Capacitação para Médicos no Tratamento da Hepatite Viral C com os Inibidores Protease Boceprevir e Telaprevir no Estado São Paulo Re Biologia Molecular para Hepatite C crônica no Estado São Paulo Dra Regina Célia Moreira Pesquisadora Cientifica VI Centro Virologia Núcleo Doenças Sanguineas e Sexuais Laboratório Hepatites Virais regina.moreira7@gmail.com
O vírus da hepatite C Envelope Core Glicoproteínas do Envelope 55 65 nm RNA Viral (9400 nt)
Genoma HCV Alvos das Novas Drogas
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Métodos indiretos Pesquisa anticorpos (anti HCV) Métodos diretos Pesquisa do RNA viral PCR em tempo real Genotipagem finição da droga e do tempo tratamento
TESTES DE BIOLOGIA MOLECULAR HEPATITE C Métodos diretos Pesquisa do RNA viral PCR em tempo real diagnóstico viremia monitoramento resposta ao tratamento avaliação resposta sustentada diagnóstico precoce infecção transmissão materno fetal diagnóstico infecção em imunossuprimidos pré tratamento fator preditivo tratamento
DIAGNÓSTICO SITUAÇÃO HIPOTÉTICA NÃO DOENTES DOENTES
DIAGNÓSTICO SITUAÇÃO REAL
VALIDADE Capacida um teste indicar quais indivíduos possuem uma terminada condição (doença) e quais não possuem Sensibilida Especificida * Valor Preditivo padrão-ouro
SENSIBILIDADE Sensibilida d Analítica É o limite tecção do teste, ou seja, é a menor quantida da substancia analisada que o teste empregado po tectar. Sensibilida Diagnóstica Capacida do teste intificar corretamente quem possui a doença.
ESPECIFICIDADE Especificida Analítica É a capacida um teste em distinguir dois antígenos relacionados Especificida Diagnóstica Capacida do teste intificar corretamente quem não possui a doença
VALOR PREDITIVO Capacida um teste intificar realmente pessoas com ou sem a doença Valor preditivo positivo (VPP) se o teste é positivo, qual a probabilida da doença estar presente Valor preditivo negativo (VPN) se o teste é negativo, qual a probabilida da doença estar ausente
COMPARAÇÃO DOS MÉTODOS MOLECULARES DE DIAGNÓSTICO DAS HEPATITES VIRAIS b-dna 2.0 b-dna 3.0 PCR semi-automatizado PCR automatizado PCR Tempo real
Instruções para coleta e transporte amostras para COLETA Biologia molecular hepatite c (HCV) c Colher 9 ml sangue por punção venosa em tubo com gel (ou dois 5mL ou 7mL) seco com gel separador TAMPA AMARELA ou dois tubos 5mL com anticoagulante (EDTA) TAMPA ROXA SORO Homogeneizar por inversão Deixar em repouso à temperatura ambiente por 30min. Centrifugar a2500 3000 rpm/15min. A amostra verá chegar ao laboratório executor em, no máximo, 4 horas após a coleta, mantendorefrigerado refrigerado. NÃO CONGELAR
PREENCHIMENTO DAS FICHAS (OBRIGATÓRIO) Secretaria Estado da Saú Coornadoria Controle Doenças Centro Vigilância Epimiológica "Prof. Alexandre Vranjac" Divisão Hepatites Virais SOLICITAÇÃO DE CARGA VIRAL DA HEPATITE C TODOS os dados do paciente CNS, data nascimento Não abreviar nome do paciente PARA PACIENTES EM TRATAMENTO COM INIBIDOR DE PROTEASE (IP) Nome da unida: Telefone: ( ) E mail: 2. - Dados do Paciente: Nome: Sexo: Feminino ( ) Masculino ( ) Data Nascimento: / / CNS: CPF: Nome da Mãe: Enreço Completo: Município: UF: CEP: Nome, CRM e assinatura do médico solicitante. 3- Fase do tratamento: TELAPREVIR ( ) BOCEPREVIR ( ) Semana Semana Semana Semana Semana Semana 6 meses após Início 4 8 12 16 24 48 término ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 4. Exame solicitado: it PCR QUANTITATIVO HCV CARGA VIRAL DA HEPATITE C 5. Local coleta da amostra: Nome da unida: Data da coleta da amostra: / / Hora: Responsável: 6. Assinatura e Carimbo do Médico Solicitante
TESTES DE BIOLOGIA MOLECULAR - HEPATITE C (HCV) 1. PCR Qualitativo para o HCV Não é mais indicado para o diagnóstico e acompanhamento( sensibilida) 2. PCR em tempo real Quantitativo para o HCV 3. Genotipagem para o HCV
PCR- Reação da Polimerase em Caia 1 ciclo = 1(RNA/cDNA hibrido) 2 ciclos = 2 Amplificações 3 ciclos = 4 Amplificações 4 ciclos = 8 Amplificações 5 ciclos = 16 Amplificações 6 ciclos = 32 Amplificações 7 ciclos = 64 Amplificações
PCR EM TEMPO REAL Real-time PCR monitora a fluorescência emitida durante a reação como um indicador da produção amplificado em cada ciclo PCR
REAL TIME PCR
Vantagens do Real-time PCR * Não influenciado por amplificação não específica * A amplificação po ser monitorada em tempo real * Não ocorre processamento pós-pcr (baixo risco contaminação) * Ciclagem ultra-rápida (30 minutos a 2 horas) * Mais específico, sensível e reprodutivo
HEPATITE C BIOLOGIA MOLECULAR Kits disponíveisee registrados na ANVISA para o diagnóstico e genotipagem COBAS AmpliPrep /COBAS TaqMan HCV Quantitative Test, v2.0* ABBOTT REAL TIME HCV LINEARIDADE 12UI/mL a 100.000.000UI/mL (0,5mL amostra) ABBOTT REAL TIME HCV Genotype II Sensibilida 500UI/mL Compra e Distribuição centralizada no Ministério da Saú PNDST/AIDS e Hepatites Virais
GENOTIPAGEM HCV
HEPATITE C TESTES DE GENOTIPAGEM INNOLIPA 1 1a 2b 3a 2
SEQUENCIAMENTO
PCR em Tempo Real kit ABBOTT HCV real time genotype II (automatizado) ado) Adição sondas oligonucleotíos específicos marcados Tempo po reação: 5 horas Rendimento : Gentipagem 22 amostras Detecta os genótipos 1a e 1b Genótipos 2,3,4,5,e 6
QUANTIFICAÇÃO HCV
Precisião Diagnóstica do teste Roche COBAS HCV RNA Roche COBAS HCV RNA LoD LoQ LINEARIDADE (IU/mL) (IU/mL) (IU/mL) COBAS AMPLICOR HCV Qualitative i Test, 50 NA NA Manual v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Qualitative ti Test, v2.0* COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 for use with High Pure System (Quantitative) 15 NA NA Automated ~10** 25 25 391,000,000 Manual COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Quantitative Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Quantitative Test, v2.0* 15 43 43 69,000,000 Automated 15 15 15 100,000,000 Automated *The COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Qualitative and Quantitative Tests, v2.0 are not available in the USA **LoD is 9.3 IU/mL for EDTA plasma and 8.8 IU/mL for serum
Abbott RealTime HCV Sensibilida Linearida 12 IU/ml (0.5 ml), 30 IU/ml (0.2 ml) até100 milhões IU/ml Especificida >99% Detecção subtipos Amostra Volume Genótipos 1a, 1b, 2, 3, 4, 5, 6 Plasma colhido com ACD ou EDTA, soro 0.5 ml, 0.2 ml Precisão SD: <0.3 log IU/ml Preparo da amostra Automatizado (m2000sp), semi-automatizado (m24sp), manual Tempo ~ 6h horas / 93 amostras (m2000sp); 21 amostras (manual) Formato do resultado Alvo IU/ml, log IU/ml 5 -UTR
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Resultados Alvo Não Detectado Detectado <1.20E+01 IU/mL Interpretação O Resultado é liberado como HCV RNA não tectado Resultado é <LoQ; resultado é liberado como HCV RNA não quantificado, <12 HCV RNA IU/mL 1.20E+01 IU/mL e 1.00E+08 08 IU/mL Resultado é liberado como XX IU/mL HCV RNA tectado >1.00E+08 IU/mL Resultado é liberado como Detectado >1.00E+08 HCV RNA IU/mL
REDE DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR DO ESTADO DE SÃO PAULO Hepatite C Laboratório Referência : Instituto Adolfo Lutz Coornadora : Dra Regina Célia Moreira
Presinte Prunte São José do Rio Preto Araçatuba Marília Assis Bauru Barretos Araraquara Botucatu Franca Rib Preto Piracicaba São João da Boa Vista Campinas REDE DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA HEPATITE C Taubaté Franco da Rocha Osasco Capital Guarulhos ABCD Mogi das Cruzes Sorocaba Registro Metropolitana São Paulo Santos São José dos Campos Metropolitana São Paulo UNESP Araraquara IAL Presinte Prunte IAL Sorocaba IAL São José Rio Preto UNESP Botucatu UNICAMP- Hemocentro HC-USP Ribeirão Preto Hosp Guilherme Álvaro IAL Central Lab Central HC-FMUSP Inst Infectologia Emilio Ribas Lab Suste PMSP
São José do Franca Rio Preto Barretos Araçatuba Rib Preto São João Araraquara da Presinte Prunte Boa Vista Marília Bauru Piracicaba Franco da Rocha Guarulhos Capital Mogi das Cruzes Osasco ABCD Assis Botucatu Campinas Taubaté g Metropolitana São Paulo l Sorocaba São José dos Campos Santos Registro ESTIMATIVA DE PACIENTES ELEGÍVEIS PARA TRATAMENTO COM INIBIDOR DE PROTEASE POR LABORATÓRIO (n) m2000sp m2000sp Lab Central HC-FMUSP (195) Metropolitana São Paulo MANUAL m2000sp / m24sp m24sp IAL São José Rio Preto (65) UNESP Botucatu (25) UNESP Araraquara IAL Central (110) UNICAMP- Hemocentro (110) IAL Presinte Prunte (25) Lab Suste PMSP (75) HC-USP Ribeirão Preto (80) IAL Sorocaba (50) Inst Infectologia Emilio Ribas (80) Hosp Guilherme Álvaro (70)
Laboratório Hepatites CV / NDSS Equipe Adriana Parise Compri PqCI Angela Ferrari Auxiliar Laboratório Angela Maria Spina PqC IV Clóvis Roberto Abe Constantino Auxiliar laboratório Isabel Oba PqC IV Marcilio Figueiredo Lemos PqCIII Maria Divina da Silva Auxiliar laboratório Regina Célia Moreira PqCVI Bolsista FUNDAP / FAPESP Karoline Rodrigues Campos Alunas Mestrado Ana Paula T Santos Samira Julien Calux Vanessa Martins Silva
O B R I G A D A! regina.moreira7@gmail.com