Instruções de Uso XGEN MULTI SEPSE CHIP HS24

Instruções de Uso XGEN MULTI SEPSE CHIP HS24 Kit MULTIPLEX para detecção de patógenos causadores de SEPSE e genes de resistência através de PCR e hibridização reversa 1. USO PRETENDIDO O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP é um teste qualitativo in vitro que detecta simultaneamente a presença de ácido nucleico bacteriano e fúngico, além dos principais genes de resistência a antibióticos em amostras de hemoculturas positivas e swabs retais, sem a necessidade da extração de DNA. Atua como auxílio para a avaliação de infecções de mais de 36 espécies que levam a quadros de SEPSE como: Staphylococcus Coagulase Negativa, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Enterococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Neisseria meningitidis, Stenotrophomonas maltophilia, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, espécies de Enterobacteriaceae e Proteus spp, Candida albicans, Candida spp., e 20 marcadores de genes de resistência a antibióticos: meticilina (meca), dois genes para resistência à vancomicina (vana e vanb), dois para a resistência aos antibióticos β-lactamase (blashv, blactx-m) e quinze genes para a resistência ao carbapenemase (kpc, sme, nmc/imi, ges, vim, gim, spm, ndm, sim, imp, oxa23, oxa24, oxa48, oxa51 e oxa58). Patógenos Staphylococcus Coagulase-Negativa Streptococcus spp. Streptococcus agalactiae Listeria monocytogenes Alvo 16S rdna Enterococcus spp. Acinetobacter baumannii Neisseria meningitidis Stenotrophomonas maltophilia Escherichia coli Serratia marcescens Enterobacteriaceae Proteus spp. Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Candida spp. Candida albicans nuc cpsa ecfx khe 18S-5.8S ITS rdna O kit foi otimizado para uso nos aparelhos HybriSpot 12 (HS12) e HybriSpot 24 (HS24) Vitro Group. PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO. ATENÇÃO: Esta Instrução de Uso é destinada para orientar o uso com o HybriSpot 24. Para utilização do protocolo com o equipamento HybriSpot 12, verificar a Instrução de Uso KIT XGEN MULTI SEPSE CHIP HS12. 2. INTRODUÇÃO A SEPSE é uma disfunção orgânica potencialmente fatal causada por uma resposta imune desregulada a uma infecção. Normalmente causada por bactérias, fungos, vírus ou protozoários. Pode estar relacionada a qualquer foco infeccioso, como pneumonia, infecção intra-abdominal e urinária. Importante causa de morbidade e mortalidade, principalmente em hospitais e Unidades de Terapia Intensiva (UTI), pacientes pediátricos e particularmente 1

em pacientes debilitados. Além do aumento de incidência de infecções nosocomiais, a proporção de patógenos multirresistentes também vem crescendo. As taxas de resistência antimicrobiana entre patógenos estão aumentando principalmente entre organismos gram-negativos (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii e Klebsiella pneumoniae). Devido à alta morbimortalidade da SEPSE, é imprescindível sua rápida identificação. Suas manifestações podem ser confundidas com as de outros processos não infecciosos ou podem, em muitos casos, passar despercebidas. Estudos mostram que a rápida identificação da SEPSE associada à terapêutica adequada, pode trazer resultados favoráveis para o paciente. Para identificação da SEPSE, deve-se levar em conta um fator de extrema importância: o tempo. O uso de antimicrobianos específicos na primeira hora, logo após o diagnóstico, contribui para a sobrevivência do paciente. 3. PRINCÍPIO DO TESTE O princípio do ensaio é baseado em uma metodologia que envolve simultaneamente a amplificação multiplex de diferentes bactérias, fungos e marcadores de genes de resistência a antibióticos por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) seguido de hibridização reversa (Dot Blot) com sondas específicas imobilizadas em um chip composto por membrana de nylon (tecnologia Flow Chip). O processo de hibridização permite a ligação dos produtos de PCR biotinilados às sondas complementares presentes no chip e o sinal de hibridização é desenvolvido por uma reação colorimétrica imunoenzimática (estreptavidina-fosfatase alcalina e cromógeno NBT-BCIP). A reação substrato-cromógeno gera um precipitado de coloração roxo escuro na posição em que o fragmento amplificado hibridiza com a sonda específica e este sinal é automaticamente capturado e analisado pelo software do equipamento. 4. COMPONENTES PCR O formato padrão do kit contém reagente e chip para 24 ou 48 testes. COMPONENTES Primers 1 SPS Primers 2 SPS CONTEÚDO Solução de Primers biotinilados para detecção de Staphylococcus Coagulase Negativo, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Enterococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Neisseria meningitidis, Stenotrophomonas maltophilia, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, espécies de Enterobacteriaceae e Proteus spp, Candida albicans, Candida spp, e os genes meca, vana, vanb, blashv, blactx-m e Controle Interno (CI). Solução de Primers biotinilados para detecção de genes de resistência para carbapenemicos como kpc, sme, nmc/imi, ges, vim, gim, spm, ndm, sim, imp, oxa23, oxa24, oxa48, oxa51, oxa58 e Controle exógeno. Volume 24 Testes Volume 48 Testes 950 µl 2 x 950 µl 950 µl 2 x 950 µl EZ SPS Enzima DNA Polimerase Hot Start 24 µl 2 x 24 µl UDG SPS Enzima Uracila DNA Glicosilase 34 µl 2 x 34 µl * Cada frasco contém um volume adicional para imprecisão de pipetagem. 2

5. COMPONENTES DE HIBRIDIZAÇÃO COMPONENTES CONTEÚDO Volume 24 Testes Volume 48 Testes Reagente A Solução de Hibridização 60 ml 115 ml Reagente B Solução de Parada de Reação 10 ml 18 ml Reagente C Estreptavidina-Fosfatase Alcalina 10 ml 18 ml Reagente D Tampão de lavagem I 35 ml 70 ml Reagente E1 Substrato 14 ml 20 ml Reagente E2 Cromógeno 14 ml 20 ml Reagente E Frasco vazio para preparo do Reagente E (E1 + E2) - - Reagente F Tampão de Lavagem II 18 ml 35 ml Chip SPS Chip SEPSE 24 unidades 6. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE 2 x 24 unidades Reagentes de PCR: Os componentes do kit devem ser armazenados na embalagem original. Armazenar a temperatura de -20 C. Decongelar os componentes em gelo antes do uso. Os reagentes são estáveis até a data de vencimento indicada no rótulo. Evitar o congelamento e o descongelamento dos reagentes por mais de cinco vezes, pois pode reduzir a sensibilidade do ensaio. Para evitar o congelamento e descongelamento repetidas vezes é recomendado adicionar a cada Primers (1 e 2) a EZ e a UDG, e subsequentemente aliquotar as misturas (36 µl/alíquota) em microtubos de PCR 0,2 ml e armazenar a -20 C em período máximo 3 de meses. Reagentes de Hibridização: Os componentes do kit devem ser armazenados entre 2 C a 8 C. Não congelar. Os reagentes e o chip são estáveis até a data de vencimento indicada no rótulo. A solução de desenvolvimento (Reagente E) deve ser preparada somente antes do uso. A Solução de Hibridização (Reagente A) deve ser levada a 51 C antes do uso e os outros reagentes devem ser utilizados a temperatura ambiente (20 C a 25 C). 7. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS Reagentes para purificação de DNA (se necessário); Micropipetas calibradas (0,5 µl < volume < 1000 µl); Microcentrífuga; Banho Maria (51 C); Equipamento para Hibridização HybriSpot 24 e software HybriSoft; Racks para microtubos; Rack termostável (4 C) para tubos/placas de PCR; Ponteiras estéreis com e sem filtro; Microtubos 1,5-2,0 ml livres de nucleases; Strips/Microtubos/Microplacas de PCR HS24; Luvas descartáveis sem talco; Termociclador; Agitador tipo vortex ou similar. 8. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado. 2. O pessoal técnico deve ser profundamente treinado na manipulação de reagentes de biologia molecular e qualificados em protocolos de amplificação de PCR. 3

3. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar equipamentos de proteção individual. O uso de objetos perfuro-cortantes deve ser evitado. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor. 4. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados contra tétano, difteria, hepatite B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com a Norma Regulamentadora 32. 5. O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar. 6. Evitar vibração na superfície da bancada onde o teste é realizado. 7. Após o recebimento, armazenar o kit de PCR a -20 C, em um freezer ou câmara fria com temperatura controlada e o kit de hibridização em geladeira de 2 a 8 C. 8. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits. Recomenda-se que os componentes entre dois kits do mesmo lote também não sejam trocados. 9. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis pesadas ou grumos. Caso contrário, comunicar o supervisor do laboratório para iniciar os procedimentos necessários para reposição do kit. 10. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada amostra. 11. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as entre o uso de cada uma. 12. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta externa. 13. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as amostras de soro humano, sangue, plasma devem ser manuseadas em Nível de Biossegurança 2, como recomendado pela legislação em vigor. 14. Armazenar e extrair as amostras separadamente de outros reagentes e utilizar sala dedicada para o manuseio. 15. Realizar os procedimentos o mais rápido possível, mantendo os componentes de PCR no gelo ou em reservatório refrigerado. 16. O fluxo de trabalho no laboratório deve proceder de maneira unidirecional, começando na área de extração (quando aplicável) e passando para a amplificação e área de análises de dados. Não retornar as amostras, equipamentos e reagentes para a área onde as primeiras etapas foram realizadas. 17. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos componentes líquidos ou na transferência dos componentes para sistemas automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada. 18. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados, de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor. 19. Outros resíduos gerados (exemplo: ponteiras usadas para amostras) devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados, de acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais. 20. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das amostras devem ser absorvidos por lenços de papel umedecidos com hipoclorito, e em seguida, com água. 9. AMOSTRAS: PREPARAÇÃO E RECOMENDAÇÕES O ensaio deve ser utilizado com amostras diluídas de hemocultura positiva e swabs retais de origem humana. Recomenda-se que as amostras de hemocultura fiquem armazenadas a -20 C por até uma semana. 4

OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: Para utilização do kit com outras amostras deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 10. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS Reagentes de PCR Soluções prontas para uso. Antes de utilizar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. A fim de evitar repetidos descongelamentos, recomenda-se aliquotar os Primers 1 e 2 SPS com as enzimas EZ SPS e UDG SPS, de acordo com a tabela do item 13. Fracionar em 36 µl/alíquota e armazenar por no máximo 3 meses. Nota: O descongelamento de todos os componentes deve ser realizado no gelo. Reagentes A, B, C, D e F (Hibridização) Reagentes prontos para uso. Reagente E (Hibridização) A solução é fornecida em dois reagentes (Reagente E1 e E2) que devem ser misturados numa proporção de 1:1. Preparar a solução de acordo com a quantidade de amostras que serão processadas, antes da sua utilização, no frasco E. Após cada uso, limpar o frasco E com água destilada para evitar acúmulo de precipitados em utilizações consecutivas. Seguir a tabela de acordo com o item Reação de Hibridização/ Hibridização tópico 2. Chip (Hibridização) Os chips são de uso único e devem ser manuseados com luvas. Nunca tocar a membrana do chip. Para o manuseio, tocar somente na lateral do chip. 11. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O KIT 1. Micropipetas As micropipetas devem ser calibradas para distribuir o volume correto necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações das partes que podem acidentalmente entrarem em contato com a amostra. Elas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de mostrar precisão de 1% e uma exatidão de +/- 5%. 2. Termociclador O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP é direcionado para uso em combinação para qualquer termociclador convencional. 3. HybriSpot 24 O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP foi otimizado para uso nos aparelhos HybriSpot 12 (HS12) e Hybrispot 24 (HS24) Vitro Group. ATENÇÃO: Esta Instrução de Uso é destinada para orientar o uso com o HybriSpot 24. Para utilização do protocolo com o equipamento HybriSpot 12, verificar a Instrução de Uso KIT XGEN MULTI SEPSE CHIP HS12. 12. CONTROLE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES 1. Verificar a data de validade do kit impresso na etiqueta externa da caixa. 5

2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por partículas visíveis a olho nu ou grumos. Observar se há ruptura na caixa de transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa. 3. Ligar os equipamentos (termociclador e HybriSpot) e verificar as configurações. Ter cuidado para usar o protocolo de ensaio correto. 4. Seguir estritamente o manual de equipamentos fornecidos pelo fabricante para a correta configuração dos termocicladores e HybriSpot. 5. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume necessário. 6. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso. 7. Em caso de problemas, não continuar o teste e comunicar ao supervisor. 13. PROTOCOLO PARA O EQUIPAMENTO HS24 PREPARO DA AMOSTRA O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP foi otimizado para o uso com amostras diretas de hemoculturas positivas e swabs retais. Hemocultura 1. Diluir a hemocultura no formato 1:10 ou 1:100 em água estéril ou soro fisiológico. A diluição irá depender da taxa de crescimento bacteriano no sangue de cultura. Para amostras pediátricas é recomendada a diluição da hemocultura em 1:200 a 1:500. 2. Caso a amostra de hemocultura não seja usada no momento, poderá ser congelada em uma temperatura de -20 C por até 1 semana. 3. Utilizar 4 µl desta solução para a PCR. Swab Retal 1. Cortar/quebrar a ponta do swab que contém a amostra coletada em um microtubo de 1,5 ml; 2. Adicionar 0,5 ml de água estéril ou soro fisiológico; 3. Agitar por alguns segundos em vortex; 4. Realizar diluição da suspenção em 1:10 com água estéril ou soro fisiológico para reduzir a quantidade de possíveis inibidores; 5. Utilizar 4 µl desta solução para a PCR. Nota: Caso seja identificada a presença de inibidores, recomendamos a purificação da suspenção inicial pelo método de extração. A extração de swab retal foi validada para as seguintes marcas: NucliSENS easymag (biomérieux S.A.); MagNa Pure (Roche); Chelex (Bio-rad). OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: Para utilização do kit com amostras de swab em outros kits de extração, deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. REAÇÃO MULTIPLEX PCR O preparo das Mix de PCR podem ser realizadas uma única vez ao abrir o kit ou em cada uso do produto. 6

Para preparo da Mix no primeiro uso: 1. Descongelar no gelo os reagentes para a reação: Primers 1 SPS, Primers 2 SPS, EZ SPS e UDG SPS; 2. Aliquotar os Primers 1 SPS com EZ SPS e a UDG SPS (Mix 1), de acordo com a tabela abaixo. Realizar o mesmo procedimento para a Mix 2 (Primers 2 SPS + EZ SPS + UDG SPS). Componente Preparo da Mix 1 Preparo da Mix 2 Primers 1 SPS 950 µl - Primers 2 SPS - 950 µl EZ SPS 10,8 µl 10,8 µl UDG SPS 16,2 µl 16,2 µl 3. Homogeneizar por inversão e centrifugar brevemente; 4. Fracionar as misturas em 36 µl/alíquota em 24 microtubos para PCR de 0,2 ml e congelar a -20 C. Para preparo da Mix no momento do uso 1. Caso os dois Mix sejam preparadas para uso imediato, realizar o preparo de acordo com a tabela abaixo: Componente Preparo de Mix 1 (Volume por amostra) Preparo de Mix 2 (Volume por amostra) Primers 1 SPS 35 µl - Primers 2 SPS - 35 µl EZ SPS 0,4 µl 0,4 µl UDG SPS 0,6 µl 0,6 µl Amostra 4 µl 4 µl IMPORTANTE: Todo o processo deve ser realizado em gelo ou rack termostável para evitar a degradação das Enzimas. AVISO: O protocolo descrito neste manual é indicado para utilização em conjunto com o equipamento HybriSpot 24 da VitroGroup, por isso, recomenda-se utilizar Microplacas de PCR com código de barras, Microtubos de PCR em Strip, tampa para Microtubo em Strip e filme adesivo para Strip (Ref. MAD-003900P-HS24) do próprio fabricante do equipamento. Utilização de Mix aliquotada 1. Descongelar uma alíquota do preparo da Mix 1 e outra de Mix 2 por amostra que for ser testada; 2. Adicionar 4 µl do preparo da amostra em cada microtubo 0,2 ml; 3. Prosseguir com o protocolo de PCR. 2. Distribuir 36 µl do Mix 1 e do Mix 2 em microplaca PCR ou strips/microtubos de PCR 0,2 ml por amostra testada; 3. Adicionar 4 µl de preparo da amostra em cada Mix; 4. Colocar todos os microtubos/microplaca de PCR em um termociclador para a reação de amplificação. O termociclador deve ser programado conforme abaixo: 7

1 ciclo 25 C 10 min. 1 ciclo 94 C 5 min. 40 ciclos 94 C 30 s 55 C 45 s 72 C 1 min. 1 ciclo 72 C 7 min. 8 C Nota: manter os produtos de PCR entre 8 a 10 C assim que a reação estiver finalizada. As amostras poderão ser hibridizadas imediatamente ou armazenadas em um freezer de Pós-PCR entre 8 C e 10 C por 1 ou 2 dias. Caso haja necessidade de manter o produto de PCR por intervalo de tempo maior, armazenar em temperatura de - 20 C. REAÇÃO DE HIBRIDIZAÇÃO Nota: todo processo de hibridização, captura de imagens e relatório dos resultados ocorrerá no equipamento HS24 e software HybriSpot. 1. Desnaturar o produto de PCR em termocicador a 95 C por 10 minutos; 3. Posicionar os chips no HS24. Nota: utilizar um chip por amostra e posicioná-los de maneira que a primeira fileira inicialmente seja preenchida; só após estar completa, preencher a segunda fileira e posteriormente a terceira; dessa forma, otimiza-se a utilização dos canais de vácuo. 4. Após a desnaturação no termociclador, deixar as amostras no gelo/rack termostável ou no termociclador a 4 C por, pelo menos, 2 minutos; 5. Programar o equipamento seguindo as instruções incluídas no manual do usuário fornecido com o equipamento. Controles O chip do Kit XGEN MULTI SEPSE CHIP possui diversos controles para monitorar os resultados e todas as sondas são duplicadas para garantir a confiabilidade nos resultados. O controle de hibridização (B) possui cinco repetições em ordem que permite a orientação adequada para interpretação do software. 2. Preparar o Reagente E misturando os Reagentes E1 e E2 de acordo com a tabela abaixo: Vol (µl)/1 teste Vol (µl)/4 testes Vol (µl)/8 testes Vol (µl)/12 testes Vol (µl)/16 testes Vol (µl)/20 testes Vol (µl)/24 testes E1 1.200 1.800 2.300 3.000 3.800 4.200 5.000 E2 1.200 1.800 2.300 3.000 3.800 4.200 5.000 8

Sonda Controle Sinal Positivo 5 x B 2 x CI 2 x BG Controle de Hibridização Controle de Amplificação Exógeno Controle de Amplificação Interno (β-globina) Indica que o processo de hibridização funcionou corretamente. Indica que a reação de PCR funcionou corretamente. Caso um dos sinais de CI seja negativo, pode indicar a presença de inibidores de PCR. Neste caso, verificar a qualidade do processo e das amostras utilizadas. Indica que a amplificação funcionou corretamente e a amostra clínica contém DNA humano. A B C D E F G 1 2 3 4 5 6 7 8 H 14.INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 14.1. Identificação dos Alvos no Chip 9

B CI BG Streptococcus agalactiae SAGAL 2D 7H Posição no Chip 1A 1B 2K 6F- 10A 1C- 6G 1D 6H Staphilococcus Coagulase Negativo STAPHYL 2E 7I Resultados Negativos Resultados Não Validos (Inibidores de PCR) 1A 1B 2K 6F- 10A 1A 1B 2K 6F- 10A 1C- 6G 1D 6H -- -- Staphylococcus aureus SA 2F 7J Escherichia coli * ECOLI 2G-7A Enterobacteria ENTEROB 2H 7B Candida albicans CALB 2J 7D Listeria monocytogenes LIS 3A-8F Enterococcus ENTEROC 3B-8G Resultados Negativos (Ausência de Controles do ensaio 1A 1B 2K 6F- 10A 1C- 6G --. Pseudomonas aeruginosa PAER 3C-8H Streptococcus spp. STREP 3E- 8J Neisseria meningitidis NEIS 3F-8K DNA) Proteus spp. PROT/MOR 3G-8E Falha de Hibridização -- -- -- Morganella morganii PROT/MOR 3G-8E-2H-7B Meticilina resistente - Gene meca meca 3I-8C Patógeno/Gene de Resistência Sonda Posição no Chip Streptococcus pneumoniae SPNEU 1F-6J Vancomicina resistente Gene vana Vancomicina resistente Gene vanb vana vanb 3J-8B 3K-8A Stenotrophomonas maltophilia SMALTO 1H 6D Candida spp. CAND 1I 6E Acinetobacter baumannii ABAU 2B 7F Serratia marcescens SMAR/KLEB 2C 7 G Carbapenemase Classe A KPC kpc 4A-9E Carbapenemase Classe A SME sme 4B-9G Carbapenemase Classe A NMC/IMI nmc/imi 4C-9H Β-LACTAMASE SHV blashv 4E-9J Klebsiella pneumoniae SMAR/KLEB 2C 7G -3D 8I Klebsiella pneumoniae KLEB 3D 8I Β-LACTAMASE de Amplo espectro CTX-M blactx 4F-9K Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017 10

Carbapenemase Classe A GES ges 4G-9B Carbapenemase Classe B VIM vim 4H-9C Carbapenemase Classe B GIM gim 4I-9D Carbapenemase Classe B SPM spm 5A-9E Carbapenemase Classe B NDM ndm 5B-10G Carbapenemase Classe B SIM sim 5C-10H Carbapenemase Classe B IMP3 imp 5D-10I Carbapenemase Classe D OXA23 oxa23 5G-10B Carbapenemase Classe D OXA24 oxa24 5H-10C Carbapenemase Classe D OXA48 oxa48 5I-10D Carbapenemase Classe D OXA51 oxa51 5J-10E Carbapenemase Classe D OXA58 oxa58 5K-10F Nota: O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP não é capaz de distinguir Escherichia coli de Shigella spp. Quando o paciente estiver sob suspeita clínica de sepse e o resultado for positivo para Escherichia coli, a possível infecção por Shigella spp deve ser considerada. 14.2 Análise dos Resultados 1. Quando uma amostra é positiva para S.pneumoniae, duas sondas diferentes podem ser positivas, SPNEU: específica para S.pneumoniae e STREP: genérica para o gênero Streptococcus. Porém, não se pode descartar a possibilidade de co-infecção com Streptococcus spp. de diferentes espécies. 2. Quando uma amostra é positiva para S.agalactiae, duas sondas podem ser positivas, SGAL: específica para S.agalactiae e STREP: genérica para o gênero Streptococcus. Porém, não se pode descartar a possibilidade de co-infecção com Streptococcus spp. de diferentes espécies. 3. Quando uma amostra é positiva para S.aureus, duas sondas diferentes podem ser detectadas na membrana SA: específica para S.aureus e STHAPHYL: genérica para o gênero Staphylococcus. Porém, não se pode descartar a possibilidade de co-infecção com o Staphylococcus Coagulase Negativo. 4. Quando uma amostra for positiva apenas para a sonda STAPHYL, somente meca, ou para as duas sondas a interpretação deve ser Staphylococcus Coagulase Negativo. 5. O gene de resistência Oxa51 tem sido detectado até agora no A.baumannii, E.coli e P.aeruginosa. O Acinetobacter baumannii contém o gene de resistência Oxa51 cromossomicamente, enquanto na E.coli e P.aeruginosa está presente como DNA plasmidial. Quando uma amostra é positiva para A.baumannii, duas sondas devem ser positivas no Chip, ABAU e Oxa51. No entanto, algumas mutações na região 16S do A.baumannii foram descritas, que correspondem à região onde a sonda ABAU está localizada. Portanto, se for observado apenas o sinal positivo para Oxa51, sem qualquer sinal de sondas específicas para A.baumannii, E.coli ou P.aeruginosa pode corresponder a uma mutação da região 16S da A.acinetobacter. Neste caso é recomendado identificar o patógeno por um método secundário. 6. Quando a amostra for positiva para K.pneumoniae, E.coli, S.marcescens ou Morganella morganii duas sondas diferentes serão positivadas no Chip: a) A sonda específica para cada bactéria (KLEB, ECOLI, SMAR/KLEB, PROT/MOR); b) Sonda genérica pra Enterobacteriaceae (ENTEROB); Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017 11

Uma vez que a sonda Enterobacteriaceae foi validada para detectar outras Enterobactérias como Citrobacter, Salmonella, K.oxytoca e Enterobacter, uma possível co-infecção com diferentes Enterobactérias diferentes de K.pneumoniae, E.coli, S.marcescens ou Morganella morganii não pode ser excluído. 7. A sonda PROT/MOR pode detectar Proteus mirabilis e Morganella morganii. Em uma amostra com infecção única com qualquer um destes dois patógenos, a distinção pode ser feita porque a Morganella morganii também é detectada pela sonda ENTEROB, enquanto a Proteus mirabillis não é. No entanto, não há como distinguir Morganella morganii de amostras que apresentam co-infecção com Proteus e outra Enterobactéria. 8. A sonda SMAR/KLEB pode detectar K.pneumoniae e S.marcescens. Em uma amostra com infecção única com qualquer um destes dois patógenos, a distinção pode ser realizada porque o K.pneumoniae também terá sinal positivado para a sonda específica KLEB, enquanto a S.marcescens terá sinal positivado apenas para a sonda SMAR/KLEB. No entanto, não se pode distinguir K.pneumoniae a partir de uma amostra que apresenta uma co-infecção com K.pneumoniae e S.marcescens. 9. SHV-1 é uma β-lactamase de baixo espectro encontrado com maior frequência (até 80 a 90%) em Klebsiella pneumoniae. Por esta razão, quando a amostra for positiva para K.pneumoniae, normalmente o gene SHV também será detectado. Neste caso a presença do gene não corresponde necessariamente a uma evidência fenotípica de produção de β-lactamase. 10. Devido à elevada sensibilidade do método, um sinal fraco das sondas para Enterobactéria e P.aeruginosa pode ser observada devido aos vestígios de DNA microbiano da Taq DNA Polimerase. Outros sinais fracos das sondas para Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. podem aparecer devido a contaminações durante a manipulação da amostra. Bacteremias normalmente são ocasionadas por um único patógeno. As vezes é possível detectar dois ou três microrganismos em culturas de sangue, nestes casos um destes organismos deve ser considerado como o agente causador da infecção e os outros microrganismos devem ser associados com possíveis contaminações durante a manipulação da amostra. 14. SENSIBILIDADE ANALÍTICA O limite de detecção para cada patógeno foi calculado. A sensibilidade analítica foi realizada utilizando diluições em série de DNA genômico de cada cepa para os patógenos incluídos no painel contendo 10 ng de DNA genômico humano. Cada amostra foi repetida entre 5 e 14 vezes para calcular a sensibilidade, especificidade e intervalo de confiança. Todos os produtos de PCR foram hibridizados com a plataforma hybrispot. Os resultados foram analisados com o software hybrisoft e um cut-off de 4 (intensidade cinza) foi estabelecido para a positividade. Patógeno Sonda GE/ S. epidermidis reação Positivo/ Testados Sensibilida de Intervalo de Confiança 95% meca 10 14/14 78,5%- meca 100 14/14 78,5%- STAPHYL 10 10/14 71% 45,4%- 88,3% Especif icidade Intervalo de Confiança 95% 98,1%- 99,9% 98,1%- 99,9% 98,7%- STAPHYL 100 14/14 78,5%- 98,7%- Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017 12

S. aureus SA 10 14/14 78,5%- 98,8%- E. faecalis ENTEROC 10 2/14 14% 4%-39,9% 98,6%- SA 100 6/6 61%- 98,8%- ENTEROC 100 14/14 78,5%- 98,6%- STAPHYL 10 2/14 14% 4%-39,9% 98,7%- E. faecium ENTEROC 50 4/6 67% 30%- 90,4% 98,6%- STAPHYL 100 6/6 61%- 98,7%- ENTEROC 100 14/14 78,5%- 98,6%- S. pneumoniae SPNE 10 14/14 78,5%- 98,8%- P. aeruginosa PAER 10 14/14 78,5%- 97%** 94,3%- 98,3% SPNE 100 6/6 61%- 98,8%- PAER 100 6/6 61%- 97%** 94,3%- 98,3% STREP 10 13/14 93% 68,5%- 98,7% 96%* 93,1%- 97,7% A. baumannii ABAU 10 14/14 78,5%- 98,9%- STREP 100 6/6 61%- 96%* 93,1%- 97,7% ABAU 100 6/6 61%- 98,9%- S. agalactiae SAGAL 50 14/14 78,5%- 98,8%- N. meningitidis NEIS 100 8/10 80% 49%- 94,3% 98,8%- SAGAL 100 6/6 61%- 98,8%- NEIS 500 10/10 74,2%- 98,8%- L. monocytoge nes LIS 10 14/14 78,5%- 98,6%- S. maltophilia SMALTO 10 14/14 78,5%- 98,8%- LIS 100 6/6 61%- 98,6%- SMALTO 100 5/5 56,5%- 98,8%- Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017 13

E. coli ECOLI 10 14/14 78,5%- 98,6%- CAND 10 14/14 78,5%- 98,9%- ECOLI 100 6/6 61%- 98,6%- CAND 100 6/6 61%- 98,9%- K. pneumoniae S. marcescens KLEB 10 12/14 86% 60,1%- 96% KLEB 100 6/6 61%- SMAR/KL EB SMAR/KL EB 10 8/8 67,6%- 100 14/14 78,5%- E. cloacae ENTEROB 10 14/14 78,5%- 98,6%- 98,6%- 98,8%- 98,8%- 97%** 94,3%- 98,5% * Os 96% de especificidade da sonda STREP podem ser devidos a contaminação por vestígios de DNA de Streptococcus spp. durante a manipulação de amostras de sangue ou reagentes e plásticos. ** Os 97% de especificidade para as sondas PAER e ENTEROB decorrem da presença de DNA microbiano contaminante em preparações comerciais de DNA-polimeresas termostáticas. Em geral, pensa-se que algum passo (s) na purificação, ou reagente adicionado à enzima, são as fontes dessa contaminação bacteriana. Os alinhamentos de sequências de DNA de três polimerases Taq mostram DNA bacteriano contaminante: espécies de Pseudomonas, Serratia marcescens e outras "fitobactérias", Escherichia coli, Salmonella e Shigella. P. mirabilis PROT/M OR ENTEROB 100 6/6 61%- PROT/M OR 10 17/17 81,6%- 100 6/6 61%- C. albicans CALB 10 14/14 78,5%- 97%** 94,3%- 98,5% 98,8%- 98,8%- 98,9%- CALB 100 6/6 61%- 98,9%- 15. SOLUÇÕES DE PROBLEMAS PROBLEMA CAUSA SOLUÇÃO Ausência de Sinal no Controle de Hibridização 1-Falha no protocolo de hibridização; 2-Reagentes fora do prazo de validade ou que não foram devidamente armazenados; 3- Sondas no Chip, destruídas por restos 1-Verificar se todos os reagentes foram adicionados corretamente durante o processo de hibridização. Verificar a performance do equipamento HybriSpot 24 e repetir o Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017 14

Detecção de Sinal em Controles Negativos Ausência de Sinal do Controle Interno Ausência de sinal do Controle Endógeno de reagentes contaminantes nos poços. Contaminação na fase de pré-pcr ou pós-pcr. 1-Problemas na amplificação de PCR; 2-Presença de inibidores de PCR na amostra. 1-Quantidade insuficiente de DNA na ensaio. 2-Verificar a data de validade e condições de armazenamento dos reagentes e do Chip, e repetir o ensaio. 3-Caso a descontaminação da área de trabalho tenha sido realizada com água sanitária, o DNA pode ter sido degradado. Limpar a bancada com água destilada e repetir o ensaio. Limpar as áreas de trabalho e repetir o ensaio. 1-Verificar se o termociclador está programado corretamente. Verificar se a reação de PCR foi preparada corretamente e repetir o ensaio; 1-Repetir o ensaio utilizado uma Presença de precipitados cromogênicos no Chip após o protocolo de hibridização Sinal fraco de Hibridização amostra clínica; 2-Presença de inibidores de PCR na amostra. 1- O Reagente E (E1 + E2) não ter sido preparado próximo de sua utilização; 2-O frasco do reagente E pode conter resíduos de protocolos anteriores. 1-Reagentes de PCR e/ou Hibridização fora do prazo de validade ou que não foram devidamente armazenados. Repetir o ensaio; 2-O produto de PCR não foi devidamente desnaturado antes da hibridização; 3-Baixa concentração ou qualidade do DNA quantidade maior de amostra ou diminuindo a diluição inicial. No entanto, não utilizar diluições menores que 1:10 para culturas de sangue. 1-Preparar o Reagente E pouco antes de seu uso e repetir o ensaio. 2-Limpar o frasco do Reagente E após cada uso com água destilada para evitar o acúmulo de reagente. Repetir o ensaio. 1- Verificar se todos os reagentes foram adicionados corretamente durante o processo de hibridização e repetir o ensaio; 2-Verificar o processo de hibridização e a performance do equipamento HybriSoft 12. Repetir o ensaio; 3-Aumentar a Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017 15

16. GARANTIA DA QUALIDADE da amostra. quantidade de amostra ou DNA para a PCR. A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos termos abaixo. GARANTIA O produto Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP é garantido pela Mobius contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta. A garantia abrange defeitos de produção. EXCEÇÕES NA GARANTIA Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem inadequada. EXTINÇÃO DA GARANTIA Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação. 19. RESPONSÁVEL TÉCNICA Flávia Rosenstein Schiel CRBio-07 34.360/07-D 17. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Mobius Life Science Comércio de Produto para Laboratórios Ltda. Rua Paraíso do Norte, 866 Pinhais PR - CEP: 83.324-221 Telefone: (41) 2108-5296 E-MAIL: info@mobiuslife.com.br WEBSITE: www.mobiuslife.com.br CNPJ: 04.645.160/0001-49 18. REGISTRO ANVISA 80502070052 Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017 16