Palavras chave: espécies nativas do Brasil, carboidrato, carvão ativado, meio assimbiótico.

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1 ISSN Cultivo in vitro de Brassavola tuberculata (Orchidaceae) em meio de cultura alternativo suplementado com diferentes concentrações de açúcar e carvão ativado Jackeline Schultz Soares 1 ; Yara Brito Chaim Jardim Rosa 1 ; Marichel Canazza de Macedo 1 ; José Carlos Sorgato 1 ; Derek Brito Chaim Jardim Rosa 1 ; Cedrick Brito Chaim Jardim Rosa 1 1 Faculdade de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Grande Dourados, Rodovia Dourados Itahum, Km12, Bairro Rural. Dourados, MS. CEP: Mato Grosso do Sul Brasil. jacke.schultz@gmail.com; yararosa@ufgd.edu.br; marichelcanazza@hotmail.com ; vinnysorgatto@hotmail.com; derek_jardim@hotmail.com; cedrickjr@hotmail.com Resumo: Meios nutritivos utilizados na propagação in vitro de Orchidaceae devem fornecer as substâncias necessárias para a germinação in vitro das sementes e crescimento das plântulas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de açúcar e carvão ativado, adicionados ao meio de cultura, na propagação in vitro de Brassavola tuberculata Hook. As sementes foram semeadas em meio de cultura alternativo, modificado por diferentes concentrações de açúcar (0; 12,5; 25; 37,5 e 50 g L -1 ) e carvão ativado (0; 1,5; 3,0; 4,5 e 6,0 g L -1 ). Após 12 meses da semeadura e permanência em sala de crescimento com temperatura e fotoperíodo controlados (23ºC±2; 12 horas e 13,51 µmol m -2 s -1 ), as plântulas foram retiradas dos frascos e avaliadas quanto à porcentagem de germinação, número de plantas, comprimento dos pseudobulbos e da maior raiz. Foi utilizado o delineamento experimental inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 5 com 4 repetições. Os resultados obtidos permitiram concluir que o carvão é necessário à germinação e ao crescimento inicial da espécie estudada, e a mesma não necessita de fornecimento suplementar de açúcar neste meio de cultura para germinação e as fases iniciais do desenvolvimento. Assim, recomenda-se a adição de 4,5 g L -1 de carvão para cultivo in vitro de B. tuberculata em meio alternativo. Palavras chave: espécies nativas do Brasil, carboidrato, carvão ativado, meio assimbiótico. In vitro culture of Brassavola tuberculata (Orchidaceae) in alternative media supplemented with different concentration of sugar and activated charcoal Abstract: Nutrient medium used for Orchidaceae plant cultivation in vitro should provide important substances for seed germination and seedling growth. This work aimed to evaluate the effect of five concentrations of sugar and activated charcoal on in vitro propagation of Brassavola tuberculata Hook. The seeds were sown on alternative culture media supplemented with different concentration of sugar (0; 12, 5; 25; 37, 5 e 50 g L -1 ) and activated charcoal (0; 1.5; 3.0; 4.5 e 6.0 g L -1 ). After 12 months of cultivation at 23 ±2 ºC under a 12-h photoperiod, and µmol m -2 s -1 of luminosity, the seedlings were removed from the vessels and evaluated regarding germination percentage, number, length of the pseudobulbs and the larger root. A completely randomized design was used and the treatments were arranged in a factorial 5 x 5 scheme with 4 replications. B. tuberculata did not germinate without charcoal but does not require supply of sugar in the culture media for initial developmental phases. So, it is recommended to supplement the culture alternative media for in vitro cultivation of B. tuberculata with 4.5 g L -1 of activated charcoal. Key words: Brazilian native species, carbohydrate, activated charcoal, assimbiotic media. Introdução Devido à beleza de suas flores, as plantas da família Orchidaceae são muito apreciadas por colecionadores e comerciantes (Stefanello et al., 2009) que, a partir do extrativismo, tem retirado as orquídeas de áreas naturais. Além disso, o avanço da agricultura tem destruído os ecossistemas onde estão inseridas, dificultando sua sobrevivência e reprodução (Imes, 1997). A velocidade com que esses processos ocorrem é uma das razões para os estudos acerca da propagação dessas espécies, para que possam ser utilizadas tanto em programas de reintrodução quanto para a comercialização (Bach e Castro, 2004).

2 227 Em condições naturais, a propagação das orquídeas se dá pelo desenvolvimento de gemas laterais formando clones (Hoffmann et al.,1997) ou pela disseminação das sementes que, por serem desprovidas de endosperma, necessitam da associação com de fungos micorrizicos para germinação (Kalimuthu et al., 2007). Este fato reduz o número de sucessos de recrutamentos em populações naturais e, em uma perspectiva econômica, a germinação natural dificulta a produção dessas espécies a partir de sementes. No entanto, com a adoção das técnicas de germinação in vitro (Alam et al., 2002), a produção comercial de orquídeas tem se tornado cada vez mais expressiva, o que é importante para a conservação uma vez que garante a viabilidade genética que é perdida com a cultura de tecidos. Além da germinação, os meios assimbióticos para orquidáceas devem também propiciar o crescimento e desenvolvimento das plantas. Para atender às necessidades de cada espécie, mudanças nos meios de cultura têm sido estudadas por diversos pesquisadores (Rego-Oliveira et al., 2003; Chapla et al., 2009; Gantait et al., 2009; Moreira et al, 2009; Pacek-Bieniek et al., 2010). Entretanto, os meios de cultura comerciais são complexos, com diversos nutrientes, vitaminas e reguladores de crescimento (Ventura et al., 2002), que elevam os custos da propagação. Por esta razão e visando a facilidade de formulação e acessibilidade dos componentes, Campos (2002) propôs um meio alternativo, no qual a maioria das orquídeas germina e cresce. Um dos componentes essenciais ao cultivo in vitro são os carboidratos, pois as plantas propagadas nesta condição necessitam de uma fonte de energia externa, já que nesta fase são praticamente heterotróficas (Caldas et al., 1998). Desta forma várias fontes de carboidratos tais como sacarose, maltose e glucose (Rego-Oliveira et al., 2003; Moreira et al., 2009), são adicionadas aos meios de cultura convencionais visando suprir esta necessidade. Outro componente que tem enriquecido os meios de cultura é o carvão ativado, pois a ele são atribuídos efeitos benéficos tais como aumento na altura e no enraizamento in vitro de algumas espécies de orquídeas (George e Ravishankar, 1997; Chapla et al., 2009; Gantait et al., 2009; Pacek-Bieniek et al., 2010). Grande tem sido o interesse por orquídeas nativas brasileiras, visando não apenas os colecionadores, mas também os programas de melhoramento e de reintrodução das espécies em seus habitats. Entre as orquídeas com este potencial, destaca-se Brassavola tuberculata, uma espécie que ocorre no cerrado (Mendonça et al., 1998) e se distribui no estado de Mato Grosso do Sul (Rech et al., 2011), destacando-se por seu elevado valor florístico e rusticidade, sendo este gênero amplamente utilizado na produção de híbridos duplos e triplos com Cattleya, Laelia, Sophronitis e Epidendrum. Os estudos visando obtenção de um protocolo de germinação e crescimento in vitro para B. tuberculata não existem. Assim essa pesquisa teve por objetivo avaliar o efeito da adição de diferentes concentrações de açúcar e carvão ativado na germinação assimbiótica e crescimento inicial desta espécie. Material e Métodos O experimento foi realizado no Laboratório de Cultivo in vitro da Faculdade de Ciências Agrárias (FCA) da Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD). Foram utilizadas como material de estudo sementes de Brassavola tuberculata (Figura 1), provenientes de uma reserva legal do município de Dourados MS, localizada nas coordenadas 22 o 24 S e 54 o 46 W, com altitude média de 327 m. As médias anuais de temperatura do ar máxima e mínima são de 24 e 20ºC, respectivamente, com precipitação total anual entre 1250 e 1500 mm. O clima regional é do tipo Cwa mesotérmico úmido, segundo a classificação de Köppen (1948).

3 228 A B C Figura 1 - A) Brassavola tuberculata Hook em seu habitat; B) detalhe da flor foto de Dalton Hollad Baptista; C) Brassocattleya tramandaí, híbrido natural entre Brassavola tuberculata e Cattleya tigrina foto de Luiz Felipe Varella Cápsulas maduras de B. tuberculata foram coletadas e as sementes provenientes destas, foram retiradas, homogeneizadas, pesadas e, três porções de 5,0 mg cada, foram colocadas em tubos de ensaio e cada uma delas recebeu uma 3 ml de solução aquosa de cloreto de trifenil tetrazólio 0,5%. As suspensões de sementes foram acondicionadas em ambiente desprovido de luz e 25 ºC ±2. Após 24 horas as suspensões de tetrazólio foram acrescidas de 7 ml de água destilada e agitadas, sendo pipetado 1 ml para identificação e contagem de sementes viáveis em câmara de Peters com o auxílio de lupa. Para cada amostra foram realizadas três leituras, sendo posteriormente calculada a média entre elas. O teste identificou 700 sementes viáveis por miligrama de sementes, com porcentagem de viabilidade de 70%. Após a confirmação da viabilidade procedeu-se a semeadura in vitro. Utilizou-se um meio de cultura proposto por Campos (2002), modificado pela utilização de 70 g de tomate tipo italiano, variedade Santa Cruz, maduros, vermelhos, sem casca e sementes, 50 g de banana nanica amarelada, sem casca (provenientes de cultivo convencional), 3 ml de adubo NPK na formulação , 17 g de ágar bacteriológico, açúcar cristal C 12 H 22 O 11 - (nas concentrações 0,0; 12,5; 25; 37,5 e 50 g L -1 ), carvão ativado (nas concentrações de 0,0; 1,5; 3,0; 4,5; 6,0 g L -1 ), 150 ml de água de coco e água destilada para completar um litro. Após homogeneização no liquidificador, o ph foi ajustado para 5,8 com KOH e meio de cultura foi transferido para frascos de 600 ml providos de tampa metálica. Cada frasco recebeu 80 ml do meio, sendo, a seguir, esterilizado em autoclave por 20 minutos a 120 C e 1 atm de pressão. Em seguida à esterilização e solidificação do meio, os frascos foram transferidos para câmara de fluxo laminar, previamente esterilizada com luz germicida por 15 minutos, para realização da semeadura in vitro. Para semeadura foram utilizadas 50 mg de sementes que foram desinfestadas por 15 minutos em uma solução composta por 15 ml de hipoclorito de sódio (2,5%) e 30 ml de água destilada esterilizada em autoclave (Campos, 2002). Decorrido este tempo a suspensão foi diluída para 250 ml com água destilada estéril, no interior da câmara de fluxo laminar. Cada frasco recebeu, com a utilização de pipetador automático, 2 ml da suspensão de sementes (aproximadamente 280 sementes viáveis por frasco). Foram utilizados quatro frascos para cada tratamento. Após a semeadura os frascos foram tampados e lacrados com filme plástico, sendo acondicionados em sala de crescimento com temperatura média de 23 C ± 2 e fotoperíodo de 12 horas, com intensidade luminosa de 13,51 µmol m -2 s -1 obtida por meio de duas lâmpadas brancas fluorescentes de 40 W cada. Decorridos doze meses, os frascos foram abertos e foram contabilizadas a porcentagem de germinação e o número de plântulas produzidas, sendo todas elas avaliadas quanto ao comprimento dos pseudobulbos e da maior raiz e, posteriormente, calculadas as médias dos valores obtidos para cada repetição. Foi utilizado o delineamento experimental inteiramente casualizado em esquema fatorial 5x5 com quatro repetições de um frasco cada. Todas as variáveis foram submetidas à análise de variância e quando significativas as médias foram comparadas por regressão ou teste de médias (Tukey 5%) com a utilização do aplicativo computacional SISVAR 5.3 (Ferreira, 2010). Resultados e Discussão Houve efeito isolado do carvão (p<0,01) sobre todas as variáveis estudadas. Efeitos isolados do açúcar e da interação carvão x açúcar (p<0,05) foram

4 229 registrados apenas sobre a porcentagem de germinação (%G) e número de plantas (NP). Em relação ao comprimento de pseudobulbos e da maior raiz, independentemente das concentrações de açúcar utilizadas, os valores médios observados foram de 5,23 e 6,28 mm, respectivamente. Analisando o desdobramento significativo entre as concentrações de carvão e de açúcar sobre a %G e NP de B. tuberculata, observou-se maior influência do açúcar do que do carvão sobre estas variáveis. As concentrações de açúcar influenciaram a %G e o NP apenas com a utilização das concentrações de 1,5 e 4,5 g L -1 de carvão no nível 5 e 1% de probabilidade respectivamente (Figura 1). Embora a % G nestes tratamentos tenha sido baixa (inferior a 50,0%) todas as sementes germinadas se desenvolveram em plântulas. O aumento das concentrações de açúcar resultou na diminuição da %G e do NP. Tanto na presença de 1,5 ou 4,5 g L -1, de carvão, as maiores %G e NP foram observadas na ausência de açúcar (5,9 e 11,1 % e 16,4 e 30,9 plantas respectivamente) (Figura 1). Estes resultados permitem estimar uma taxa de decréscimo de 0,2% e 0,56 plantas para cada grama de açúcar adicionado ao meio de cultura na presença de 4,5 g L -1 de carvão e um decréscimo de 0,13% e de 0,35 plantas com a utilização de 1,5 g L -1 de carvão. % de Germinação carvão 1,5 g/l = 5,866-0,126*x R 2 = 0,534 carvão 4,5 g/l = 11,068-0,200**x R 2 = 0, ,0 12,5 25,0 37,5 50,0 45 Nº de plantas 40 carvão 1,5 g/l= 16,398-0,349*x R 2 = 0, carvão 4,5 g/l= 30,998-0,560**x R 2 = 0, ,0 12,5 25,0 37,5 50,0 Açúcar (g L -1 ) carvão 1,5 g/l carvão 4,5 g/l carvão 1,5 g/l carvão 4,5 g/l Figura 2 Porcentagem de germinação e número de plantas de Brassavola tuberculata Hook em função do efeito conjunto das concentrações de açúcar e de duas concentrações de carvão ativado (1,5 e 4,5 g L -1 ). Universidade Federal da Grande Dourados, Dourados, 2012.

5 230 Em todas as concentrações de açúcar os maiores valores de %G e de NP foram registrados com a utilização de 4,5 g L -1 de carvão uma vez que, com a utilização de 0,0; 3,0 e 6,0 g L -1 de carvão, os valores médios de %G foram de 0,0; 1,7 e 1,8% e os de NP foram de 0,0; 5,0 e 5,0 plantas respectivamente, independentemente das concentrações de açúcar utilizadas. As concentrações de carvão apresentaram efeito significativo sobre a %G e NP apenas na ausência do açúcar (Figura 2). Para as concentrações 12,5; 25,0; 37,5 e 50,0 g L -1, os valores médios de %G foram de 3,2; 2,5; 1,6 e 0,5% e de NP foram de 9,0; 7,4; 4,5 e 1,3 plantas, respectivamente, independente das concentrações de carvão utilizadas. Conforme apresentado na Figura 2 a ausência do açúcar no meio de cultura alternativo associada à utilização de 4,5 g L -1 de carvão propiciou os maiores resultados de % de germinação (14,8%) e NP (41,3 plantas) valores estes maiores (p<0,05) que os observados para as demais concentrações. A ausência de carvão assim como a maior dose utilizada (6,0 g L -1 ) não promoveu a germinação em meio alternativo, indicando ser este componente essencial neste meio de cultivo e em concentrações que variem de 1,5 a 4,5 g L -1. Segundo Pasqual (2001) a deficiência de energia luminosa e baixa concentração de CO 2, em cultivos in vitro, dificultam a fotossíntese, fazendo com que as plântulas dependam de uma fonte externa de carboidratos os quais fornecem energia e esqueleto de carbono necessário à síntese de polissacarídeos, aminoácidos e proteínas, sendo, portanto fundamentais na germinação e crescimento de plantas submetidas a este tipo de cultivo. Os resultados observados neste trabalho mostram que B. tuberculata germina e cresce melhor sem o fornecimento suplementar de açúcar. Isso provavelmente ocorre devido à formulação do meio de cultura utilizado, uma vez que o mesmo é constituído, entre outros compostos, por banana, tomate e água de coco que fornecem as concentrações de açúcar suficientes a estas duas fases de desenvolvimento dessa orquídea. Os efeitos isolados das concentrações de carvão sobre o comprimento dos pseudobulbos e da maior raiz são apresentados na Figura 3. A maior raiz de B. tuberculata (9,41 mm) foi registrada com a utilização de 4,35 g L -1 de carvão, e o maior comprimento de pseudobulbo (7,99mm) com a utilização da dose calculada de 4,33 g L -1 de carvão. A ausência do carvão no meio alternativo não promoveu germinação. O aumento das doses de carvão propiciou respostas semelhantes em relação ao CPB e CMR de B. tuberculata, sendo observada uma correlação positiva (0,999) entre os seus valores. A partir desta concentração houve decréscimo nos valores destas variáveis evidenciando o efeito desfavorável de doses superiores a esta para o crescimento in vitro de B. tuberculata (Figura 3). A resposta de Orchidaceae em relação à suplementação de meios nutritivos com carvão é distinta para cada espécie. Enquanto neste trabalho a ausência de carvão não promoveu germinação, Chapla et al. (2009) obtiveram maior comprimento de raiz de Miltonia flavescens na ausência deste componente. Doses variando entre 1 e 2 g L -1 de carvão ativado acrescidas aos meios de cultivo, promoveram o desenvolvimento da parte aérea de Miltonia flavescens (Chapla et al., 2009) e foram benéficas à propagação in vitro de Cattleya walkeriana (Faria et al., 2002) entretanto foi necessária a adição de 5 g L -1 de carvão para a promoção do desenvolvimento da parte aérea de Catasetum fimbriatum (Morales et al., 2006). A ação benéfica do carvão, segundo Madhusudhanan e Rahiman (2000), decorre da sua capacidade em aumentar a atividade do sistema radicular pois tem a capacidade de absorver os polifenóis produzidos pelas reações químicas do meio de cultura, que podem atuar como inibidores de crescimento. Desta forma, o sistema radicular se torna mais eficiente na absorção dos nutrientes possibilitando o maior crescimento das plantas. Outro benefício do carvão segundo Grattapaglia e Machado (1998) é que simula a condição de escuro, na qual as raízes se desenvolvem melhor. A proporcionalidade no incremento em comprimento de pseudobulbos e comprimento da maior raiz dentro de determinadas concentrações de carvão reafirmam o relato de Pasqual et al. (1997) que salientam que, embora o carvão ativado não seja um regulador de crescimento, ele modifica a composição do meio de cultura, podendo regular ou melhorar o crescimento das plantas.

6 231 % de Germinação a b b c c 0,0 1,5 3,0 4,5 6,0 N de plantas a b b c c 0,0 1,5 3,0 4,5 6,0 Carvão (g L -1 ) Figura 3 - Porcentagem de germinação e número de plantas de Brassavola tuberculata Hook em função das concentrações de carvão ativado na ausência de açúcar. Universidade Federal da Grande Dourados, Dourados, ,0 12,0 CMR =0, ,305**x -0,494*x 2 R 2 = 0,674 CPB e CMR (mm) 10,0 8,0 6,0 4,0 CPB CMR CPM CMR 2,0 CPM = 0, ,687*x -0,425*x 2 R 2 = 0,705 0,0 0,0 1,5 3,0 4,5 6,0 Carvão (g L -1 ) Figura 4 Valores de comprimento de pseudobulbos (CBP) e da maior raiz (CMR) de plantas de Brasavola tuberculata Hook em função das concentrações de carvão ativado. Universidade Federal da Grande Dourados, Dourados, 2012.

7 232 Conclusão Com base nos resultados observados concluise que o carvão é necessário à germinação e ao crescimento inicial in vitro de B tuberculata e que a espécie não necessita de fornecimento suplementar de açúcar para germinação e crescimento inicial em meio de cultivo alternativo. Referências ALAM, M. K. et al. In vitro seed propagation of Dendrobium (Dendrobium transparens) orchid as influenced by different media. Biotechnology, v. 1, n. 2/4, p , BACH, E. E; CASTRO, O. L. Germinação de sementes de Cattleya sp. (Orchidaceae) em cultura de tecido visando produção de mudas. Arquivo Instituto Biológico, São Paulo, v. 71, p , CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA M. E. Meios nutritivos. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Eds.). Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA/ CNPH, p CAMPOS, D. M. Orquídea: manual prático de reprodução. 3. ed. Rio de Janeiro: Expressão e Cultura, p. CHAPLA, P. I. et al. PH, carvão ativado e agentes geleificantes do meio de cultura no crescimento in vitro de Miltonia flavescens Lindl. Plant Cell Culture & Micropopagation, v. 5, n. 2, p , FARIA, R.T. et al. Preservation of the Brazilian orchid Cattleya walkeriana Gardner using in vitro propagation. Crop Breeding and Applied Biotechnology, v.2, n.3, p , FERREIRA, D. F. Programa de análises estatísticas (Statistical Analysis Software) e planejamento de experimentos SISVAR 5.3. Lavras: Universidade Federal de Lavras, GANTAIT, S.; MANDAL, N.; DAS, P. K. Impact of auxins and activated charcoal on in vitro rooting of Dendrobium chrysotoxum Lindl. cv Golden Boy. Journal of Tropical Agriculture, v. 47, p , GEORGE, P. S.; RAVISHANKAR, G. A. In vitro multiplication of Vanilla planifolia using axillary bud explants. Plant Cell Reports, Berlin, v. 16, p , GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S., BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa - SPI ; Embrapa / CNPH, v. 1, p HOFFMANN, A. M. et al. Cultura de tecidos: aplicações na propagação de plantas. Lavras: Universidade Federal de Lavras p. IMES, R. Orchids: the illustrated identifier to over 100 cultivated varieties. London: Apple, p. KALIMUTHU, K., S. et al. In vitro propagation of the biodiesel plant Jatropha curcas L. Plant Tissue Culture Biotechnology, v.17, p , KÖPPEN, W. Climatologia: com um estúdio de los climas de la tierra. New Jersey: Laboratory of Climatology, p. MADHUSUDHANAN, K.; RAHIMAN, B. A. The effect of activated charcoal supplemented media to browning of in vitro cultures of Piper species. Plant Biology, v. 43, p , MENDONÇA, R. C. et al. (Eds.). Cerrado: ambiente e flora. Planaltina: Embrapa / CPAC, MORALES, S.; MILANEZE, M.A.G.; MACHADO, M.F.P.S. Effect of activated charcoal for seedling development of Catasetum fimbriatum Lindley (Orchidaceae). Journal of Plant Science, v.1, n.4, p , MOREIRA, M. J. S. et al. Diferentes meios de cultivo no desenvolvimento in vitro de Aechmea miniata. Magistra, Cruz das Almas, BA, v. 21, n. 4, p , PACEK-BIENIEK, A.; DYDUCH-SIEMIŃSKA, M.; RUDAŚ, M. Influence of activated charcoal on seed germination and seedling development by the asymbiotic method in Zygostates grandiflora (Lindl.) Mansf. (Orchidaceae). Folia Horticulturae, v. 22, n.2, p , PASQUAL, M. Cultura de tecidos vegetais: tecnologia e aplicações: meios de cultura. Lavras- MG: UFLA/FAEPE, p. PASQUAL, M.; HOFFMANN, A.; RAMOS, J. D. Cultura de tecidos: tecnologia e aplicações - introdução: fundamentos básicos. Lavras: UFLA/FAEPE, p. RECH A. R.; ROSA, Y. B. C. J.; ROSA-JUNIOR, E. J. Levantamento e características ecológicas de Orchidaceae da mata ciliar do Rio Dourados, Dourados-MS. Revista Árvore, v. 35, n. 3, p , 2011.

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