de 2 3 µm para as sondas Dako Split Signal FISH Probes. As secções de 4 6 µm podem ser utilizadas para outras aplicações de FISH. A parafina deve ser derretida a 60 C durante minutos. As secções devem depois arrefecer à temperatura ambiente (20 25 C) e ser conservadas a 2 8 C. Recomenda-se que as secções de tecido sejam montadas em lâminas silanizadas, tais como as Dako Silanized Slides, referência S3003, em lâminas revestidas com poli-l-lisina ou em lâminas SuperFrost Plus. Em geral, as amostras devem ser analisadas no prazo de 6 meses após o seccionamento quando conservadas a 2-8 C. Para conservar os cortes de tecido em condições diferentes das especificadas, estas terão de ser verificadas pelo utilizador. ( ) P04094PT_02_K / p. 8/28

9 INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO A. Preparação do reagente Antes da coloração, é conveniente preparar os seguintes reagentes: A.1 Pre-Treatment Solution Podem formar-se cristais no Frasco 1, mas estes dissolver-se-ão à temperatura ambiente. Certificar-se de que os componentes não contêm cristais antes de preparar o reagente. Diluir uma quantidade suficiente do Frasco 1 (Pre-Treatment Solution 20 x), diluindo o concentrado a 1:20 em água destilada ou desionizada. A solução diluída não utilizada pode ser conservada a 2-8 C durante um mês. Eliminar a solução diluída c aso tenha um aspeto turvo. A.2 Stringent Wash Buffer Diluir uma quantidade suficiente do Frasco 4 (Stringent Wash Buffer 20 x) diluindo o concentrado a 1:20 em água destilada ou desionizada. O tampão diluído não utilizado pode ser conservado a 2 8 C durante um mês. Eliminar o tampão diluído ca so tenha um aspeto turvo. A.3 Wash Buffer Diluir uma quantidade suficiente do Frasco 6 (Wash Buffer 20 x) diluindo o concentrado a 1:20 em água destilada ou desionizada. O tampão diluído não utilizado pode ser conservado a 2 8 C durante um mês. Eliminar o tampão diluído caso tenha um aspeto turvo. A.4 Série de etanol A partir de uma solução de etanol a 96%, preparar 3 frascos com etanol a 70%, 85% e 96%. Conservar os frascos tapados à temperatura ambiente ou a 2 8 C e utilizá-los para um máximo de 200 lâminas. Eliminar as soluções caso tenham um aspeto turvo. A.5 Solução de pepsina A solução de pepsina é necessária apenas quando é utilizado o método de imersão em Pepsin (B.3.a. e B.3.b., passo 2, Método C). Preparar a solução de pepsina do seguinte modo: Para um recipiente com capacidade para seis lâminas, preparar 60 ml de solução de pepsina: Adicionar ao recipiente 48 ml de água destilada ou desionizada à temperatura ambiente (20-25 C). Adicionar ao recipiente 6 ml de Pepsin Diluent (10 x) (Frasco 2B) frio (2 8 C). Adicionar ao recipiente 6 ml de Pepsin (Frasco 2A) fria (2 8 C). Colocar a tampa no recipiente e ajustar a solução de pepsina a 37 (±2) C num banho de água. Para um recipiente com capacidade para 24 lâminas, preparar 240 ml de solução de pepsina: Adicionar ao recipiente 192 ml de água destilada ou desionizada à temperatura ambiente (20-25 C). Adicionar ao recipiente 24 ml de Pepsin Diluent (10 x) (Frasco 2B) frio (2 8 C). Adicionar ao recipiente 24 ml de Pepsin (Frasco 2A) fria (2 8 C). Colocar a tampa no recipiente e ajustar a solução de pepsina a 37 (±2) C num banho de água. A solução de pepsina equilibrada deverá ser utilizada no prazo de 5 horas. ( ) P04094PT_02_K / p. 9/28

10 B. Procedimento de coloração B.1 Notas do procedimento O utilizador deve ler atentamente estas instruções e familiarizar-se com todos os componentes antes da utilização (consultar a secção de Precauções). Se os componentes do kit forem conservados congelados, recomenda-se a mudança dos reagentes para um local com uma temperatura de 2 8 C um dia antes de realizar a análise para deixar que se atinja um equilíbrio adequado da temperatura. Equilibrar todos os reagentes à temperatura relevante antes de os utilizar. Frasco 1: A Pre-Treatment Solution diluída deve ser equilibrada a C caso seja utilizado um banho de água (Secção B.3.a ou B.3.b, Protocolo de coloração, Etapa 1: Prétratamento, Método A). Caso se utilize um forno de micro-ondas com capacidade de deteção para o pré-tratamento (Secção B.3.a. ou B.3.b. Protocolo de coloração, Etapa 1: Pré-tratamento, Método B), a Pre-Treatment Solution diluída deve ser equilibrada à temperatura ambiente de C. Frasco 2A: A Pepsin deve ser aplicada a 2-8 C (Secção B.3.a. ou B.3.b. Protocolo de coloração, Etapa 2: Métodos A e B) e deve ser constantemente mantida fria. Frasco 2B: O Pepsin Diluent (10 x) deve ser aplicado a 2-8 C (Secção B.3.a. ou B.3.b. Protocolo de coloração, Etapa 2: Método C). Frasco 4: Um frasco do Stringent Wash Buffer diluído deve ser equilibrado à temperatura ambiente e outro equilibrado a 63 (±2) C (Secção B.3.a.) ou 65 (±2) C (Secção B.3.b) antes de utilizar. Frasco 5: O Fluorescence Mounting Medium pode ser aplicado a qualquer temperatura entre 2 e 25 C. Frasco 6: Item 7: O Wash Buffer diluído deve ser equilibrado à temperatura ambiente (20 25 C). O Coverslip Sealant pode ser aplicado à temperatura ambiente (20 25 C). Todas as etapas devem ser efetuadas com as temperaturas indicadas. O procedimento de pré-coloração inclui desidratações seguidas de secagens das amostras. Certificar-se de que as amostras estão totalmente secas antes de avançar para a etapa seguinte. Não deixar que as amostras sequem durante as restantes etapas do procedimento. Se o procedimento de coloração tiver de ser interrompido, as lâminas podem ser mantidas em Wash Buffer após a etapa de desparafinação durante o máximo de 1 hora, à temperatura ambiente (20 25 C). B.2 Tratamento dos tecidos antes da coloração Desparafinação e reidratação: antes de se efetuar o procedimento, as lâminas de tecido devem ser desparafinadas para remover a parafina e devem ser reidratadas. Evitar a remoção incompleta da parafina. A presença de parafina residual aumentará a coloração não específica. Esta etapa deve ser realizada à temperatura ambiente (20 25 C ). 1. Colocar as lâminas num banho de xileno e incubar durante 5 (±1) minutos. Mudar o banho e repetir uma vez. 2. Dar pancadas leves para remover o excesso de líquido e colocar as lâminas em etanol a 96% durante 2 (±1) minutos. Mudar o banho e repetir uma vez. 3. Dar pancadas leves para remover o excesso de líquido e colocar as lâminas em etanol a 70% durante 2 (±1) minutos. Mudar o banho e repetir uma vez. 4. Dar pancadas leves para remover o excesso de líquido e colocar as lâminas em Wash Buffer diluído (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.2) durante um mínimo de 2 minutos. Iniciar o processo de coloração conforme delineado na Secção B.3.a. ou B.3.b., Etapa 1, Pré-tratamento. ( ) P04094PT_02_K / p. 10/28

11 Devem ser preparadas novas soluções de xileno e álcool após o processamento de cada 200 lâminas. Podem utilizar-se substitutos de xileno. NOTA: Os reagentes e instruções fornecidos neste kit foram concebidos para se obter um desempenho ideal. A diluição subsequente dos reagentes ou a alteração das temperaturas de incubação podem originar resultados erróneos ou discordantes. As diferenças no processamento de tecidos e procedimentos técnicos no laboratório do utilizador poderão invalidar os resultados do ensaio. Maturação opcional das amostras: antes da desparafinação e reidratação, incubar as lâminas a 60 C durante cerca de 1 hora num bloco térmico, num bloco de uma estufa de hibridização ou no Dako Hybridizer. Alternativamente, incubar lâminas a 37 C durante 1 2 dias, seguido de 1 hora a 60 C. Prosseguir com a desparafinação e reidratação. NOTA: Esta etapa é opcional. As amostras maduras poderão reduzir possíveis ruídos de fundo. B.3 Protocolo de coloração Siga uma das duas variantes do protocolo de coloração: B.3.a ou B3.b. Não misture as etapas dos dois procedimentos: O protocolo de coloração B.3.a. descreve o procedimento a realizar em intervalos de meio dia que deve ser aplicado às sondas FISH diluídas num tampão de hibridização à base de carbonato de etileno. O protocolo de coloração B.3.b. descreve o procedimento a realizar em intervalos de dois dias que deve ser aplicado às sondas FISH diluídas num tampão de hibridização à base de formamida. B.3.a. Protocolo de coloração para sondas FISH diluídas num tampão de hibridização à base de carbonato de etilieno Etapa 1: Pré-tratamento (forno de micro-ondas, banho de água, Pascal) O pré-tratamento pode ser efetuado usando um banho de água conforme descrito no método A), mediante a utilização de um forno de micro-ondas com capacidade de deteção conforme descrito no método B) ou utilizando uma panela de pressão de Pascal conforme descrito no método C). Método A: Pré-tratamento utilizando um banho de água Encher frascos de coloração, tais como frascos tipo Coplin, com a Pre-Treatment Solution diluída (ver INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.1). Colocar os frascos de coloração contendo a Pre-Treatment Solution diluída num banho de água. Aquecer o banho de água e a Pre-Treatment Solution a C. Medir a temperatura dentro do frasco com um termómetro calibrado para assegurar a temperatura certa. Cobrir os frascos com tampas de modo a estabilizar a temperatura e evitar a evaporação. Imergir os cortes desparafinizados à temperatura ambiente na Pre-Treatment Solution que se encontra nos frascos de coloração. Medir novamente a temperatura e incubar durante 10 (±1) minutos a C. Retirar o frasco com as lâminas de dentro do banho de água. Remover a tampa e permitir que as lâminas arrefeçam na Pre-Treatment Solution durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferir as lâminas para um frasco com Wash Buffer diluído (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.3) durante 3 minutos, à temperatura ambiente (20-25 C). Substituir o Wash Buffer e embeber as secções durante outros 3 minutos. NOTA: A Pre-Treatment Solution foi concebida para uma única aplicação. Não reutilizar. ( ) P04094PT_02_K / p. 11/28

12 Método B: Pré-tratamento utilizando um forno de micro-ondas com capacidade de deteção (recomendado) Encher um frasco de plástico com Pre-Treatment Solution diluída à temperatura ambiente (20-25 C). Mergulhar os cortes desparafinizados em Pre-Treatment Solution, tapar o frasco com uma tampa perfurada e colocar no forno de micro-ondas. Selecionar a função de fervura do sensor e um programa que seja executado durante 10 minutos após a temperatura de fervura ter sido atingida*. Após o período de incubação de 10 minutos, retirar o frasco com as lâminas do forno, retirar a tampa e deixar arrefecer durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferir as lâminas para um frasco com Wash Buffer diluído e embeber durante 3 minutos à temperatura ambiente (20-25 C). Substituir o Wash Buffer e embeber as secções durante outros 3 minutos. * A utilização de um forno de micro-ondas com capacidade de deteção significa que o forno tem de incluir um sensor e programas que inicialmente aquecem a Pre-Treatment Solution até ao ponto de ebulição e, subsequentemente, mantêm a temperatura de pré-tratamento necessária (acima de 95 C) enquanto se efetua a contagem decre scente do tempo predefinido (10 (±1) minutos). Alguns modelos de fornos de micro-ondas com capacidade de deteção podem não incluir a possibilidade para definir livremente um tempo para a contagem decrescente. Se o modelo incluir apenas programas pré-definidos, certificar-se de que escolhe um programa que mantém a temperatura de pré-tratamento necessária (acima de 95 C) durante pelo menos 10 ( ±1) minutos e interromper manualmente o programa decorridos 10 (±1) minutos. NOTA: A Pre-Treatment Solution foi concebida para uma única aplicação. Não reutilizar. Método C: Pré-tratamento utilizando uma panela de pressão Pascal Colocar 500 ml de água desionizada na panela Pascal. Encher um frasco de plástico com 250 ml de Pre-Treatment Solution. Mergulhar os cortes desparafinizados em Pre-Treatment Solution e colocar o frasco na panela Pascal. Incubar a 121 C durante 1 minuto. Libertar a pressão depois de arrefecer até 90 C. Ler atentamente o manual da panela Pascal para obter instruções sobre o correto manuseamento da panela de pressão Pascal. Remover o recipiente depois de libertada a pressão. Remover as tampas e deixar arrefecer as lâminas na Pre-Treatment Solution durante outros 15 minutos à temperatura ambiente. Transferir as lâminas para um frasco com Wash Buffer diluído (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.2). Embeber as secções durante 3 minutos à temperatura ambiente. Substituir o Wash Buffer e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a Etapa 2. NOTA: A Pre-Treatment Solution foi concebida para uma única utilização. Não reutilizar. Não utilizar recipientes selados a vácuo para realizar o pré-tratamento num forno de micro-ondas, uma vez que a pressão no interior do recipiente irá aumentar, podendo explodir ou causar ferimentos quando abrir. Pode utilizar um suporte de lâminas de metal no forno de micro-ondas se o suporte de metal estiver submerso em Pre-Treatment Solution durante todo o tratamento com micro -ondas. Não utilizar metais no interior de um forno de micro-ondas de qualquer outro modo. Seguir as instruções do fabricante do forno de micro-ondas. Evitar a ebulição contínua da Pre-Treatment Solution durante a incubação de 10 minutos. Controlar regularmente a temperatura utilizando um termómetro calibrado para verificar a existência de condições de temperatura corretas. Etapa 2: Pepsin, pronta a usar (RTU) ou solução de pepsina A incubação da Pepsin pode ser realizada aplicando gotas de Pepsin RTU diretamente nas lâminas, à temperatura ambiente (20-25 C) (método A) ou a 37 C (método B). Em alternativa, as lâminas podem ser mergulhadas numa solução de pepsina e incubadas a 37 (±2) C (método C). Método A e método B: Remover o tampão em excesso com pequenas pancadas. Utilizando um tecido que não largue fios (como uma gaze ou um toalhete absorvente), limpar cuidadosamente em torno da amostra para remover qualquer líquido remanescente e para manter os reagentes dentro da área designada. Aplicar 5 a 8 gotas (250 µl) de Pepsin (frasco 2A) fria (2-8 C) para cobrir a amostra. Conservar sempre a Pepsin a 2-8 C. ( ) P04094PT_02_K / p. 12/28

13 Método A: Pepsin, RTU - Incubação a C Incubar à temperatura ambiente durante 5-15 minutos (20 25 C). Um período de incubação de 5-15 minutos é adequado para a maioria das amostras, mas o período de incubação ideal pode depender da fixação do tecido e/ou da espessura da amostra, devendo ser determinado pelo utilizador. Dar pancadas leves para remover o excesso de Pepsin e embeber as secções em Wash Buffer diluído (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.3) durante 3 minutos à temperatura ambiente (20 25 C). Substituir o Wash Buffer diluído e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a desidratação. Método B: Pepsin, RTU - Incubação a 37 C Colocar a amostra com Pepsin num bloco térmico a 37 C (por exemplo, no Dako Hybridizer) e incubar durante 3 a 5 minutos. Um período de incubação de 3-5 minutos é adequado para a maioria das amostras, mas o período de incubação ideal pode depender da fixação do tecido e/ou da espessura da amostra, devendo ser determinado pelo utilizador. Dar leves pancadas para remover o excesso de Pepsin e embeber os cortes em Wash Buffer diluído durante 3 minutos à temperatura ambiente (20 25 C). Substituir o Wash Buffer e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a desidratação. Desidratar os cortes de tecido fazendo-os passar por uma série de concentrações de etanol: 2 minutos em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 85% e 2 minutos em etanol a 96%. Deixar que as secções de tecido sequem por completo ao ar. Método C: Solução de pepsina - Imersão das lâminas em solução de pepsina a 37 C O kit contém reagentes suficientes para quatro processamentos separados (60 ml de solução de pepsina, recipiente pequeno para seis lâminas) ou para um único processamento (240 ml de solução de pepsina, recipiente grande para 24 lâminas). Preparar a solução de pepsina conforme descrito na secção A.5. Colocar a tampa no recipiente e ajustar a solução de pepsina a 37 (±2) C num banho de água. Certificar-se de que a temperatura estabilizou. Medir a temperatura dentro do recipiente com um termómetro calibrado para assegurar que a temperatura é a correta. Dar pancadas leves para remover o excesso de Wash Buffer. Imergir as lâminas numa solução de pepsina a 37 (±2) C e incubar durante 20 a 30 minutos. Um período de incubação de minutos é adequado para a maioria das amostras, mas o período de incubação ideal pode depender da fixação do tecido e/ou da espessura da amostra, devendo ser determinado pelo utilizador. Dar leves pancadas para remover o excesso de solução de pepsina e embeber os cortes em Wash Buffer diluído durante 3 minutos à temperatura ambiente (20-25 C). Substituir o Wash Buffer e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a desidratação. Desidratar os cortes de tecido fazendo-os passar por uma série de concentrações de etanol: 2 minutos em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 85% e 2 minutos em etanol a 96%. Deixar que as secções de tecido sequem por completo ao ar. Etapa 3: Sonda FISH diluída num tampão de hibridização à base de carbonato de etileno (disponibilizada pelo utilizador) NOTA: As misturas de sondas FISH diluídas num tampão de hibridização à base de carbonato de etileno devem ser conservadas a -18 C entre utiliz ações. Uma conservação a -18 C resulta na separação do tampão em duas fases. Antes da utilização, certificar-se de que apenas uma fase se encontra presente ajustando a mistura de sondas à temperatura ambiente (20-25 C) e misturando em seguida. Descongelar a mistura de sondas FISH à temperatura ambiente (20-25 C) durante um período máximo de 30 minutos (proteger de iluminação forte) e, em seguida, fazer girar cuidadosamente o frasco, durante 15 segundos, a 2500 rpm, com um agitador tipo Vortex. ( ) P04094PT_02_K / p. 13/28

14 Aplicar uma quantidade adequada de mistura de sondas, por exemplo 10 µl, no centro do corte de tecido. Colocar imediatamente uma lamela de vidro de 22 mm x 22 mm sobre a mistura de sondas e deixar alastrar uniformemente por baixo da lamela. Evitar a formação de bolhas de ar. Caso se observem bolhas de ar, retirá-las do tecido com umas leves pancadas com fórceps. Vedar a lamela com Coverslip Sealant, ejetando o vedante em torno da periferia da lamela. Deixar que o Coverslip Sealant se sobreponha à lâmina e à lamela, formando assim uma camada de selagem em torno da lamela. Certificar-se de que o Coverslip Sealant cobre toda a orla da lamela. Preparar o Dako Hybridizer * (referência S2450 ou S2451) para um processamento de hibridização. Certificar-se de que as tiras de controlo de humidade (referência S2452) estão saturadas e ideais para utilização. Iniciar o Hybridizer e selecionar um programa para: Desnaturar a 66 C durante 10 minutos e, em seguida, realizar uma hibridização a 45 C durante 60 a 120 minutos. Colocar as lâminas no Hybridizer, certificar-se de que a tampa está corretamente fechada e iniciar o programa. Consultar o manual de instruções do Dako Hybridizer para obter detalhes. * Pode utilizar-se instrumentação que permita o estabelecimento de condições idênticas às que foram descritas acima para a desnaturação e hibridização: Colocar as lâminas numa superfície lisa metálica ou em pedra (bloco térmico ou bloco de uma estufa de hibridização) pré-aquecida a 66 (±1) C. Desnaturar durante exatamente 10 minutos. Colocar as lâminas numa câmara húmida de hibridização pré-aquecida. Cobrir a câmara com uma tampa e incubar a 45 (±2) C durante 60 a 120 minutos. Etapa 4: Lavagem adstringente Encher dois frascos de coloração, tais como frascos tipo Coplin, com o Stringent Wash Buffer, diluído (ver INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.2). Recomenda-se a utilização de um volume mínimo, em cada frasco, de 100 ml ou 15 ml por lâmina. Colocar um dos frascos de coloração contendo o Stringent Wash Buffer diluído, à temperatura ambiente, numa campânula de extração de fumos e o outro num banho de água. Aquecer o banho de água e o Stringent Wash Buffer diluído até 63 (±2) C. Certificar-se de que a temperatura estabilizou. Cobrir o frasco com uma tampa a fim de estabilizar a temperatura e evitar a evaporação. Medir a temperatura dentro do tanque de imersão com um termómetro calibrado, para assegurar a presença da temperatura correta. O Stringent Wash Buffer contém detergente e pode tornar-se turvo a 63 C; isto não afetará o se u desempenho. Usando fórceps ou luvas, retirar as lâminas da câmara de hibridização e remover cuidadosamente o Coverslip Sealant, bem como as próprias lamelas, colocando as lâminas, uma de cada vez, dentro do frasco de pré-lavagem à temperatura ambiente. Assim que tiverem sido retiradas todas as lamelas, transferir as lâminas do frasco de pré-lavagem à temperatura ambiente para o frasco no banho de água a 63 (±2) C. O temporizador deverá ser iniciado imediatamente após a transferência das lâminas para o Stringent Wash Buffer diluído a 63 (±2) C no banho de água. Realizar uma lavagem rigorosa durante exatamente 10 minutos. Retirar as lâminas do Stringent Wash Buffer diluído e embeber os cortes no Wash Buffer diluído durante 3 minutos, à temperatura ambiente (20-25 C). Mudar o Wash Buffer diluído e embeber as secções durante outros 3 minutos. Desidratar os cortes de tecido fazendo-os passar por uma série de concentrações de etanol: 2 minutos em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 85% e 2 minutos em etanol a 96%. Permitir que os cortes de tecido sequem por completo. ( ) P04094PT_02_K / p. 14/28

15 Etapa 5: Meio de montagem Aplicar 15 µl de Fluorescence Mounting Medium, contendo DAPI (frasco 5), à área alvo da lâmina e cobrir com uma lamela de vidro. NOTA: As lâminas podem ser interpretadas passados 15 minutos ou no prazo de 7 dias após a execução da montagem. Contudo, se as lâminas ficarem expostas à luz ou a temperaturas elevadas, dar-se-á o esmorecimento da amostra. Para minimizar o esmorecimento, conservar as lâminas num local escuro a C. B.3.b. Protocolo de coloração para sondas FISH diluídas num tampão de hibridização à base de formamida DIA 1 Etapa 1: Pré-tratamento (forno de micro-ondas, banho de água, Pascal) O pré-tratamento pode ser efetuado usando um banho de água conforme descrito no método A), mediante a utilização de um forno de micro-ondas com capacidade de deteção conforme descrito no método B) ou utilizando uma panela de pressão Pascal conforme descrito no método C). Método A: Pré-tratamento utilizando um banho de água Encher frascos de coloração com Pre-Treatment Solution diluída (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.1). Colocar os frascos de coloração contendo a Pre-Treatment Solution diluída num banho de água. Aquecer o banho de água e a Pre-Treatment Solution a C. Medir a temperatura dentro do frasco com um termómetro calibrado para assegurar a temperatura certa. Cobrir os frascos com tampas (não perfuradas) para estabilizar a temperatura e evitar a evaporação. Mergulhar as secções desparafinadas na Pre-Treatment Solution previamente aquecida. Medir novamente a temperatura, fechar a tampa do banho de água e incubar durante 10 (±1) minutos a C. Retirar o frasco com as lâminas de dentro do banho de água. Remover a tampa (não remover as lâminas). Deixar arrefecer as lâminas na Pre-Treatment Solution durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferir as lâminas para um frasco com Wash Buffer diluído (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.2) durante 3 minutos à temperatura ambiente. Substituir o Wash Buffer e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a Etapa 2. Método B: Pré-tratamento utilizando um forno de micro-ondas com capacidade de deteção (recomendado) Encher um recipiente com Pre-Treatment Solution diluída à temperatura ambiente (20 25 C). Mergulhar as secções desparafinadas na solução e fechar a tampa. A tampa deve estar perfurada para libertar a pressão. Colocar o recipiente com lâminas no forno de micro-ondas e aquecer. Antes de aquecer, certificarse de que o exterior do recipiente e do forno de micro-ondas estão secos. Incubar imediatamente abaixo do ponto de ebulição (não inferior a 95 C) durante 10 minutos. Após a incubação, remover a tampa (não remover as lâminas). Deixar arrefecer as lâminas na Pre-Treatment Solution durante 15 minutos à temperatura ambiente (20-25 C). As lâminas devem estar cobertas por tampão durante todo o procedimento de pré-tratamento. Transferir as lâminas para um frasco com Wash Buffer diluído (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.2) durante 3 minutos à temperatura ambiente. Substituir o Wash Buffer e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a Etapa 2. ( ) P04094PT_02_K / p. 15/28

16 Método C: Pré-tratamento utilizando uma panela de pressão Pascal Colocar 500 ml de água desionizada na panela Pascal. Encher um frasco de plástico com 250 ml de Pre-Treatment Solution. Mergulhar os cortes desparafinizados em Pre-Treatment Solution e colocar o frasco na panela Pascal. Incubar a 121 C durante 1 minuto. Libertar a pressão depois de arrefecer até 90 C. Ler atentamente o manual da panela Pascal para obter instruções sobre o correto manuseamento da panela de pressão Pascal. Remover o recipiente depois de libertada a pressão. Remover as tampas e deixar arrefecer as lâminas na Pre-Treatment Solution durante outros 15 minutos à temperatura ambiente. Transferir as lâminas para um frasco com Wash Buffer diluído (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.2). Embeber as secções durante 3 minutos à temperatura ambiente. Substituir o Wash Buffer e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a Etapa 2. NOTA: A Pre-Treatment Solution foi concebida para uma única utilização. Não reutilizar. Não utilizar recipientes selados a vácuo para realizar o pré-tratamento num forno de micro-ondas, uma vez que a pressão no interior do recipiente irá aumentar, podendo explodir ou causar ferimentos quando abrir. Pode utilizar um suporte de lâminas de metal no forno de micro-ondas se o suporte de metal estiver submerso em Pre-Treatment Solution durante todo o tratamento com micro-ondas. Não utilizar metais no interior de um forno de micro-ondas de qualquer outro modo. Seguir as instruções do fabricante do forno de micro-ondas. Evitar a ebulição contínua da Pre-Treatment Solution durante a incubação de 10 minutos. Controlar regularmente a temperatura utilizando um termómetro calibrado para verificar a existência de condições de temperatura corretas. Etapa 2: Pepsin, pronta a usar (RTU) ou solução de pepsina A incubação de Pepsin pode ser efetuada pela aplicação direta de gotas de Pepsin RTU nas lâminas à temperatura ambiente (20-25 C) (método A) ou a 37 C (método B). Em alternativa, as lâminas podem ser mergulhadas numa solução de pepsina e incubadas a 37 (±2) C (método C) Método A e Método B: Remover o tampão em excesso com pequenas pancadas. Utilizando um tecido que não largue fios (como uma gaze ou um toalhete absorvente), limpar cuidadosamente em torno da amostra para remover qualquer líquido remanescente e para manter os reagentes dentro da área pretendida. Aplicar 5 8 gotas (250 µl) de Pepsin fria (2 8 C) (Frasco 2A) certificando-se de que a amostra fica coberta. Conservar sempre a Pepsin a 2-8 C. Método A: Pepsin, RTU Incubação a C Incubar à temperatura ambiente durante 5-50 minutos (20 25 C). Um tempo de incubação de minutos à temperatura ambiente é adequado para a maior parte das amostras, mas o utilizador deve determinar o tempo de incubação ideal. Dar pancadas leves para remover o excesso de Pepsin e embeber as secções em Wash Buffer diluído (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.3) durante 3 minutos à temperatura ambiente (20 25 C). Substituir o Wash Buffer diluído e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a Etapa 3, Sonda FISH, ou consultar o Apêndice 2 para informações relativamente à otimização do tempo de digestão (opcional). Método B: Pepsin, RTU Incubação a 37 C Colocar as amostras com Pepsin a 37 C no Dako Hybridizer ou num bloco térmico previamente aquecido. Incubar durante 2 6 minutos a 37 C. Tal como descrito na secção "Preparação das amostras", este tempo de incubação é adequado para a maior parte das amostras preparadas. O tempo de incubação ideal depende do tipo de tecido, fixação do tecido, espessura e maturação da amostra, devendo ser determinado pelo utilizador. Estes fatores podem aumentar o tempo necessário para a digestão para 7 15 minutos ou mais. Utilizadores não familiarizados deverão identificar o tempo de digestão ideal testando um tecido representativo durante 1, 3, 6, 12 e 18 minutos. ( ) P04094PT_02_K / p. 16/28

17 Dar pancadas leves para remover a Pepsin e embeber os cortes em Wash Buffer diluído (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.3) durante 3 minutos à temperatura ambiente (20-25 C). Substituir o Wash Buffer diluído e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a Etapa 3, Sonda FISH, ou consultar o Apêndice 2 para informações relativamente à otimização do tempo de digestão (opcional). Método C: Solução de pepsina - Imersão das lâminas em solução de pepsina a 37 C O kit contém reagentes suficientes para quatro processos separados (60 ml de solução de pepsina, recipiente pequeno para seis lâminas) ou um único processo (240 ml de solução de pepsina, recipiente grande para 24 lâminas). Preparar a solução de pepsina conforme descrito na secção A.5. Colocar a tampa no recipiente e ajustar a solução de pepsina a 37 (±2) C num banho de água. Certificar-se de que a temperatura estabilizou. Medir a temperatura dentro do recipiente com um termómetro calibrado para assegurar que a temperatura é a correta. Dar pancadas leves para remover o excesso de Wash Buffer. Imergir as lâminas numa solução de pepsina a 37 (±2) C e incubar durante 20 a 30 minutos. Um período de incubação de minutos é adequado para a maioria das amostras, mas o período de incubação ideal pode depender da fixação do tecido e/ou da espessura da amostra, devendo ser determinado pelo utilizador. Dar pancadas leves para remover o excesso de solução de pepsina e embeber os cortes em Wash Buffer diluído durante 3 minutos à temperatura ambiente (20-25 C). Substituir o Wash Buffer e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a Etapa 3, Sonda FISH, ou consultar o Apêndice 2 para informações relativamente à otimização do tempo de digestão (opcional). NOTA: Recomenda-se que seja seguido o procedimento descrito na secção "Preparação das amostras". Um tecido insuficientemente digerido poderá resultar na ausência de sinais ou em sinais fracos, frequentemente com um elevado nível de fundo citosólico verde. Etapa 3: Sonda FISH (providenciada pelo utilizador) NOTA: Se se utilizarem reagentes do Dako Histology FISH Accessory Kit, referência K5799, com reagentes da referência K5731, tem de seguir o procedimento descrito no folheto informativo da referência K5731. A etapa seguinte deve ser efetuada numa campânula de extração de fumos. As sondas marcadas com fluorocromo poderão ser afetadas negativamente pela exposição a níveis de luz excessivos. Não realizar o restante procedimento sob luz forte como, por exemplo, luz solar direta. Desidratar os cortes de tecido fazendo-os passar por uma série de concentrações de etanol: 2 minutos em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 85% e 2 minutos em etanol a 96% (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.4). Deixar que as secções de tecido sequem por completo ao ar. Aplicar uma quantidade adequada de sonda marcada com fluorocromo, por exemplo, 10 µl de uma sonda FISH da Dako, no centro da secção de tecido. Colocar imediatamente uma lamela de vidro de 18 mm x 18 mm (ou 22 mm x 22 mm, por exemplo) sobre a sonda e deixar alastrar uniformemente sob a lamela. Evitar a formação de bolhas de ar. Caso se observem bolhas de ar, eliminá-las com umas leves pancadas com o fórceps. Selar a lamela, aplicando Coverslip Sealant no contorno da mesma. Deixar que o Coverslip Sealant se sobreponha à lâmina e à lamela, formando assim uma camada de selagem em torno da lamela. Certificar-se de que o Coverslip Sealant sela todo o rebordo da lamela. Colocar as lâminas no Dako Hybridizer (referência S2450/S2451) e definir a desnaturação para 82 C durante 5 min. e a hibridização para 45 C durante a noite (14 20 h) quando utilizar sondas FISH da Dako. Prosseguir para o Dia 2, Etapa 4: Lavagem adstringente. Consultar o manual do Hybridizer para obter mais instruções. NOTA: Em alternativa, pode ser utilizado um bloco térmico, uma estufa de hibridização e uma câmara de hibridização. Consultar abaixo. ( ) P04094PT_02_K / p. 17/28

18 Colocar a lâmina numa superfície lisa metálica ou em pedra (bloco térmico ou bloco de uma estufa de hibridização) pré-aquecida a 82 (±2) C. Desnaturar durante 5 minutos, certificando-se de que a temperatura do bloco não desce abaixo dos 80 C. Colocar as lâminas numa câmara húmida de hibridização pré-aquecida. Em caso de utilização das sondas FISH da Dako, cobrir a câmara com uma tampa e incubar durante a noite (14 20 horas) a 45 (±2) C. DIA 2 Etapa 4: Lavagem adstringente Encher dois frascos de coloração com a Solução de lavagem adstringente diluída (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.2). Para 1 6 lâminas num frasco, é necessário um volume mínimo de 100 ml de Stringent Wash Buffer diluído. Para mais do que 6 lâminas, utilizar, no mínimo, 15 ml de tampão por lâmina. Colocar um dos frascos de coloração contendo o Stringent Wash Buffer diluído, à temperatura ambiente, numa campânula de extração de fumos e o outro num banho de água. Aquecer o banho de água e o Stringent Wash Buffer diluído até 65 (±2) C. Certificar-se de que a temperatura estabilizou. Cobrir o frasco com uma tampa a fim de estabilizar a temperatura e evitar a evaporação. Medir a temperatura dentro do frasco com um termómetro calibrado para assegurar a temperatura certa. Retirar as lâminas da câmara de hibridização. Empregando um fórceps, remover cuidadosamente o Coverslip Sealant, assim como a lamela e transferir a lâmina para um frasco de pré-lavagem à temperatura ambiente. Assim que tiverem sido removidas todas as lamelas, transferir as lâminas do frasco de pré-lavagem à temperatura ambiente para o frasco a 65 (±2) C no banho de água. Fechar a tampa do frasco e, em seguida, a tampa do banho de água. Efetuar a lavagem adstringente durante exatamente 10 minutos a 65 (±2) C. Remover as lâminas do Stringent Wash Buffer diluído e embeber as secções em Wash Buffer diluído durante 3 minutos à temperatura ambiente (20 25 C). Mudar o Wash Buffer diluído e embeber as secções durante outros 3 minutos. Desidratar os cortes de tecido fazendo-os passar por uma série de concentrações de etanol: 2 minutos em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 85% e 2 minutos em etanol a 96% (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.4). Deixar as lâminas secar totalmente ao ar. Etapa 5: Meio de montagem Aplicar 15 µl de Fluorescence Mounting Medium (Frasco 5), contendo contraste fluorescente azul, na área alvo da lâmina e aplicar uma lamela de vidro (24 mm x 50 mm ou 24 mm x 60 mm, por exemplo). Deixar que o meio alastre uniformemente sobre a amostra. NOTA: As lâminas podem ser interpretadas passados 15 minutos ou no prazo de 7 dias após a execução da montagem. Se as lâminas forem expostas à luz ou a temperaturas elevadas, dar-se-á o enfraquecimento da amostra. As lâminas devem ser conservadas a C em local escuro. Controlo de qualidade 1. Os sinais devem ser vivos, distintos e fáceis de interpretar. 2. O tecido normal, anteriormente submetido ao poço FISH, deve ser utilizado como medida de controlo da série de ensaios. 3. As células do tecido normal devem apresentar sinais de fluorescência nitidamente visíveis, indicando que as sondas FISH foram hibridizadas com êxito para as áreas alvo. 4. A não deteção de sinais nas células de tecido normal indica falha do ensaio e os resultados devem ser considerados inválidos. 5. Devido ao seccionamento do tecido, algumas células normais terão um número de sinais menor do que o esperado. ( ) P04094PT_02_K / p. 18/28

19 6. A morfologia nuclear deve estar intacta e homogeneamente corada quando avaliada com um filtro DAPI. Numerosas células fantasma, células de forma anelar e uma fraca morfologia nuclear geral indicam uma digestão ou desnaturação excessiva da amostra, que poderá resultar em perda ou fragmentação dos sinais. A coloração periférica, orifícios nas células (filtro DAPI) e/ou uma coloração com fundo citosólico verde forte quando observada com um filtro duplo Texas Red/FITC pode indicar uma digestão insuficiente, que pode resultar em perda de sinal. As amostras desse tipo devem ser consideradas inválidas. 7. Quaisquer diferenças na fixação, processamento e impregnação dos tecidos no laboratório do utilizador podem produzir uma variabilidade nos resultados, sendo necessária a execução regular de controlos internos. Interpretação dos resultados Examinar várias áreas de células a fim de detetar a possibilidade de heterogeneidade. Selecionar uma área que apresente uma boa distribuição de núcleos. Iniciar a análise no quadrante superior esquerdo da área selecionada e, examinando-a da esquerda para a direita, contar o número de sinais que se encontram dentro dos limites nucleares de cada núcleo avaliado de acordo com as orientações fornecidas a seguir. Mudar o foco para cima e para baixo até encontrar todos os sinais presentes dentro de cada núcleo individual. Não classificar núcleos onde não existam sinais. Não incluir núcleos que exijam uma avaliação subjetiva. Não analisar núcleos com sinais de fraca intensidade e um fundo elevado ou não específico. O utilizador deve determinar o número de núcleos que devem ser contados para cada sonda. Evitar áreas onde as orlas nucleares sejam ambíguas. Limitações 1. O tempo de incubação ideal para a digestão da pepsina pode depender da fixação de tecidos e/ou da espessura das amostras e deve ser determinado e verificado pelo utilizador. 2. Para obter mais informações sobre a utilização prevista da sonda FISH e informações relativas ao produto, consulte o folheto informativo da sonda FISH individual. 3. O FISH é um processo diagnóstico multietapas que requer uma formação especializada na seleção dos reagentes apropriados, bem como na seleção, fixação e processamento dos tecidos, na preparação das lâminas de FISH e na interpretação dos resultados da coloração. 4. Os resultados do FISH dependem da manipulação e processamento dos tecidos antes da sua coloração. Fixação, lavagem, secagem, aquecimento, seccionamento incorretos ou contaminação com outros tecidos ou líquidos, poderão influenciar a hibridização das sondas. Os resultados inconsistentes podem dever-se a variações nos métodos de fixação e impregnação ou a irregularidades inerentes aos tecidos. 5. Para obter resultados ideais e reprodutíveis, devem desparafinizar-se por completo as lâminas de tecido. A remoção da parafina tem de ser concluída no início do processo de coloração. (consultar INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, secção B.2). 6. Devem ser utilizados utilizar apenas tanques de água, blocos térmicos e câmaras de hibridização cuja temperatura possa ser calibrada. A utilização de outros tipos de equipamento pode resultar na evaporação da mistura de sondas durante a hibridização e deve ser validada pelo utilizador. ( ) P04094PT_02_K / p. 19/28

20 Resolução de problemas Problema Causa provável Ação sugerida 1. Ausência de sinais ou sinais fracos 1a. Tempo de digestão inapropriado. 1b. O kit foi exposto a temperaturas elevadas durante o transporte ou a conservação. 1c. Condições de pré-tratamento incorretas. 1d. Condições de desnaturação incorretas. 1e. Temperatura de hibridização incorreta. 1a. Certificar-se de que são utilizadas secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina Poderá ser útil um tempo de digestão prolongado de, por exemplo, 7 15 minutos ou mais a 37 C. Consultar a Secção B.3.a ou B.3.b, Etapa 2: Resolução de problemas, pontos 4d, 4e e Apêndice 2. 1b. Verificar as condições de conservação. Verificar a presença de gelo seco aquando da receção da encomenda. Certificar-se de que os frascos 2A e 5 foram conservados a 2 8 C e que o frasco 5 foi guardado num local escuro. 1c. Certificar-se de que está a utilizar a temperatura e o tempo de pré-tratamento recomendados. Certificar-se ainda de que o tempo de incubação de digestão foi otimizado, se necessário. Consultar a Secção B.3.a ou B.3.b, Etapa 2. Quanto mais próxima do ponto de ebulição estiver a temperatura de pré-tratamento, mais fortes os sinais. Certificar-se de que a Pepsin é manuseada à temperatura correta. Consultar a Secção B.1. 1d. Certificar-se de que está a utilizar a temperatura e o tempo de desnaturação recomendados. 1e. Hibridizar a 45 (±2) C quando forem utilizadas sondas FISH da Dako. ( ) P04094PT_02_K / p. 20/28

21 1f. Evaporação do tampão da sonda durante a hibridização. 1g. Condições de lavagem adstringente incorretas. 1h. O microscópio não funciona devidamente: - Aparelho de filtro inapropriado - Lâmpada inadequada - Lâmpada de mercúrio demasiado antiga - Filtros queimados - Lente do coletor suja e/ou rachada - Óleo de imersão inadequado 1f. Certificar-se de que a câmara de hibridização tem humidade suficiente. Utilizar o Dako Hybridizer (referência S2450/S2451) e as Hybridizer Humidity Control Strips (referência S2452). Utilizar Coverslip Sealant. Consultar o ponto 5a e 5b em Resolução de problemas. 1g. Certificar-se de que está a utilizar o volume, tempo e temperatura de lavagem adstringente recomendados e que as lamelas são removidas antes de esta ser efetuada. 1h. Examinar o microscópio e verificar se os filtros utilizados são próprios para usar com os fluorocromos, se não estão gastos e se a lâmpada de mercúrio é adequada e não está a ser utilizada para além do seu prazo de validade (consultar o Apêndice 1). Utilizar um óleo de imersão adequado para a fluorescência. Em caso de dúvida, contactar o vendedor do microscópio. 1i. Sinais fracos. 1i. Evitar exames prolongados no microscópio e minimizar a exposição a fontes de luz fortes. 2. Áreas sem sinais 2a. Volume da sonda demasiado reduzido. 2b. Bolhas de ar retidas durante a aplicação da sonda ou montagem. 2a. Certificar-se de que o volume da sonda é suficiente para cobrir a área sob a lamela. 2b. Evitar a formação de bolhas de ar. Caso se observem bolhas de ar, retirá-las com umas leves pancadas com o fórceps. 2c. Desparafinação fraca. 2c. Certificar-se de que a parafina foi completamente removida das secções. Consultar a Secção B.2. ( ) P04094PT_02_K / p. 21/28

22 3. Coloração de fundo excessiva 3a. Tempo de digestão inapropriado. Um fundo citosólico verde forte poderá indicar uma digestão insuficiente. 3a. Certificar-se de que são utilizadas secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina. Poderá ser útil um tempo de digestão prolongado de, por exemplo, 7 15 minutos a 37 C. Consultar a Secção B.3.a ou B.3.b. Etapa 2, ponto 4e em Resolução de problemas e Apêndice 2. 3b. As secções secaram em B.3. 3b. Seguir as instruções e evitar secar as lâminas exceto se especificado. 4. Fraca morfologia nuclear ou fraca coloração nuclear 3c. A parafina não foi completamente removida. 3d. Temperatura da lavagem adstringente demasiado baixa. 3e. Exposição prolongada da secção hibridizada a luz forte. 3f. As lâminas fora do prazo de validade ou inadequadas podem provocar uma coloração vermelha de céu estrelado excessiva. 3g. Óleo de imersão não fluorescente misturado com o Fluorescence Mounting Medium. 4a. Condições de pré-tratamento incorretas podem resultar num aspeto indistinto ou turvo. 3c. Seguir os procedimentos de desparafinação e reidratação delineados na Secção B.2 3d. Certificar-se de que é utilizada a temperatura de lavagem adstringente recomendada. 3e. Evitar exames prolongados no microscópio e minimizar a exposição a luz forte. 3f. Utilizar os tipos de lâminas recomendados e assegurar que não estão fora do prazo de validade. Consultar a secção de Secções impregnadas em parafina. 3g. Utilizar lamelas de vidro grandes durante a montagem conforme recomendado. Consultar a Secção B.3.a ou B.3.b, Etapa 5. Esta medida impede que o óleo de imersão se misture com o meio de montagem, evitando a autofluorescência e a remoção acidental de lamelas pela objetiva do microscópio. 4a. Certificar-se de que está a utilizar a temperatura e o tempo de pré-tratamento recomendados. Consultar também o ponto 4b-e em Resolução de problemas. ( ) P04094PT_02_K / p. 22/28

23 4b. A ebulição durante o pré-tratamento pode resultar em danos na morfologia e na perda de sinais. 4b. Evitar a ebulição. Consultar a Secção B.3, Etapa 1. Consultar também o ponto 4d em Resolução de problemas. 4c. Tratamento da Pepsin incorreto. 4c. Cumprir os tempos de incubação recomendados para a Pepsin. Consultar a Secção B.3, Etapa 2, e o Apêndice 2. Consultar também o ponto 1a, 1c, 3a, 4d e 4e em Resolução de problemas. 4d. O tratamento demasiado prolongado com Pepsin dissolve o tecido e resulta na perda de sinais. A digestão excessiva pode causar o aparecimento de células fantasma ou núcleos de forma anelar e com uma morfologia nuclear geral fraca. 4e. O tratamento demasiado breve com Pepsin pode resultar na perda de sinais. O tecido insuficientemente digerido pode causar a coloração de núcleos periféricos e orifícios nos núcleos (filtro DAPI); fundo verde elevado em citosol (filtro duplo Texas Red/FITC). Observar que os núcleos em tecido insuficientemente digerido apresentam uma boa morfologia em contraste com o tecido excessivamente digerido. 4f. Temperatura de desnaturação demasiado elevada. 4g. Condições de hibridização incorretas. 4d. Reduzir o tempo de incubação da Pepsin. Consultar a Secção B.3.a ou B.3.b, Etapa 2, e o Apêndice 2. Certificar-se de que o corte tem uma espessura de 2 a 6 µm. Consultar também o ponto 1a, 1c, 4b e 4e em Resolução de problemas. 4e. Prolongar o tempo de incubação da Pepsin para, por exemplo, 2 3 vezes o tempo de digestão utilizado. Consultar também o ponto 1a, 1c, 3a, 4a e 4d em Resolução de problemas. 4f. Certificar-se de que é utilizada a temperatura de desnaturação recomendada. 4g. Consultar o ponto 1f e 5b em Resolução de problemas. ( ) P04094PT_02_K / p. 23/28

24 5. As lamelas aderem fortemente às lâminas de vidro após a hibridização, sendo por isso difíceis de remover 6. Elevado nível de autofluorescência verde na lâmina incluindo áreas sem tecido FFPE 5a. Lamela inapropriadamente selada na lâmina de vidro. 5b. Condições de hibridização incorretas. Podem causar sinais reduzidos ou ausência de sinais, danos no tecido e coloração de fundo. 6. Utilização de lâminas de vidro fora do prazo de validade ou não recomendadas. 5a. Não forçar a remoção da lamela se esta estiver demasiado colada na lâmina de vidro. Mergulhar a lâmina no frasco com Stringent Wash Buffer diluído à temperatura ambiente durante cinco minutos e, em seguida, remover a lamela. Seguir as recomendações para selar lamelas da Secção B.3.a ou B.3.b, Etapa 3. Consultar também o ponto 1f e 5b em Resolução de problemas. 5b. Certificar-se de que a câmara de hibridização tem humidade suficiente. Utilizar o Dako Hybridizer (referência S2450/S2451) e as Hybridizer Humidity Control Strips (referência S2452). Seguir as instruções do folheto informativo das Hybridizer Humidity Control Strips. Consultar as condições de hibridização recomendadas na Secção B.3.a ou B.3.b, Etapa 3. Consultar também o ponto 1f e 5a em Resolução de problemas. 6. Certificar-se de que a lâmina de vidro revestida (Dako Silanized Slides, referência S3003) ou as lâminas revestidas com poli-l-lisina não ultrapassaram o prazo de validade. NOTA: Contactar o Serviço técnico da Dako e solicitar assistência caso não seja possível atribuir o problema a uma das causas acima indicadas ou se a ação de correção sugerida não solucionar o problema. ( ) P04094PT_02_K / p. 24/28

25 Apêndice 1 Histology FISH Accessory Kit, referência K5799 Especificações sobre o microscópio de fluorescência A Dako recomenda que se utilize o seguinte equipamento com o Histology FISH Accessory Kit quando forem utilizadas sondas FISH da Dako: 1. Tipo de microscópio Microscópio de epifluorescência. 2. Lâmpada Lâmpada de mercúrio de 100 watts (deve ser, normalmente, substituída a cada 200 horas). 3. Objetivas Para a análise do tecido, devem aplicar-se objetivas secas de fluorescência a 10X ou de imersão em óleo de fluorescência a 16X. Para a ampliação a alta potência e registo de sinais, recomendam-se apenas objetivas de imersão em óleo de fluorescência, por exemplo, 63X ou 100X. 4. Filtros Os filtros são individualmente concebidos para fluorocromos específicos e devem ser selecionados conformemente. A Dako recomenda a utilização de um filtro DAPI específico, em combinação com um filtro duplo Texas Red/FITC de alta qualidade, quando são utilizadas sondas FISH da Dako. Filtro DAPI, por exemplo, filtro Omega Optical referência XF06 ou Chroma referência Filtro duplo Texas Red/FITC, por exemplo, filtro Omega Optical referência XF53 ou Chroma referência Podem ser utilizados filtros Texas Red e FITC individuais para confirmação, por exemplo, o filtro Omega Optical, referência XF102-2 e XF202, respetivamente. Fluorocromo Comprimento de onda de excitação Comprimento de onda de emissão FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Os filtros são concebidos especificamente para cada tipo de microscópio, sendo a utilização de filtros apropriados essencial para a interpretação. Para informações mais detalhadas, consultar o fabricante do microscópio, o representante da Dako ou o website da Dako. 5. Óleo Óleo de imersão não fluorescente. Precauções Fluorocromos específicos requerem equipamento diferente. Para as sondas FISH da Dako, não se recomenda a utilização de uma lâmpada de mercúrio de 50 watts, filtros de rodamina e filtros triplos em geral. Os microscópios não otimizados podem causar problemas durante a leitura de sinais fluorescentes. É importante que a fonte de luz não tenha ultrapassado o prazo de validade e que se encontre devidamente alinhada e focada. O cliente deve monitorizar e seguir as recomendações do fabricante relativamente à lâmpada de mercúrio e à manutenção do microscópio. Deve fazer-se um esforço para expor a amostra ao mínimo de luz de excitação possível a fim de minimizar o enfraquecimento da fluorescência. ( ) P04094PT_02_K / p. 25/28

26 Recomendamos que o cliente discuta a preparação do seu microscópio específico com o fabricante antes de iniciar o processo de hibridização in situ fluorescente ou que consulte a literatura correspondente. Apêndice 2 Etapa opcional para a otimização do tempo de digestão da Pepsin Esta etapa opcional pode ser utilizada para avaliar o efeito da digestão da Pepsin e para ajudar na otimização do tempo de digestão utilizado na Etapa 2, Pepsin. Para controlar se o tempo de digestão da Pepsin é suficiente, fazer a coloração da secção de tecido submetida a digestão com Pepsin com 10 µl de iodeto de propídio (400 ng/ml) providenciado pelo utilizador. Colocar uma lamela de vidro de 22 mm x 22 mm sobre o iodeto de propídio para deixar que alastre uniformemente sob a lamela. Incubar durante 1 minuto. Utilizar um microscópio de fluorescência com um filtro duplo Texas Red/FITC (consultar o Apêndice 1) para avaliar a coloração vermelha de núcleos com iodeto de propídio. Se a digestão do tecido for aceitável, deverão existir núcleos vermelhos com perímetros bem definidos. Remover o iodeto de propídio embebendo os cortes em Wash Buffer diluído duas vezes durante 3 minutos à temperatura ambiente (20 25 C) e prosseguir para a Secção B3, Protocolo de coloração, Etapa 3, Sonda FISH. Se os núcleos permanecerem verdes por autofluorescência e não forem coloridos de vermelho pelo iodeto de propídio, será necessário repetir o ciclo de digestão: Embeber as secções em Wash Buffer diluído duas vezes durante 3 minutos à temperatura ambiente (20 25 C) para remover o iodeto de propídio. Aplicar 5 a 8 gotas (250 µl) de Pepsin (Frasco 2) fria (2-8 C) para cobrir a amostra. Conservar sempre o frasco de Pepsin a 2 8 C. Colocar as lâminas a 37 C num bloco térmico previamente aquecido ou no Dako Hybridizer. Incubar durante 10 minutos caso tenha ocorrido pouca ou nenhuma digestão. Os 10 minutos servem apenas de orientação; o utilizador deverá determinar o tempo ideal. Embeber novamente em Wash Buffer diluído duas vezes durante 3 minutos à temperatura ambiente (20-25 C) para remover a Pepsin. Aplicar mais uma vez 10 µl de iodeto de propídio (400 ng/ml) durante 1 minuto. Avaliar a coloração e embeber as secções em Wash Buffer diluído duas vezes durante 3 minutos à temperatura ambiente (20 25 C). Repetir o ciclo se necessário ou prosseguir para a Secção B.3.a ou B.3.b, Protocolo de coloração, Etapa 3, Sonda FISH. NOTA: O kit contém reagentes suficientes para 20 testes. A utilização de Wash Buffer e Pepsin nesta etapa opcional reduzirá o número total de possíveis testes que poderão ser realizados com o kit. ( ) P04094PT_02_K / p. 26/28

27 Referências 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem : Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem : Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol : Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol : Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol : Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; ( ) P04094PT_02_K / p. 27/28

28 Explicação dos símbolos Nú mero de catálogo Limites de temper atura Código de lo te Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Consulta r a s instruções de utiliza ção Man te r a fa stado da luz solar (con sultar a secção de conservação) Conteúd o suficiente para <n> en saio s Utilizar até Fabricante Símb olo GHS (consultar a secção relativa às precauções) Símbolo GHS (co nsultar a secção relativa às precau ções) Símbolo GHS (consultar a secção relativa às precauções) Símb olo GHS (consultar a secção relativa às precauções) Símbolo GHS (co nsultar a secção relativa às precau ções) Produzido por Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 Tel DK-2600 Glostrup Fax Dinamarca ( ) P04094PT_02_K / p. 28/28