FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α Clone EP1 Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Referência IS084.

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1 FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α Clone EP1 Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Referência IS084 Finalidade Sinónimos de antigénio Resumo e explicação Reagente fornecido Para utilização em diagnóstico in vitro. O FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α, Clone EP1, Ready-to-Use (Dako Autostainer/ Autostainer Plus), é indicado para utilização em imuno-histoquímica em conjunto com instrumentos Dako Autostainer/ Autostainer Plus para a detecção semi-quantitativa do receptor do estrogénio humano em secções de tecido de cancro da mama humano, fixado em formol e impregnado em parafina. O anticorpo marca as células α-positivas receptoras do estrogénio e é útil na avaliação do estado do receptor de estrogénio em carcinomas da mama humanos. A interpretação clínica de qualquer coloração ou da sua ausência deve ser complementada com estudos morfológicos utilizando controlos adequados e deve ser avaliada dentro do contexto do historial clínico do doente e através de outros testes de diagnóstico por um patologista qualificado. ER α Os receptores esteróides exibem uma elevada afinidade e especificidade pelos seus ligandos. O receptor do estrogénio humano (ER) é uma proteína dimérica de 65 kda, localizada primariamente na membrana dos núcleos das células e pertence a uma classe de proteínas trans-activas, que estimulam a transcrição ao ligarem-se a elementos específicos do ADN, conhecidos, também, por elementos de resposta hormonal. Através do estrogénio de ligação, o ER é induzido a estimular a transcrição genética, logo, também é conhecido por factor realçador indutível (1, 2). Estudos históricos mostraram que o estado do ER está correlacionado de forma positiva com uma evolução não tratada (ou seja, prognóstico para o cancro da mama invasivo bem diferenciado) e com uma resposta à terapêutica anti-hormonal, por exemplo, tamoxifeno (2). Verificou-se que os estrogénios estão preferencialmente concentrados nos órgãos alvo dos estrogénios dos animais e no cancro da mama humano, estando perfeitamente documentado que os efeitos mitogénicos do estrogénio são mediados pelo ER. Investigações dos mecanismos biológicos para o crescimento do cancro da mama verificaram que a taxa de crescimento está dependente da presença de estrogénio ou progesterona ou de ambos na maioria dos cancros da mama (2). Por conseguinte, o estado do receptor do estrogénio nos carcinomas da mama é considerado como sendo um factor prognóstico e de previsão validado para o controlo de doentes para receberem terapêutica anti-hormonal (2-4). Consultar as Instruções Gerais para Coloração Imuno-histoquímica da Dako ou as instruções do sistema de detecção quanto aos procedimentos de IHC para obter informação sobre: 1) Princípio do Procedimento, 2) Materiais Necessários, mas não fornecidos, 3) Conservação, 4) Preparação das Amostras, 5) Procedimento de Coloração, 6) Controlo de Qualidade, 7) Resolução de Problemas, 8) Interpretação da Coloração, 9) Limitações Gerais. Anticorpo monoclonal de coelho pronto a utilizar, fornecido na forma líquida num tampão com proteína estabilizadora e 0,015 mol/l de azida de sódio. Clone: EP1. Imunogénio Proteína recombinante de aminoácidos de ER α. Especificidade Em análises Western Blotting de lisados celulares MCF7, o anticorpo marca uma banda principal de aproximadamente 67 kda, que corresponde ao peso molecular esperado de ER α. Não foi observada qualquer reactividade cruzada com ER β. Precauções 1. Para utilização em diagnóstico in vitro. 2. Para utilizadores profissionais. 3. Este produto contém azida de sódio (NaN 3), um produto químico altamente tóxico na forma pura. Em situações de concentração do produto, embora não sendo classificada como perigosa, a azida de sódio pode reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando acumulações de azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar o produto, adicionar água abundante para evitar a acumulação de azida metálica na canalização. 4. Tal como com qualquer produto de origem biológica, deverão utilizar-se procedimentos de manuseamento adequados. 5. Usar Equipamento de Protecção Pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. 6. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações Locais e Nacionais. ( ) P01470PT_003_IS084/ p. 1/5

2 Conservação Preparação das amostras incluindo materiais necessários, mas não fornecidos Procedimento de coloração incluindo materiais necessários, mas não fornecidos Conservar entre 2 8 C. Não utilizar após o fim do prazo de validade impresso no frasco. Se os reagentes forem conservados em condições diferentes das especificadas, o utilizador deverá verificar essas mesmas condições. Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto. Por isso, devem processar-se controlos positivos e negativos simultaneamente com as amostras do doente. Caso se observe uma coloração inesperada que não possa ser explicada pela variação nos procedimentos laboratoriais e se suspeite da existência de um problema com o anticorpo, contactar a Assistência Técnica da Dako. O anticorpo pode ser utilizado para marcar secções de tecido fixadas em formol e impregnadas em parafina. As amostras de tecido devem ser cortadas em secções de aproximadamente 4 µm. É necessário proceder ao pré-tratamento com recuperação do epítopo induzida por calor (HIER) utilizando Dako PT Link (Referência PT100/PT101/PT200). Para informações detalhadas, consultar o Guia do Utilizador do PT Link. Obtêm-se resultados óptimos ao pré-tratar os tecidos com EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (Referência K8010/K8004) durante 20 minutos a 97 C, seguidos de 5 minutos em EnVision FLEX Wash Buffer (Referência K8007). Secções impregnadas em parafina: É recomendado o pré-tratamento dos cortes de tecido fixados em formol e impregnados em parafina utilizando o procedimento de preparação das amostras 3 em 1 para o Dako PT Link. Após a coloração, os cortes têm de ser desidratados, limpos e montados com um meio de montagem permanente. As secções de tecido não devem secar durante o tratamento ou durante o processo de coloração imuno-histoquímica seguinte. Para uma maior aderência das secções de tecido às lâminas de vidro, recomenda-se a utilização de Dako Silanized Slides (Referência S3003). O sistema de visualização recomendado é o EnVision FLEX, High ph (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Referência K8010) utilizado de acordo com o protocolo abaixo indicado. Os reagentes devem ser apropriadamente diluídos antes da respectiva utilização. Todas as etapas devem ser realizadas à temperatura ambiente (20 25 C). 1. Incubar a secção de tecido com 200 µl de EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent (DM821) durante 2. Enxaguar em EnVision FLEX Wash Buffer (Referência K8007) durante 1 5 minutos 3. Incubar a secção de tecido com 200 µl de primary antibody (Referência IS084) durante 20 (±1) minutos 4. Enxaguar em EnVision FLEX Wash Buffer (Referência K8007) durante 1 5 minutos 5. Incubar a secção de tecido com 200 µl de EnVision FLEX/HRP (Referência DM822) durante 20 (±1) minutos 6. Enxaguar em EnVision FLEX Wash Buffer (Referência K8007) durante 1 5 minutos 7. Incubar a secção de tecido com 200 µl de EnVision FLEX Wash Buffer (Referência K8007) durante 8. Enxaguar em EnVision FLEX Wash Buffer (Referência K8007) durante 1 5 minutos 9. Incubar a secção de tecido com 400 µl de EnVision FLEX Substrate Working Solution (Referências DM823 e DM827) durante 10 (±1) minutos 10. Enxaguar em EnVision FLEX Wash Buffer (Referência K8007) durante 1 5 minutos 11. Contrastar a lâmina com EnVision FLEX Hematoxylin (Referência K8018) durante 12. Enxaguar em água desionizada durante 1 5 minutos 13. Incubar a secção de tecido com 200 µl de EnVision FLEX Wash Buffer (Referência K8007) durante 14. Enxaguar em água desionizada durante 1 5 minutos 15. Montar as lâminas em meio de montagem permanente. ( ) P01470PT_003_IS084/ p. 2/5

3 Grelha de programação para o ensaio recomendado: Todas as etapas de incubação devem ser realizadas à temperatura ambiente. Para mais detalhes, consultar o Manual do Operador para o respectivo instrumento. Em processos de coloração com 10 lâminas, a etapa Auxiliary (Auxiliar) deve ser definida para "rinse buffer (Tampão de lavagem). Para processos de coloração com > 10 lâminas, a etapa Auxiliary (Auxiliar) deve ser definida para "none" (Nenhuma). Isto assegura tempos de lavagem comparáveis. As condições ideais poderão variar dependendo das amostras e dos métodos de preparação, devendo ser validadas por cada laboratório (5). Certificar-se de que o desempenho do protocolo ajustado ainda é válido, avaliando se o padrão de coloração é idêntico ao padrão de coloração descrito nas Características de desempenho. Recomenda-se a contrastação em hematoxilina com EnVision FLEX Hematoxylin (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Referência K8018). É recomendado um meio de montagem não aquoso e permanente. Recomenda-se que os controlos positivos e negativos sejam processados simultaneamente com o mesmo protocolo das amostras do doente. Idealmente, os controlos positivos devem incluir um tecido de carcinoma da mama com expressão reduzida de ER. Alternativamente, pode ser utilizado tecido de colo uterino benigno. As células/estruturas devem apresentar padrões de reacção conforme os descritos para este tecido nas características de desempenho em todas as amostras positivas. O reagente de controlo negativo recomendado é FLEX Universal Negative Control, Rabbit, Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Referência IS600). Interpretação da coloração Limitação específica do produto Características de desempenho O padrão de coloração celular é nuclear. Caso seja observada marcação citosplásmica, esta deve ser considerada não específica. Um resultado positivo é definido como coloração nuclear em 1% das células tumorais (6). Este aspecto está de acordo com o ponto de "cut-off" 1% de células tumorais positivas recomendado pelas directrizes ASCO/CAP para avaliação positiva (3). 1. Os resultados falsos negativos poderão ser causados pela degradação do antigénio presente nos tecidos ao longo do tempo. As amostras devem ser coradas num período de 2 meses após a montagem dos tecidos nas lâminas, quando conservadas à temperatura ambiente (7). 2. Para resultados óptimos e reprodutíveis, as proteínas ER requerem a recuperação do epítopo alvo quando os tecidos forem fixados (formol neutro tamponado) por rotina e impregnados em parafina. 3. A utilização de Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 nos tecidos com agentes de fixação que não o formol não foi validada. Precisão: Foram colhidas para análise secções em série de cada um de três blocos diferentes fixados em formol e impregnados em parafina de carcinoma da mama. Foram efectuados testes do modo seguinte: Precisão intra-ensaio: De acordo com o protocolo padrão EnVision FLEX, High ph, foram coradas três secções de cada bloco de tecido com Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1. Ao mesmo tempo, corou-se uma secção de cada bloco com um reagente de controlo negativo. ( ) P01470PT_003_IS084/ p. 3/5

4 Precisão inter-ensaio: Corou-se uma secção de cada bloco de tecido e repetiu-se o procedimento acima em dois dias adicionais. Ao mesmo tempo, corou-se uma secção de cada bloco de tecido com um reagente de controlo negativo. Precisão inter-instrumento: Aquando da coloração de três secções de cada bloco de tecido, o procedimento acima foi realizado em três instrumentos Autostainer diferentes. Ao mesmo tempo, corou-se uma lâmina de cada bloco de tecido com um reagente de controlo negativo.as experiências de precisão com Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 produziram resultados consistentes com os testes intra-ensaio, inter-ensaio e inter-instrumentos. Mantiveram-se condições de análise consistentes ao longo do estudo e conservaram-se os reagentes a 2 8 ºC entre cada processamento. Tecidos normais: A tabela 1 contém um resumo da imunoreactividade do Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1, no painel de tecidos normais recomendado. Todos os tecidos foram fixados em formol, impregnados em parafina e corados Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1, de acordo com as instruções do folheto informativo. Tabela 1: Resumo da reactividade do Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1, em tecidos normais (8) Tipo de tecido (n.º testados) Elementos de tecidos com coloração positiva Amígdalas (3) 2/3 células epiteliais ( 1%), nuclear 1/3 linfócitos do centro germinativo (<1%), nuclear Baço (3) 0/3 Células mesoteliais (3) 0/3 Cerebelo (3) 0/3 Cérebro (3) 0/3 Colo uterino (3) 3/3 células epiteliais (30%), nuclear 3/3 células estromais (30%), nuclear Cólon (3) 0/3 Esófago (3) 1/3 células epiteliais (<1%), nuclear Estômago (3) 0/3 Fígado (3) 0/3 Glândula salivar (3) 0/3 Intestino delgado (3) 0/3 Mama (2) Medula óssea (3) 0/3 Músculo cardíaco (3) 0/3 Músculo-esquelético (3) 0/3 Nervos, periféricos (3) 0/3 Ovários (3) Pâncreas (3) 0/3 Paratiróide (3) 0/3 Pele (3) 0/3 Pituitária (3) 0/3 Próstata (3) Pulmão (3) 0/3 Rim (3) 0/3 Supra-renal(3) 0/3 Testículos (3) 0/3 Timo (3) 0/3 Tiróide (3) 0/3 Útero (3) 2/2 células epiteliais glandulares (20%), nuclear 3/3 epitélio follicular (20 40%), nuclear 2/3 células estromais (10 30%), nuclear 3/3 células estromais (<5 30%), nuclear 3/3 miométrio (<1 40%), nuclear 3/3 epitélio glandular (50 80%), nuclear 3/3 células estromais (30 80%), nuclear Comparação de métodos: Os testes de Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 foram realizados com EnVision FLEX e classificados de acordo com as directrizes ASCO/CAP (ponto de "cut-off" 1%) (3). Foram realizados testes de um cocktail anti-er α (Clones 1D5 e ER-2-123), utilizando o Dako ER/PR pharmdx Kit, tendo sido classificados de acordo com a directriz de classificação Allred descrita no folheto informativo. Os dados de comparação de métodos são apresentados na Tabela 2. Utilizando estas directrizes de classificação, o Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 apresentava uma elevada concordância com o componente de anticorpo de ER α da coloração com o Dako ER/PR pharmdx Kit, apresentando valores para uma concordância global, positiva e negativa de 96,2%, 98,9% e 92,2%, respectivamente. ( ) P01470PT_003_IS084/ p. 4/5

5 Tabela 2: Concordância entre anti-er α, Clone EP1 e o componente anti-er α do ER/PR pharmdx Kit Monoclonal Rabbit Anti- Human ER α, Clone EP1 Componente anti-er α do ER/PR pharmdx Kit Positiva Negativa Total Positive Negative Total Percentagem de concordância positiva = 183/185 = 98,9% Percentagem de concordância negativa = 119/129 = 92,2% Percentagem de concordância global = 302/314 = 96,2% Kappa= 0,9203 Intervalos de confiança de 95%= 0,8761 0,9645 Bibliografia 1. Kumar V, Green S, Stack G, Berry M, Jin J-R, Chambon P. Functional domains of the human estrogen receptor. Cell 1987;51: Elledge RM, Fuqua SAW. Ch. 31: Estrogen and Progesterone Receptors. Diseases of the Breast. Harris et al. eds., Lippincott Williams & Wilkins 2000; Hammond MEH, Hayes DF, Dowsett M, Allred C, Hagerty KL, Badve S, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med 2010;134: Fitzgibbons FK, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer: College of American Pathologists Consensus Statement Arch Pathol Lab Med 2000;124: Fitzgibbons PL, Murphy DA, Hammond EH, Allred C, Valenstein PN. Recommendations for Validating Estrogen and Progesterone Receptor Immunohistochemistry Assays. Arch Pathol Lab Med 2010:134; Diaz LK, Sneige N. Estrogen receptor analysis for breast cancer: current issues and keys to increasing testing accuracy. Adv Anat Pathol 2005;12:10-9. Review. 7. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( )- CLSI, 940 West Valley Road, Suite Wayne, PA USA M3634 IHC003-D03803 Report on file. O Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1, foi criado pela Epitomics Inc., utilizando a tecnologia de anticorpos monoclonais de coelho que constitui propriedade da Epitomics ao abrigo das Patentes com os N.º 5,675,063 e 7,402,409. Edição 11/15 ( ) P01470PT_003_IS084/ p. 5/5