APLICAÇÃO DA TÉCNICA LC-MS/MS PARA EXAME DAS DROGAS NO CORPO E SEU METABÓLITO

APLICAÇÃO DA TÉCNICA LC-MS/MS PARA EXAME DAS DROGAS NO CORPO E SEU METABÓLITO Departamento de Ciências Forenses da PJ Leong Ka Man (Técnica Superior) Lei Cheok Hin (Técnico) Kuok Chan Mou (Técnico) Resumo: Pode-se, através da análise de amostras de sangue e da urina, identificar a presença de droga, sendo também possível determinar se o sujeito em exame consumiu droga, de que tipo, a quantidade, se há relação entre a morte e o consumo de droga, se a capacidade de actuar ficou afectada pelo consumo de droga bem como se existe responsabilidade efectiva. Estes factores podem fornecer um fundamento científico para a resolução e investigação de casos relacionados com estupefacientes. Neste sentido, o nosso departamento criou um método de análise para detectar a presença das drogas mais usadas em Macau e seu metabólito no sangue e na urina através da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em tandem (LC-MS/ MS). Verificou-se que este método tem como vantagens uma maior exactidão e sensibilidade (a medição pode atingir os 0.1ng/mL) e o tempo necessário para a análise é bastante reduzido, podem ser analisadas várias amostras ao mesmo tempo, o pré-procedimento é simples e também pode ser aplicado no teste qualitativo em casos concretos. Desde sempre, usam-se medições qualitativa e quantitativa das drogas para proceder à análise das drogas apreendidas, ou seja, para uma peritagem exacta quanto ao tipo de droga e ao exame quantitativo da sua pureza. Nos últimos anos, face à evolução da ciência e tecnologia, a análise da droga efectua-se cada vez mais no próprio corpo e relativamente ao seu metabólito. I. ANÁLISE DA DROGA E SEU METABÓLITO NO CORPO A análise da droga e seu metabólito realiza-se mediante a recolha de amostras corporais, a qual consiste em extrair fluidos corpóreos de um ser humano vivo ou de um cadáver, esses fluidos podem ser sangue, urina, suor; ou extraídos de tecidos e cabelos entre outras substâncias. Entre estes, o sangue tem um valor importantíssimo para relacionar a morte e o consumo de droga e se esta influenciou a capacidade de actuar, pode-se de facto obter informações acerca da intensidade da droga, a influência sobre a capacidade de actuar e o grau de intoxicação. O tempo limite para efectuar a análise da urina é mais longo, pode ir de 6 horas a 6 dias, aproximadamente, (o do sangue é somente de 3 horas a 1 dia), dado que a concentração da droga e seu metabólito na urina são relativamente elevados, mesmo depois de alguns dias após o consumo, é relativamente fácil detectar a sua presença, o que proporciona um fundamento científico para determinar se houve consumo de droga nos dias que antecederam o exame. 122

Os principais métodos de análise de amostras actualmente utilizados quer na China continental quer nos outros países para a recolha de amostras são a análise imunológica, por cromatografia gasosa (GC), por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC- MS), por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em tandem (LC-MS/ MS), entre estes, o método GC-MS tem como vantagens uma maior exactidão, sensibilidade e uma enorme base de dados, razão pela qual se tornou o método mais comum na análise de droga no corpo. O método LC-MS/MS é um método inovador que tem desenvolvido rapidamente nos últimos anos. Comparando com GC-MS, este caracteriza-se por um procedimento simples e conveniente, não sendo necessário passar pela derivatização, como o Multiple Reaction Monitoring (MRM) da LC-MS/MS apresenta poucas alterações sobre a matriz, o que fornece mais escolhas e um reduzido tempo de detecção (a medição pode chegar até o ng/ml). Para além disso, pode-se efectuar, com este método, a análise de substâncias termicamente instáveis, substâncias não voláteis e ainda substâncias com uma polaridade relativamente alta, por isto se tornou, nos últimos anos, uma técnica importantíssima para a análise da droga no corpo e para a análise farmacológica. II. CARACTERÍSTICAS DA ANÁLISE LC-MS/MS E O PROCESSO DE EXAME Para prevenir e combater eficazmente o crime e facilitar o trabalho de investigação criminal, o nosso departamento utiliza o método MRM de LC-MS/MS e IDA, MRM-EPI (Information Dependent Acquisition (IDA), Multiple Reaction Monitoring (MRM) Enhanced Product Ion (EPI) para um exame qualitativo da presença de drogas como opiáceos, cocaína, anfetamina e quetamina entre aquelas consideradas mais utilizadas em Macau e o seu metabólito no sangue e na urina. Este método tem como vantagens uma maior exactidão e sensibilidade (a medição pode atingir os 0.1ng/ml) e o tempo necessário para a análise é bastante reduzido, podem ser analisadas várias amostras ao mesmo tempo, o pré-procedimento é simples e também pode ser aplicado no teste qualitativo em casos concretos. Segue-se o procedimento geral. (I) PRINCIPAIS EQUIPAMENTOS E REAGENTES 1. Equipamentos LC-MS/MS: AB Sciex QTrap 5500 e Agilent 1200 Series 2. Reagentes (1) Objecto padrão adquirido nas empresas: Lipomed, Cerilliant e Alltech; (2) O acetato de etilo, ácido fórmico e formato de amónio são considerados como reagentes analíticos; enquanto que o acetonitrilo como reagente para cromatografia (chromatographic pure); (3) Solução tampão: carbonato de sódio ph9.0 solução tampão de bicarbonato de sódio. (II) PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DO OBJECTO PADRÃO Extração dos diversos objectos padrão para proceder a uma combinação de soluçãopadrão de reserva de ug/ml e conservação em frigorífico a uma temperatura de 4ºC, ao utilizá-la pode ser diluída até à concentração preferida. (III) MÉTODOS DE PRÉ- TRATAMENTO DAS AMOSTRAS RECOLHIDAS 1. Método de diluição: retirar 20ul de 123

urina, introduzir 980ul de acetonitrilo, efectuar Tabela 1. Parâmetro do processo da eluição por gradiente da fase móvel uma centrifugação da mistura durante minutos e depois retirar 200ul de acetonitrilo e por último passar por uma filtragem numa membrana microporosa de 0,45um, fica assim concluído o processo. Tempo (min) 0 15 15,5 17,5 Fase móvel A (%) Fase móvel B (%) 2. Método de extracção líquido-líquido: retirar 1ml de sangue, adicionar 1ml ph9.0 de solução tampão e 5ml de acetato de etilo, efectuar uma centrifugação da mistura durante 20 minutos, extrair 4ml da camada orgânica, deixar vaporizar com nitrogénio no aquecedor a uma temperatura de 50 ºC, adicionar, na fase móvel B, 400ul de resíduo para derreter e por último passar para a filtragem numa membrana microporosa de 0,45um, fica assim concluído o processo. (IV) CONDIÇÃO PARA A ANÁLISE LC-MS/MS: 2. Condições para a espectrometria de massa (1) Fonte de iões: aplicação de ionização positiva por electrospray (ESI+); (2) Modo de detecção: modo MRM e modo IDA (MRM-EPI); (3) Parâmetro de operação: colisão em gás, Elevada; cortina de gás, 20psi; voltagem do ionspray, 4000; temperatura, 500 ºC; tempo de residência: 50msec; (4) Parâmetro de análise do ião precursor / ião produto (ver tabela 2). (V) ÍNDICE QUALITATIVO 1. Condição líquida (1) Coluna de cromatografia líquida: Allure PFP Propyl 50mm x 2,1mm x 5um; (2) Coluna de protecção: Allure PFPP mm x 2,1mm; (3) Temperatura da coluna: 20 ºC; (4) Tamanho da amostra: 20ul; (5) Velocidade do fluxo: 0,8ml/min; (6) Fase móvel A: formato de amónio 2mM e 0,2% da solução aquosa de ácido fórmico; Fase móvel B: formato de amónio 2mM e 0,2% de solução do ácido fórmico em acetonitrilo; (7) Forma de eluição: eluição por gradiente (ver tabela 1). 1. MRM (1) Comparando o tempo de retenção no cromatógrafo com a amostra de controle positivo, verifica-se que o erro relativo é inferior a 2,5%; (2) Comparando a razão da abundância relativa do par iónico e a amostra do controle positivo, cujos erros relativos correspondem aos da tabela 3, não se encontram picos de interferência na amostra padrão do par iónico; (3) Obtenção de informações através do scan da análise do par iónico que corresponde aos dois resultados acima referidos. 2. IDA, MRM- EPI A intensidade do par iónico escolhido é superior ao valor limite do ião precursor / ião 124

Tabela 2. Parâmetros MRM das vinte drogas mais utilizadas em Macau e o seu metabólito Denominação Ião precursor / Ião produto DP (V) CE (V) Denominação Ião precursor / Ião produto DP (V) CE (V) Heroína 370.2/268.2 370.2/165.1 43 60 MDA 180.1/163.1 180.1/135.1 95 66 14 26 6-Acetilmorfinae 328.1/211.3 328.1/165.3 96 33 57 MDE 208.2/163.1 208.2/133.1 83 82 18 26 Morfina 286.1/201.2 286.1/165.3 81 34 49 Efedrina 166.1/148.1 166.1/133.1 70 68 15 27 Codeína 300.2/199.2 300.2/165.3 95 40 60 Norefedrina 152.1/134.1 152.1/117.0 30 30 14 22 6-Acetilcodeína 342.2/2.0 342.2/165.0 151 37 58 Anfetamina-d6 142.0/1.0 142.0/92.9 118 13 Hidrocodona 300.1/199.0 300.1/243.1 60 32 39 Metanfetamina-d9 159.0/1.0 159.0/93.0 140 50 17 Metadona 3.2/265.2 3.2/5.1 65 70 17 35 Quetamina 238.1/179.1 238.1/1.1 73 78 20 21 Etilmorfina 314.1/165.0 314.1/296.2 80 62 28 Norquetamina 224.1/207.1 224.1/1.1 78 19 32 6-Acetilmorfina-d3 331.1/165.0 331.1/211.0 50 55 37 Quetamina-d4 242.2/129.0 242.2/183.1 30 40 Morfina-d3 289.1/165.0 289.1/201.1 61 56 35 Cocaína 304.2/182.3 304.2/5.0 82 75 26 39 Metanfetamina Anfetamina 150.1/119.0 150.1/91.0 136.1/119.0 136.1/91.0 61 56 15 13 23 Benzoilecgonina Ecgoninametil-éster 2.2/168.3 2.2/5.0 200.1/182.1 200.1/82.1 76 76 41 23 33 MDMA 194.2/163.4 194.2/135.3 66 17 29 Cocaína-d3 307.1/185.0 307.1/153.1 35 27 34 III. UTILIZAÇÃO DO MÉTODO LC-MS/MS PARA ANÁLISE DA DROGA EM CASOS CONCRETOS produto e através dos três tipos de energia de colisão (CE = 20V, 35V, 50V) alternou-se o scan (EPI) do ião produto, para a confirmação da existência do composto químico na Este departamento, efectua, de acordo espectrometria de massa e na espectrometria com as características dos vários casos, a de massa secundária. análise da droga, utilizando o método LC-MS/ MS, por exemplo, Tabela 3. Erro relativo máximo admissível da abundância relativa u m s u s p e i t o cometeu o crime Abundância relativa >50% >20~50% >~20% % (pico base em %) de consumo ilícito de estupefacientes Erro relativo ±20 ±% ±30% ±50% e de substâncias admissível (em %) psicotrópicas em 1

Macau, contudo, este não confessou ter consumido estupafacientes, alegando-se que a droga apreendida na sua posse foi o que sobrou no período em que consumia, um mês antes, fora de Macau, portanto, o serviço em causa incumbiu o nosso departamento de analisar uma amostra da urina e de sangue para detectar a presença eventual de droga. Tendo em conta a existência de um intervalo de 4 dias, desde o suposto consumo da droga até à recolha das amostras de sangue e da urina, a maioria da droga em análise já tinha sido metabolizada, geralmente o tempo limite para a análise de sangue é entre 3 horas e 1 dia, enquanto o tempo limite para a análise da urina é entre 6 horas e 6 dias, assim, o nosso departamento procedeu à análise através do método LC-MS/MS e do GC/MS, respectivamente, para verificar a presença da droga e seu metabólito nas amostras em causa, tendo obtido os seguintes resultados: 1. No método de LC-MS/MS, verificou-se a presença de quetamina e seu metabólito norquetamina em ambas as amostras de sangue e de urina (ver gráficos 1 a 8); 2. No método GC/MS verificou-se a presença de quetamina e seu metabólito norquetamina na amostra da urina, enquanto que utilizando o mesmo método, não foram detectadas, na amostra de sangue, aquelas substâncias (ver gráficos 9 e ). Com base nas análises efectuadas por este departamento, concluiu-se o seguinte: (1) Foram detectadas nas amostras de sangue e da urina recebidas, quetamina e seu metabólito norquetamina. (2) Devido ao facto que a concentração da quetamina e norquetamina no sangue é mais baixa do que na urina, quando se usou o método GC-MS, o qual tem parâmetros de sensibilidade relativamente baixos, não foi possível detectar a presença de quetamina e norquetamina no sangue (gráfico ), enquanto que com o outro sistema, ou seja, o método LC-MS/MS, como este possui parâmetros de sensibilidade elevados, conseguiu-se detectar a presença de ambas as substâncias (gráficos 5 e 6). IV. AS VANTAGENS DA ANÁLISE DA DROGA EFECTUADA COM O MÉTODO LC-MS/MS (1) Aplicação do exame qualitativo em vários tipos de droga Gráfico 1. Cromatograma MRM com presença de quetamina na urina Gráfico 2. Cromatograma MRM com presença da norquetamina na urina 126

Gráfico 3. Espectrometria de massa secundária com presença da norquetamina na urina (gráfico esquerdo: CE=20V e gráfico direito: CE=35V) Gráfico 4. Espectrometria de massa secundária com presença de quetamina na urina (gráfico esquerdo: CE=20V e gráfico direito: CE=35V) Gráfico 5. Cromatograma MRM com presença da quetamina no sangue Gráfico 6. Cromatograma MRM com presença da norquetamina no sangue 127

Gráfico 7. Espectrograma de massa secundária com presença de norquetamina no sangue (gráfico esquerdo: CE=20V e gráfico direito: CE=35V) Gráfico 8. Espectrograma de massa secundária com presença de quetamina no sangue (gráfico esquerdo: CE=20V e gráfico direito: CE=35V) Gráfico 9. Cromatograma iónico total GC-MS nas amostras de urina Gráfico. Cromatograma iónico total GC-MS nas amostras de sangue 128

O método de análise usado no presente texto é o qualitativo, o qual é feito através da técnica LC-MS/MS para analisar a presença dos 20 tipos de droga mais frequentemente utilizados em Macau e o seu metabólito contidos no sangue e na urina. Usouse o método de diluição como método de pré-tratamento para uma análise limite de 50~200ng/mL, este método é aquele que possui as características que permitem operar facilmente e rapidamente, é aplicável na confirmação da análise qualitativa em amostras que contêm uma quantidade de droga relativamente elevada, como o caso da urina. Quanto à extracção líquido-líquido, esta é baseada na cromatografia líquida com detecção de espectrometria de massa LC-MS/ MS para uma análise limite de 2~ng/mL e é aplicável na amostra de análise que contém uma quantia relativamente baixa de droga e uma matriz complexa. (2) Possui maior sensibilidade no exame da droga Dado que a droga já passou por uma série de processos metabólicos, nomeadamente, absorção, distribuição e excreção, depois de passados alguns dias desde o consumo, verifica-se que a sua concentração no sangue e seu metabólito é muito mais baixa do que na urina, assim, pode-se usar o método LS-MS/MS que tem parâmetros de sensibilidade mais altos para amostras que possuem uma concentração relativamente baixa. (3) Prolonga o tempo limite para a análise das amostras de sangue O tempo limite para a análise das amostras de sangue e de urina depende da natureza da substância, dosagem, se usada frequentemente, metabolismo de cada pessoa, velocidade de excreção e o parâmetro de sensibilidade da análise. Geralmente, o tempo limite para a análise das amostras de sangue, é de 3 horas a 1 dia, para a análise das amostras de urina, é de 6 horas a 6 dias. No presente caso, foi utilizado o método LC-MS/MS, o qual tem um alto parâmetro de sensibilidade para a análise das amostras de sangue, este método pode ainda analisar quetamina e o seu metabólito norquetamina contidos no sangue 4 dias após o consumo. Enquanto se usarmos o método GC-MS para a análise, que tem parâmetros de sensibilidade relativamente mais baixos, não é possível detectar a presença de estupefacientes no sangue. (4) Proporciona um fundamento fiável para o exame da droga A espectrometria de massa secundária obtida através do método IDA, MRM-EPI e o resultado obtido na pesquisa e verificação de composto químico na base de dados, proporcionam um fundamento fiável para determinar a estrutura do composto químico. Bibliografia: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Zhang Chunshui, Gao Lisheng, (periódico) Situação Actual e Desenvolvimento da Análise da Droga no Âmbito das Ciências Forenses no Estrangeiro, Ciências Forenses, 2009, B12, 68-74. Xiang Ping, Shen Min, Aplicação da Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massa na análise farmacológica e na análise toxicológica (M), Editora Ciência e Tecnologia Shanghai. Liu Linchuan, Zhang Daming, Análise Toxicológica na Medicina Legal (M), Editora Ensino Superior. Frederick P. Smith, Handbook of Forensic Drug Analysis (M). ELSEVIER. Luo Guoan, Análise Técnica de Estupefacientes e Substâncias Tóxicas (M), Editora Indústria Química; Liang Luning, Zhou Songdong, Técnica de Peritagem Forense Contemporânea (M), Editora Compilação e Tradução Central. 129