Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 3 a Rodada MIB 03/11

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2 Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 3ª Rodada Contagem de Bactérias Mesófilas em Leite em Pó RELATÓRIO FINAL ORGANIZAÇÃO E COORDENAÇÃO Fundação Oswaldo Cruz - Fiocruz Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde - INCQS Avenida Brasil, Manguinhos Rio de Janeiro - RJ Brasil - Cx. Postal 96 - CEP: COMISSÃO ORGANIZADORA DA RODADA - COMISSÃO DO PROGRAMA DE ENSAIO DE PROFICIÊNCIA Armi Wanderley da Nóbrega Coordenador Geral Marcus Henrique Campino de la Cruz Coordenador Técnico Maria Helena Wohlers Morelli Cardoso Coordenadora da Qualidade - COMITÊ TÉCNICO Carla de Oliveira Rosas Juliana de Castro Beltrão da Costa Marcelo Luiz Lima Brandão Márcia Barbosa Warnken Silvia Maria Lopes Bricio Valéria de Mello Medeiros 15/Fevereiro/01 Página 1 de

3 SUMÁRIO 1. Introdução Objetivos Produção dos Itens de Ensaio Escolha da Matriz Preparo do Item de Ensaio Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio Envio dos Itens de Ensaio Análise dos Resultados Resultados das Medições dos Laboratórios Estabelecimento dos Valores Designados Análise Estatística Análise de Resíduos Avaliação da Homogeneidade dos Itens de Ensaio Desvio Padrão para Avaliação de Proficiência Índice z Análise Robusta Resultados da Avaliação da Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio Avaliação da Homogeneidade Avaliação da Estabilidadede Armazenamento e de Transporte Atribuição dos Valores Designados Avaliação do Desempenho dos Laboratórios Participantes Laboratórios Participantes Resultados dos Laboratórios Participantes Cálculo do Índice z Conclusões Referências Bibliográficas Laboratórios Participantes Anexo A Homogeneidade Segundo o Protocolo Harmonizado Anexo B Valor Designado e Desvio Padrão Robusto Segundo a Norma ISO Página de

4 1. Introdução Ensaio de proficiência (EP) é o uso de comparações interlaboratoriais com o objetivo de avaliar a habilidade de um laboratório em realizar um determinado ensaio ou medição de modo competente e demonstrar a confiabilidade dos resultados gerados. Em um contexto geral, o ensaio de proficiência propicia aos laboratórios participantes: avaliação do desempenho e monitoração contínua; evidência de obtenção de resultados confiáveis; identificação de problemas relacionados com a sistemática de ensaios; possibilidade de tomada de ações corretivas e/ou preventivas; avaliação da eficiência de controles internos; determinação das características de desempenho e validação de métodos e tecnologias; padronização das atividades frente ao mercado e reconhecimento de resultados de ensaios, em nível nacional e internacional. Com a crescente demanda por provas regulares e independentes de competência pelos organismos reguladores e clientes, o ensaio de proficiência é relevante para todos os laboratórios que testam a qualidade de produtos. Além do baixo número de provedores de ensaios de proficiência na área de alimentos, os custos cobrados para a participação nestes ensaios principalmente de provedores internacionais, são normalmente muito elevados, o que inviabiliza, em muitos casos, a participação de um laboratório em um número maior de ensaios. Como forma da avaliação da qualidade técnica de laboratórios de microbiologia de alimentos, provedores de EP disponibilizam escopos de ensaios envolvendo micro-organismos de importância em microbiologia de alimentos. A contagem de bactérias mesófilas é utilizada para indicar a qualidade sanitária dos alimentos. Uma contagem elevada de micro-organismos mesófilos, dependendo do tipo de alimento, indica condições higiênicas insatisfatórias do produto. Assim, a realização de programas de ensaio de proficiência no Brasil é fundamental para o aumento da confiabilidade dos resultados das medições aqui realizadas, trazendo maior confiabilidade aos resultados emitidos, facilitando o comércio internacional e prevenindo barreiras técnicas. Visando a promoção da saúde e em apoio a maior competitividade da indústria nacional, o INCQS promoveu o Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 3ª Rodada Contagem de Bactérias Mesófilas em Leite em Pó, seguindo as diretrizes da ISO/IEC e ILAC G-13, apresentando neste relatório os resultados da avaliação de desempenho dos laboratórios participantes. Página 3 de

5 . Objetivos Determinar o desempenho de laboratórios na realização do ensaio de contagem de Bactérias Mesófilas em matriz leite em pó; Propiciar subsídios aos laboratórios para a identificação e solução de problemas. 3. Produção dos Itens de Ensaio Os procedimentos de preparo dos itens de ensaio e as análises foram realizados no Setor de Alimentos do Departamento de Microbiologia (DM) do INCQS/FIOCRUZ. A metodologia analítica empregada nos estudos de homogeneidade e estabilidade obedece aos critérios estabelecidos na norma ABNT ISO/IEC Escolha da Matriz A matriz leite foi selecionada para este ensaio por ser um alimento de elevado consumo pela população brasileira, principalmente por crianças e idosos. 3.. Preparo do Item de Ensaio Para o preparo da matriz foi utilizado Skim Milk, que consiste em um leite em pó desnatado utilizado no preparo de meios de cultura, livre de bactérias termo resistentes. Para a cultura bacteriana foram utilizadas duas cepas de diferentes espécies isoladas a partir de análises microbiológicas realizadas no Setor de Alimentos do Departamento de Microbiologia do INCQS. Após o preparo, o lote obtido foi estocado a -70ºC Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio Para o teste de homogeneidade foram selecionados aleatoriamente 10 (dez) itens de ensaio. Após a reconstituição dos liófilos, foram preparadas diluições decimais. Os itens de ensaios foram analisados em duplicata, segundo metodologia descrita por Maturin and Peeler (001). Foram realizados os estudos de estabilidade de curta duração (transporte) e de longa duração (armazenamento). A metodologia de análise empregada foi a mesma utilizada no teste da homogeneidade. Para os estudos de longa duração foi feito o controle de estoque a -70ºC (temperatura de referência) e a -0 C (temperatura de armazenamento durante o EP). O teste da estabilidade a -70ºC foi iniciado após o preparo do lote e o teste a -0 C na data de envio dos itens de ensaio para os laboratórios participantes do EP. O controle da estabilidade nas duas temperaturas descritas foi finalizado na data limite de emissão dos resultados pelos participantes. A estabilidade de curta duração, que verificou a influência da temperatura nas condições de transporte foi estudada por 4 dias, em diferentes temperaturas: 4ºC, 5ºC e 35ºC, utilizando-se o modelo Isócrono. Página 4 de

6 Os testes estatísticos foram feitos segundo o Protocolo Harmonizado e a ISO GUIDE 35; os resultados obtidos nos testes estão apresentados nos itens 5.1 e 5. deste relatório Envio dos Itens de Ensaio Para cada laboratório inscrito na 3ª Rodada do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos Contagem de Bactérias Mesófilas em Leite em Pó foram enviados dois itens de ensaio contendo os micro-organismos contaminantes em concentrações não declaradas e aproximadamente 0,1 g de leite em pó, cada um. Os itens de ensaio foram enviados aos laboratórios participantes, por via aérea em frascos devidamente lacrados e rotulados com as seguintes informações: nome do programa, item a ser ensaiado, código da amostra e rodada em questão. 4. Análise dos Resultados 4.1. Resultados das Medições dos Laboratórios Os laboratórios receberam dois itens de ensaio contendo amostra leite em pó liofilizado e foram orientados a proceder como nas análises rotineiras do laboratório, a expressar os resultados analíticos em UFC/g e informar a metodologia e os meios de cultura utilizados nas análises do EP no Formulário de Registro de Resultados. 4.. Estabelecimento dos Valores Designados As técnicas de estatística robusta são utilizadas para minimizar a influência de resultados extremos sobre estimativas de média e desvio-padrão. Assim, a Coordenação deste Ensaio de Proficiência adotou como valores designados para a contagem de bactérias mesófilas, aqueles oriundos do cálculo da estatística robusta apresentado no item 5.6 da norma lso Seguindo os critérios desta norma, os valores designados foram obtidos pela média robusta dos resultados emitidos pelos laboratórios participantes, dentro do estabelecido nos itens 1 e do tópico Valor de Referência e Desvio Padrão Alvo do protocolo deste ensaio, e pelo INCQS, conforme os procedimentos estatísticos descritos no item deste relatório Análise Estatística Neste tópico estão descritas as análises estatísticas utilizadas para a obtenção dos valores designados e do desvio padrão utilizado na análise da proficiência, para a avaliação da homogeneidade e da estabilidade das amostras e para a avaliação do desempenho dos laboratórios participantes. Página 5 de

7 Avaliação da Homogeneidade dos Itens de Ensaio O Protocolo Harmonizado foi seguido na avaliação da homogeneidade dos itens de ensaio. Um resumo do procedimento estabelecido neste documento para avaliação da homogeneidade dos itens de ensaio é apresentado no Anexo A Avaliação da Estabilidade dos Itens de Ensaio Esses testes foram empregados para se avaliar a estabilidade da concentração de bactérias mesófilas na matriz em função do tempo (longa duração) e do tempotemperatura (curta duração). Assim, foram estimadas as variâncias dos valores utilizados na regressão linear, observando-se se os valores de contagem apresentavam alguma tendência através da ferramenta estatística de análise de variância (ANOVA). A concentração de bactérias mesófilas foi considerada estável quando a inclinação da reta (ou a não linearidade) não foi significativa Desvio Padrão para Avaliação de Proficiência Nesta rodada de ensaio de proficiência o desvio padrão para avaliação de proficiência dos laboratórios participantes foi calculado como recomendado no item 6.6 da norma ISO 1358, isto é, a partir do desvio padrão robusto calculado a partir dos resultados dos participantes (e do INCQS), usando o algoritmo A do anexo C desta norma. O procedimento adotado no cálculo do Desvio Padrão Robusto é descrito no Anexo B Índice z Para a qualificação dos resultados dos laboratórios, o índice z (z-score, medida da distância relativa do resultado da medição do laboratório em relação ao valor designado do ensaio de proficiência) foi calculado de acordo com a Equação 1. Y i Y ref z (1) onde: Y i representa o valor do laboratório participante, Y ref representa o valor designado e σ, o desvio padrão robusto. A interpretação do valor do índice z está descrita abaixo: z - Resultado satisfatório < z < 3- Resultado questionável z 3 - Resultado insatisfatório Análise Robusta Nesta rodada o valor designado foi calculado através da análise robusta (ISO 1358), documento complementar à ISO/IEC O procedimento adotado no cálculo do valor designado é descrito no Anexo B. Página 6 de

8 5. Resultados da Avaliação da Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio 5.1. Avaliação da Homogeneidade No teste de homogeneidade para cada um dos 10 itens de ensaio foram realizadas duas análises completas produzindo dois resultados (A e B), como mostrado na Tabela 1. Tabela 1: Dados gerados no teste de homogeneidade. Amostra Contagem (UFC/mL) Log (Contagem) A B A B ,061 3, ,30 3, ,67 3, ,104 3, ,130 3, ,15 3, ,94, ,167 3, ,053 3, ,940 3,104 A Tabela apresenta os resultados da análise estatística do estudo de homogeneidade. Tabela : Sumário das análises estatísticas, em log (contagem). Média p all s an s sam c Resultado B. Mesófilas 3, ,5000 0, , , ,0030 Suficientemente homogêneo Desta forma, consideraram-se os itens de ensaio suficientemente homogêneos para a finalidade deste Ensaio de Proficiência. 5.. Avaliação da Estabilidade de Armazenamento e de Transporte No decorrer do EP, foram avaliadas as flutuações temporais nas concentrações dos microorganismos utilizados nas temperaturas de referência (-70 o C) e de armazenamento durante o EP (-0 C) (Tabelas 3 e 4). A influência da temperatura nas condições de transporte também foi estudada por 4 dias(tabela 5). Estas avaliações foram realizadas utilizando-se a análise de resíduos da regressão linear. Tabela 3: Teste de estabilidade na temperatura de referência (-70 o C), em UFC/mL. Resultados Dias Frasco 1 Frasco Frasco 3 Frasco 4 Frasco 5 Frasco 6 Log das A B A B A B A B A B Frasco A B 1 Médias 0 196,5 196,5 196,5 196,5 196,5 196,5 196,5 196,5 196,5 196,5 196,5 196,5 3, , , , , ,96614 Página 7 de

9 Tabela 4: Teste de estabilidade na temperatura de armazenamento (-0 C), em UFC/mL. Resultados Dias Frasco 1 Frasco A B A B Log das Médias , a a, , , a a, ,85657 a Incontável. Tabela 5: Análise de regressão para os diferentes estudos de estabilidade, em UFC/mL.dias -1. Bactérias Intervalo de confiança Coeficiente Angular Erro padrão Resultado Mesófilas Inferior Superior Referência -0, ,0008-0, ,0015 Estável Armazenamento -0, ,00-0, ,0060 Estável Transporte 4 o C -0,0117 0, , ,08440 Estável Transporte 5 o C -0, , ,4606 0,11873 Estável Transporte 35 o C -0,0810 0,0644-0, ,0094 Estável Os resultados obtidos no tratamento estatístico dos dados gerados nos estudos de estabilidade de armazenamento e de transporte evidenciaram que o valor do intervalo de confiança para o coeficiente angular abrange o valor zero (0). Conclui-se, portanto, que os itens de ensaio mostraram-se suficientemente estáveis nas condições estabelecidas nos estudos. 6. Atribuição dos Valores Designados Os valores designados relativos à concentração de bactérias mesófilas empregados neste ensaio de proficiência foram calculados segundo procedimento estatístico descrito no item 4.3.5; o respectivo desvio padrão para avaliação de proficiência foi obtido pelo algoritmo A do anexo C da norma ISO 1358, conforme o item O valor designado e o seu respectivo desvio padrão, bem como os laboratórios que contribuíram para este cálculo, estão apresentados na Tabela 6. Tabela 6: Valor designado e desvio padrão (em Log (UFC/mL)). Desvio Valor Padrão designado (σ) Laboratórios,888 0,178 MIB 03/001 a ; MIB 03/003; MIB 03/006; MIB 03/010 b ; MIB 03/01; MIB 03/013; MIB 03/051; MIB 03/056 c ; MIB 03/057; MIB 03/063; MIB 03/079; MIB 03/081; MIB 03/089; MIB 03/094; MIB 03/097; MIB 03/104; MIB 03/117; MIB 03/11; MIB 03/1; MIB 03/16; MIB 03/18; MIB 03/131; MIB 03/136; MIB 03/141; MIB 03/157; MIB 03/164; MIB 03/165; MIB 03/167 d ; MIB 03/174; MIB 03/176; MIB 03/181; MIB 03/188; MIB 03/19; MIB 03/199; INCQS e a Somente item de ensaio # 5; b Somente item de ensaio # 96; c Somente item de ensaio #115; d Somente item de ensaio # 53; e Valor médio do estudo de homogeneidade. Página 8 de

10 7. Avaliação do Desempenho dos Laboratórios Participantes 7.1. Laboratórios Participantes Quarenta e quatro laboratórios se inscreveram no Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 3ª Rodada Contagem de Bactérias Mesófilas em Leite em Pó, e todos enviaram os resultados. Dos laboratórios que enviaram resultados, onze (5,0 %) são acreditados na norma ISO/IEC 1705 e seis (13,6 %) estão em processo de acreditação nesta análise. 7.. Resultados dos Laboratórios Participantes Os dados reportados pelos laboratórios participantes do ensaio de proficiência foram tratados de acordo com os procedimentos descritos na ISO/IEC e na ILAC G-13. A Tabela 7 apresenta os resultados dos laboratórios para as análises dos dois itens de ensaio enviado e a metodologia empregada. O gráfico da dispersão dos resultados dos laboratórios participantes encontra-se na Figura 1. Neste gráfico a linha central representa o valor designado. Página 9 de

11 Tabela 7: Resultados por análise (UFC/mL) e Metodologia Empregada Laboratórios Item Resultado Item Resultado Metodologia (1) MIB 03/001 # # MAPA MIB 03/003 # # BAM MIB 03/006 # # MAPA MIB 03/010 # # APHA MIB 03/01 # # MAPA MIB 03/013 # # MAPA MIB 03/015 # # APHA MIB 03/018 # # OUTROS MIB 03/051 # # MAPA MIB 03/056 # # MAPA MIB 03/057 # # APHA MIB 03/063 # # APHA MIB 03/065 # # OUTROS MIB 03/079 # # MAPA MIB 03/081 # # MAPA MIB 03/089 # # OUTROS MIB 03/094 # # OUTROS MIB 03/095 # # Não Informado MIB 03/097 # # OUTROS MIB 03/104 # # MAPA MIB 03/117 # # MAPA/APHA MIB 03/11 # # MAPA MIB 03/1 # # MAPA/BAM MIB 03/16 # # OUTROS MIB 03/18 # # APHA MIB 03/131 # # APHA MIB 03/136 # # APHA MIB 03/141 # # APHA MIB 03/150 # # APHA MIB 03/151 # # APHA MIB 03/157 # # APHA MIB 03/164 # # MAPA MIB 03/165 # # APHA MIB 03/167 # # APHA MIB 03/174 # # APHA MIB 03/176 # # APHA MIB 03/177 #06 50 #046 9 APHA MIB 03/180 #0 < 1 #030 < 1 APHA MIB 03/181 # # OUTROS MIB 03/18 # # BAM MIB 03/188 # # MAPA MIB 03/19 # # APHA MIB 03/198 # # APHA MIB 03/199 # # APHA INCQS (3) BAM (1) BAM Bacteriological Analytical Manual-FDA, 8 th ed, 1998 MAPA Instrução Normativa n 6/003 Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento APHA AMERICAM PUBLIC HEALTH ASSOCIATION - Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4 th ed, 001 () Outros: AOAC ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS - Official Method ISO INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of microorganisms - Colony-count technique at 30 degrees C, 003 MMAMAA da silva, N.; Junqueira, V. C. A.; Silveira, N. F.A.; Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos e Água - 4 ed 010 SM Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (3) Resultado = valor médio do estudo de homogeneidade; Página 10 de

12 Figura 1: Dispersão dos resultados das contagens Página 11 de

13 7.3. Cálculo do Índice z A avaliação de desempenho dos laboratórios participantes e do INCQS, expressa através do índice z (Equação 1), está apresentada na Tabela 8. Tabela 8: Valores do índice z obtidos pelos laboratórios participantes e pelo INCQS. Código do Laboratório Item z-score Item z-score MIB 03/001 #05 0,0 #067-1,0 MIB 03/003 #106 0,6 #114 0,9 MIB 03/006 #014-0,6 #07-0,3 MIB 03/010 #09 0,0 #096 1,6 MIB 03/01 #064 0,9 #047-1,0 MIB 03/013 #01-1,0 #033-0,3 MIB 03/015 #043-0,6 #071 0,3 MIB 03/018 #039-1,3 #055-1,9 MIB 03/051 #083 0,3 #107 0,3 MIB 03/056 #097,4 #115 0,6 MIB 03/057 #003 0,8 #117 0,3 MIB 03/063 #040 0,0 #08 0,3 MIB 03/065 #08 3, #068 1,6 MIB 03/079 #001 0,9 #057 -,3 MIB 03/081 #036-0,3 #048-0,6 MIB 03/089 #010 1,4 #066 1,4 MIB 03/094 #004-0,1 #00-0, MIB 03/095 #01-9,6 #078-10,6 MIB 03/097 #038-0,6 #093-0,6 MIB 03/104 #059-0,3 #069 0,9 MIB 03/117 #035 -,8 #073 -,6 MIB 03/11 #074 3,3 #104,9 MIB 03/1 #011 0,9 #045 1,1 MIB 03/16 #017-1,4 #088-0,6 MIB 03/18 #007-1,0 #090-0,6 MIB 03/131 #041-0,3 #058-1,0 MIB 03/136 #006-5,1 #10-3,3 MIB 03/141 #031 0,9 #111 0,3 MIB 03/150 #081,0 #116 1,1 MIB 03/151 #00 1,6 #09 0,9 MIB 03/157 #018-0,3 #118-1,0 MIB 03/164 #04 0,5 #070 1,1 MIB 03/165 #076 0,0 #079-1,8 MIB 03/167 #049 1,5 #053 0,3 MIB 03/174 #05 0,9 #095 0,6 MIB 03/176 #061-1,8 #080 -,4 MIB 03/177 #06-14,4 #046-16,7 MIB 03/181 #086 0,9 #119 0,6 MIB 03/18 #013 1,6 #07-0,6 MIB 03/188 #037-1,5 #044-1,0 MIB 03/19 #019 0,0 #056, MIB 03/198 #080-9,6 #101-8,6 MIB 03/199 #054 0,7 #100 0,9 INCQS -0,3 ND = Não detectado; Azul = resultado questionável, Vermelho = resultado insatisfatório. As Figuras e 3 apresentam os resultados de índice z obtidos pelos laboratórios participantes para os dois itens de ensaio. Página 1 de

14 Figura : Gráfico de z-score dos laboratórios participantes para o Item de Ensaio de menor numeração. Página 13 de

15 Figura 3: Gráfico de z-score dos laboratórios participantes para o Item de Ensaio de maior numeração. Página 14 de

16 Os resultados reportados como ausência ou <10 podem ser considerados insatisfatórios. Assim, o laboratório MIB03/180 (os dois itens de ensaio) teve estes resultados considerados insatisfatórios. De acordo com os resultados obtidos, quatorze (31,8%) dos quarenta e quatro laboratórios participantes obtiveram resultados questionáveis ou insatisfatórios para, pelo menos, um item de ensaio analisado. De um total de oitenta e oito resultados reportados, aproximadamente 75,0% foram considerados satisfatórios (sessenta e seis resultados), 8,0% foram considerados questionáveis (sete resultados), e 17,0% insatisfatórios (quinze resultados). Os participantes cujos formulários foram preenchidos de maneira diferente da orientação ou que cometeram erros na descrição dos resultados finais, não tiveram seus resultados computados no cálculo do valor designado e do desvio padrão robusto. No entanto, obtiveram uma avaliação final dos seus resultados. O laboratório MIB 03/001 informou que ocorreu problemas na dissolução do item de ensaio de número 05. O laboratório MIB 03/094 informou o crescimento de colônias invasoras. A metodologia mais utilizada foi a da Americam Public Health Association, com vinte e um laboratórios utilizando. Lembramos que o índice z é apenas um indicativo do desempenho do laboratório, cabendo a cada laboratório participante fazer a sua interpretação e implementar as ações corretivas, caso necessário. 8. Conclusões A análise criteriosa dos dados gerados neste EP sugere: Desempenho dos laboratórios: pode-se considerar como razoável, visto que seis laboratórios tiveram todos os resultados considerados insatisfatórios, dois laboratórios apresentaram apenas um resultado insatisfatório, um laboratório apresentou os dois resultados questionáveis, quatro laboratórios tiveram um dos resultados questionável e um laboratório apresentou um resultado questionável e outro insatisfatório e somente trinta laboratórios (68%) apresentaram todos os resultados satisfatórios; Preenchimento do formulário: a maioria dos laboratórios preencheu o formulário conforme estabelecido, contudo, alguns campos importantes ainda foram deixados em branco prejudicando a avaliação dos resultados; Ações corretivas: Para os laboratórios que obtiveram resultados insatisfatórios ou questionáveis, ações corretivas devem ser adotadas para o aprimoramento das suas medições, particularmente quando resultados insatisfatórios foram também obtidos em rodada anterior desse EP. Uma Página 15 de

17 avaliação detalhada, desde o recebimento do material e seu armazenamento, até o preenchimento do Formulário para Registro dos Resultados, e a avaliação de todos os passos da metodologia de análise, serão importantes para a identificação dos pontos críticos. Finalmente, é importante ressaltar que o estabelecimento de ações corretivas e a contínua participação em ensaios de proficiência desta natureza são ferramentas de grande contribuição para o aprimoramento das medições realizadas pelos laboratórios. 9. Referências Bibliográficas ABNT ISO/IEC Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de Ensaio e Calibração, 005. CHUI, Q. S. H.; BISPO, J. M. de A.; IAMASHITA, C. O.; O papel dos programas interlaboratoriais para a qualidade dos resultados analíticos. Química Nova, Vol. 7 (06), , 004. Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial. Vocabulário Internacional de Metrologia: Conceitos Fundamentais e Gerais e Termos Associados (VIM 008). Rio de Janeiro, 008. International Laboratory Accreditation Cooperation- ILAC G13.Guidelines for the requirements for the competence of providers of proficiency testing schemes, 007 International Organization for Standardization ISO/IEC Conformity assessment General requirement for proficiency testing. Geneva, 010. International Organization for Standardization ISO GUIDE 35 - Reference materials General and statistical principles for certification. Geneva, 006 International Organization for Standardization ISO Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons MATURIN, L. e PEELER, J.T Aerobic Plate Count. In: Bacteriological analytical manual Online. [S.l]; FDA, 001. Disponível em: anualbam/uc m htm. Acesso em: 0 jan. 01. ROSAS, CARLA DE OLIVEIRA, et al. Desenvolvimento de Material de Referência em Microbiologia de Alimentos. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 010: 15-. The International Harmonized Protocol for the Proficiency Testing of Analytical Chemistry Laboratories.Pure Appl. Chem., Vol. 78, N o. 1, pp , 006. Página 16 de

18 10. Laboratórios Participantes A lista dos laboratórios que enviaram os resultados à coordenação do Programa é apresentada na Tabela 9. Tabela 9: Laboratórios participantes do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 3ª Rodada Contagem de Bactérias Mesófilas em Leite em Pó. Instituição BioQuality Análises, Pesquisa e Desenvolvimento Ltda. BRF Brasil Foods TOLEDO Laboratório Microbiologia Centro de Laboratório Regional Instituto Adolfo Lutz Campinas Microbiologia de Alimentos Centro de Laboratório Regional Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão Preto VI Núcleo de Ciências Químicas e Bromatológicas - Laboratório de Microbiologia de Alimentos Centro de Laboratório Regional Instituto Adolfo Lutz Santo André VIII Centro de Laboratório Regional - Instituto Adolfo Lutz Santos IX Microbiologia Alimentar Centro de Qualidade Analítica Ltda. CETAL S/C Ltda. Eurofins do Brasil Análises de Alimentos Ltda. Food Intelligence Consultoria Técnica em Alimentos S/S Ltda. Laboratório de Microbiologia FRB Campany Laboratório de Análise de Água Ltda. Laboratório Campany Fundação Ezequiel Dias LACEN - MG Laboratório de Microbiologia de Alimentos Serviço de Microbiologia de Produtos/DIVISA/DIOM/FUNED Fundação Núcleo de Tecnologia Industrial do Ceará- NUTEC Lab. de Análises para Certificação de Produtos do Caju IBERPHARM Laboratórios do Brasil Ltda Laboratório de Controle de Qualidade Microbiológico Instituto Adolfo Lutz Núcleo de Microbiologia Instituto de Tecnologia de Alimentos - ITAL Unidade Laboratorial de Referência de Microbiologia Instituto Mineiro de Agropecuária - IMA Laboratório de Segurança Microbiológica em Alimentos - LSMA IPB LACEN / FEPPS RS - LACEN RS Seção de Microbiologia de Águas e Alimentos ITAAL Instituto Técnico de Análises de Alimentos Ltda. Laboratório ITAAL Laboratório Central de Saúde Pública de Alagoas Dr. Aristeu Lopes - LACEN AL - Secretaria de Estado da Saúde de Alagoas Laboratório Central de Saúde Pública do DF LACEN - DF Laboratório de Microbiologia de Alimentos Laboratório Central de Saúde Pública do Estado do Amazonas LACEN AM Laboratório de Microbiologia de Alimentos Laboratório Central de Saúde Pública Dr. Costa Alvarenga LACEN-PI Laboratório de Bromatologia Página 17 de

19 Laboratório Central de Saúde Pública Estadual LACEN - MS Laboratório de Microbiologia de Alimentos Laboratório Central de Saúde Pública Prof. Gonçalo Moniz LACEN - BA Laboratório de Microbiologia de Alimentos Laboratório Central Dr. Almino Fernandes LACEN - RN Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Ambiente Laboratório de Alimentos e Assessoria M. Mattos Ltda. Grupo Mattos e Mattos Laboratório de Saúde Pública Dr. Giovanni Cysneiros LACEN - GO Laboratório Nacional Agropecuário LANAGRO MG Laboratório Nacional Agropecuário em Goiás LANAGRO GO Laboratório de Microbiologia em Alimentos e Água Laboratório Nacional Agropecuário no Pará LANAGRO - PA LMA Laboratório Microbiologia de Alimentos e Água LACEN AC Laboratório de Microbiologia de Alimentos Divisão de Produtos do LACEN AC LACEN-SC Setor de Microbiologia de Alimentos - MICRA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento LANAGRO MG / SLAV - RJ Laboratório de Microbiologia Secretaria da Saúde de Guarulhos Lab. de Saúde Pública Dr. Jefferson Ignacio de Araújo Secretaria de Estado de Saúde do Paraná LACEN - PR Laboratório Central do Estado do Paraná DLVSA Seção de Microbiologia de Alimentos Secretaria de Saúde LACEN - CE Laboratório Central de Saúde Pública Secretaria de Saúde Pública do Estado de Pernambuco Laboratório Central Dr. Milton Bezerra Sobral - LACEN PE Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial SENAI - SC LANAL PEP SENAI / SC TECPAR Instituto de Tecnologia do Paraná LAMT Laboratório de Microbiologia e Toxicologia UNIDAVI Centro Universitário para o Desenvolvimento do Alto Vale do Itajaí UNILABOR - Laboratório de Microbiologia - UNIDAVI Universidade de Caxias do Sul Laboratório de Análises e Pesquisa em Alimentos Universidade Federal de Pernambuco Laboratório Experimental de Análises de Alimentos LEAAL Universidade Federal de Uberlândia Laboratório de Biotecnologia Animal Aplicada LABIO Total de participantes: 44 laboratórios O código de cada participante não está associado à ordem da lista de participantes. Página 18 de

20 Anexo A Homogeneidade Segundo o Protocolo Harmonizado Foram retirados aleatoriamente dez itens de ensaio; após a reconstituição e homogeneização do liófilo, duas alíquotas foram transferidas para placas de Petri estéreis. As placas foram analisadas em ordem aleatória e sob condições de repetitividade através de um método apropriado. Para verificar a ocorrência de problemas estatísticos, os dados foram dispostos num gráfico simples de resultados x número de amostra e analisados visualmente em busca de características usuais em diagnóstico, tais como: (a) tendências ou descontinuidades; (b) distribuição não-aleatória de diferenças entre o primeiro e segundo resultado de ensaio; (c) arredondamento excessivo; e (d) resultados dispersos intra-amostras. Como não foi verificado nenhum problema estatístico, os dados foram usados para estimar as variâncias analíticas e amostral conforme descrito abaixo: Valores Dispersos Primeiramente foi aplicado o teste de Cochran aos resultados, com o propósito de eliminar possíveis valores dispersos. Assim, calculou-se a soma, S i, e a diferença, D i, de cada par de resultados, para i = 1 até 10. Calculou-se a soma dos quadrados S DD das m diferenças a partir da Equação 1: S DD D i A estatística do teste de Cochran (Equação ) é a razão entre quadrado, e a soma dos quadrados das diferenças: (1) D max, a maior diferença ao D C S Foi calculada a razão acima e comparada com o valor crítico apropriados da tabela de teste de Cochran para um nível de confiança de 95 %. max DD () Não-homogeneidade significativa A mesma soma dos quadrados das diferenças (Equação 4) foi utilizada para calcular a variância analítica, s an, Equação 3. s an D / m MS (3) w i Página 19 de

21 Onde D i é a diferença de cada par de resultados do teste de homogeneidade e m é o número de recipientes selecionados para o teste de homogeneidade. A seguir, calculou-se a variância V S das somas S i de acordo com a Equação 4: Onde s é a média de S i. vs MSB (si s) /(m 1) (4) Calculou-se a variância amostral, s, de acordo com a Equação 5 sam s sam (MS MS )/ (5) B w Calculou-se a variância amostral aceitável, para avaliação da homogeneidade. all, como all ( 0,3 p) onde p é o desvio padrão Xm -1; 0,95 Tomando-se os valores de F 1 e F, onde F1 e F (m 1) crítico de homogeneidade para o ensaio como (Equação 6): (F m-1;m; 0,95 1), calculou-se o valor Como s sam 1 all F san c F (6) < c, não há evidência de que o desvio-padrão amostral na população de amostras ultrapassa a fração aceitável do desvio-padrão alvo. Página 0 de

22 Anexo B Valor Designado e Desvio Padrão Robusto Segundo a Norma ISO 1358 A Norma ISO 1358 é um documento complementar à ISO/IEC e fornece os métodos estatísticos a serem empregados nos ensaios de proficiência. Este documento descreve a análise robusta envolvendo o emprego da estimativa do algoritmo A para o cálculo do valor designado e do desvio padrão. Neste EP, somente o valor designado foi calculado através da análise robusta, sendo o desvio padrão estimado através das equações derivadas do modelo geral de Horwitz (4.3.3). Inicialmente, todos os valores objetos da análise (valores enviados pelos laboratórios participantes e pelo INCQS) foram colocados em ordem crescente. A seguir, foram calculados os valores da mediana de x i (x*) e do desvio padrão (s*), conforme as Equações 1 e. x* medianade x i (1) s* x * 1,483 med xi () Onde: med é a mediana; x i valor de concentração reportado pelo laboratório. Em seguida, foi calculado o valor de F i, segundo a Equação 3, e a partir da estimativa de F i, calculou-se o novo valor inferior (concentração inferior), e o novo valor superior (concentração superior), através das Equações 4 e 5. F i = 1,5s* (3) Novo Valor Superior= x* + F i (4) Novo Valor Inferior= x* - F i (5) Os novos valores, superior e inferior, foram comparados a cada um dos resultados individuais dos laboratórios participantes, e os que estavam acima do valor superior ou abaixo do valor inferior foram descartados, ou seja, foram considerados valores dispersos ou discrepantes e substituídos pelos novos valores superiores e inferiores. Este procedimento compreende a um ciclo ou Ciclo 0. Iniciou-se um novo ciclo, a partir do cálculo da média robusta (x*) 1 e do desvio padrão (s) dos novos valores encontrados, e a seguir calculou-se o novo desvio padrão robusto (s*). O novo valor de s* foi calculado pela Equação 6: (6) 1 Na ISO 1358 quando se inicia o Ciclo 1, x* passa a ser denominado como média robusta, uma vez que advém de um algoritmo robusto. Na ISO 1358 quando se inicia o Ciclo 1, s* passa a ser denominado como desvio padrão robusto, uma vez que advém de um algoritmo robusto. Página 1 de

23 Em seguida, calculou-se novamente o valor de F i, os novos valores superiores e inferiores, conforme descrito, respectivamente, nas Equações 3, 4 e 5, sendo os valores discrepantes substituídos pelos novos limites. Este procedimento corresponde a outro ciclo ou Ciclo 1. O ciclo é reiniciado até o momento em que os valores da nova média robusta (x*) e do novo desvio padrão robusto (s*) convergirem, ou seja, até que não haja nos ciclos, diferença entre eles. Neste momento o ciclo é finalizado e os novos valores de x* e s*, que são os valores da média robusta (valor designado do EP) e do desvio padrão robusto. Página de

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