X JORNADA FARMACÊUTICA E V AMOSTRA DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIAS EM PCR EM TEMPO REAL: OTIMIZANDO CUSTOS E PRODUTIVIDADE Sueli Massumi Nakatani Laboratório Central do Estado LACEN-PR Maio de 2010
Laboratório Central do Estado -PR Seção de Biologia Molecular -1997 Programa do MS DST/AIDS Quantificação da carga viral do HIV Hoje
Laboratório Central do Estado -PR Seção de Biologia Molecular -1997 Programa do MS DST/AIDS Quantificação da carga viral do HIV Hoje 20 Diagnósticos Moleculares
Laboratório Central do Estado -PR
Por que PCR em tempo real?
PCR EM TEMPO REAL Benefícios Aumento da sensibilidade / Especificidade Automatização Detecção na fase exponencial Protocolo único Tempo de execução menor Sem processamento pós-pcr
EVOLUÇÃO DA PCR Evolução da PCR
EVOLUÇÃO DA PCR Inicialmente, a PCR é exponencial O produto (P) aumenta exponencialmente com o número de ciclos (n) A quantidade de produto de PCR depende do número de cópias de molde (M) presentes no início da reação Se no início houver duas vezes mais molde, se deve obter duas vezes mais produto Onde: P = Produto M = Molde E = Eficiência n = ciclos P = M (1+E) n
Amplificação por PCR Para duas vezes mais molde no início, existe duas vezes mais produto de PCR, na fase exponencial. Para 4X Molde, existe 4X mais produto de PCR, etc.
Amplificação por PCR Eficiência Mas...a reação de PCR NÃO é 100% eficiente Normalmente a eficiência é de 80-90% Produtos de PCR menores amplificam com uma eficiência maior P = M (1+E) n Onde: P = Produto M = Molde E = Eficiência n = ciclos
AMPLIFICAÇÃO POR PCR Fase de Plato Os produtos de PCR não podem dobrar para sempre Limites Quantidade de primer Atividade da Taq Polimerase Uma vez atingido o plato... Não há mais aumento na quantidade de produto Detecção end point Número fixo de ciclos e depois se verifica a presença de produto em gel de agarose
Problemas na detecção no ponto final Precisão baixa Baixa sensibilidade Range < 2 logs Baixa resolução Não automatizado Baseado somente no tamanho Resultados não expressam em números O corante brometo de etídeo não é quantitativo Manipulação com produtos Pós-PCR
Fases da PCR Área de de detecção no PCR tradicional Área de detecção real time PCR
Amplificação por PCR Detecção end point Plateau effect
Como quantificar a quantidade inicial de molde??? Use os dados da fase exponencial Quantidade de produto é proporcional a quantidade de molde inicial Neste caso, é necessário avaliar o produto de PCR a cada ciclo Usar Fluorescência A fluorescência deve ser proporcional quantidade de produto Use uma máquina que verifique a fluorescência em cada ciclo (Real Time- PCR)
PCR EM TEMPO REAL
Real Time PCR Syber Green Vantagem: Barato Flexível Desvantagem: Pouco específico Todo e qualquer produto formado contribuirá para o aumento da fluorescência Primer dimers são um problema Necessita de uma otimização para que não haja formação de produtos inespecíficos na reação
Real Time PCR Syber Green Corante não-específico Equivalente ao brometo de etídio Se liga a dupla fita de DNA A quantidade de fluorescência é proporcional a quantidade de DNA Intensificação da emissão de fluorescência quando ligado à fita dupla de DNA
Real Time PCR Taqman probes Sonda marcada com um fluoróforo (reporter ) e um quencher A sonda se liga ao produto de PCR durante a fase de annealing o reporter emite fluorescência que é captada pelo quencher A atividade exonucleásica 5-3 da Taq polimerase hidroliza a sonda e permite que o reporter se afaste do quencher Excitation Amplicon ANNEALING EXTENSION Amplicon 5-3 exonuclease Emission Reporter Quencher
Real Time PCR Taqman probes Excitation Emission O acúmulo de reporter livre é proporcional a quantidade de produto de PCR Amplicon ANNEALING A fluorescência é captada na fase de extensão EXTENSION Vantagem Alta especificidade Amplicon 5-3 exonuclease Reporter Quencher
Real Time PCR Hibridization probes FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) utilizando hybridization probes adjacentes 94 o C Excitation FRET Emission P Probes são marcados 55 o C Amplicon A fluorescência é captada na fase de anneling 72 o C FITC Red 640
Real Time PCR Molecular Beacons Hybridisation probes em forma de loop Quando não anelado ao DNA, a estrutura em loop mantém o reporter e quencher próximos. Não há fluorescência Durante o annealing, o reporter e quencher são separados e a fluorescência emitida é proporcional a quantidade de produto Excitation ANNEALING Amplicon
Sistemas mais descritos nas literaturas
TRESHOLD -CT
Quais os passos necessários para o desenvolvimento de um teste de PCR em tempo real?
Desenho dos primers e sondas SONDA PRIMER Escolha do gene de interesse Amplicons de 50-150bp Conteúdo G/C de 20-80% Evitar repetição consecutiva da mesma base Repetições de mais do que 4 Gs devem ser evitadas TM 68-70ºC Nenhum G na extremidade 5 Selecionar a fita que contenha mais Cs do Gs TM-58-60ºC Os 5 nucleotídeos da extremidade 3 não Devem ter mais de que dois Gs ou Cs
SONDA-FLUORÓFORO-QUENCHER O desenho da sonda depende do sistema escolhido TaqMan, Fret Concentração da sonda 150-300nM A seleção dos fluoróforos deve ser compatíveis com equipamento Escolha adequada do quencher preferencial para NEF-MGB Selecionar fluoróforos com alto coeficiente de excitação Sistema Multiplex- verificar se não há sobreposição dentro do mesmo espectro de ação
QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA 1- Realização da curva padrão Plasmídeo Diluição de amostra 2- Correlacionar com valores previamente conhecidos Painel Internacional de Curva Padrão
DESENVOLVIMENTO DE QUANTIFICAÇÃO DE CARGA VIRAL DO VÍRUS DA HEPATITE B 1-Escolha da região do genoma de interesse Região S 2- Desenho dos primers e sondas 3- Método de extração 4- Padronização da curva 5- Curva padrão com Painel Internacional Opti Quant (Acrometrix) 6- Análises Estatísticas de validação -Precisão -Especificidade -limite de detecção -Coeficiente de variação 7- Controle Interno
DESENVOLVIMENTO DE QUANTIFICAÇÃO DE CARGA VIRAL DO VÍRUS DA HEPATITE B
Comparação entre Cobas TaqMan e TaqMan LACEN-PR para HBV Correlação de Pearson(r):0,9589(p<0,0001)
Comparação entre Cobas Amplicor e TaqMan LACEN-PR para HBV Correlação de Pearson (r):0,8497 (p<0,0001)
Comparação entre Cobas Amplicor e Cobas TaqMan para HBV Correlação de Pearson (r):0,8578 (p<0,0001)
Custo Benefício Entre qpcr e Método Comercial
GENOTIPAGEM DO VHC VALOR PROGNÓSTICO ESTABELECE O TEMPO DE TRATAMENTO
MÉTODOS DE GENOTIPAGEM LiPA hibridização reversa (Stuyver, 1993) Trugene seqüenciamento da região 5 UTR Abbot HCV ASR PCR em tempo real
ANÁLISE DA REGIÃO NS5B SEQÜÊNCIAS CONSENSO
ANÁLISE DA REGIÃO NS5B SEQÜÊNCIAS CONSENSO DESENHO DOS PRIMERS PRODUTO DE 688pb
ANÁLISE DA REGIÃO NS5B SEQÜÊNCIAS CONSENSO DESENHO DOS PRIMERS PRODUTO DE 688pb EXTRAÇÃO DO RNA KIT NUCLISENS MINIMAG
ANÁLISE DA REGIÃO NS5B SEQÜÊNCIAS CONSENSO DESENHO DOS PRIMERS PRODUTO DE 688pb EXTRAÇÃO DO RNA KIT NUCLISENS MINIMAG RT PCR DETECÇÃO
ANÁLISE DA REGIÃO NS5B SEQÜÊNCIAS CONSENSO DESENHO DOS PRIMERS PRODUTO DE 688pb EXTRAÇÃO DO RNA KIT NUCLISENS MINIMAG RT PCR DETECÇÃO
ANÁLISE DA REGIÃO NS5B SEQÜÊNCIAS CONSENSO DESENHO DOS PRIMERS PRODUTO DE 688pb EXTRAÇÃO DO RNA KIT NUCLISENS MINIMAG RT PCR DETECÇÃO PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE PCR QUANTIFICAÇÃO DO DNA PURIFICADO DILUÍDO 20NG SEQÜENCIAMENTO ABI 3130
ANÁLISE DA REGIÃO NS5B SEQÜÊNCIAS CONSENSO DESENHO DOS PRIMERS PRODUTO DE 688pb EXTRAÇÃO DO RNA KIT NUCLISENS MINIMAG RT PCR DETECÇÃO PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE PCR QUANTIFICAÇÃO DO DNA PURIFICADO DILUÍDO 20NG SEQÜENCIAMENTO ABI 3130 ANÁLISES DAS SEQÜÊNCIAS BIOEDIT CODONCODE SEQSCAPE
ANÁLISE DA REGIÃO NS5B SEQÜÊNCIAS CONSENSO DESENHO DOS PRIMERS PRODUTO DE 688pb EXTRAÇÃO DO RNA KIT NUCLISENS MINIMAG RT PCR DETECÇÃO PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE PCR QUANTIFICAÇÃO DO DNA PURIFICADO DILUÍDO 20NG SEQÜENCIAMENTO ABI 3130 ANÁLISES DAS SEQÜÊNCIAS BIOEDIT CODONCODE SEQSCAPE
Região NS5B para as sondas 1a, 1b, 3a e 2a, 2b, 2c
Reação one-step modificado
limite de detecção Sensibilidade analítica painel da Optiquant gen 1b 250 UI/ml Sensibilidade relativa amostras clínicas gen 3a gen 2b gen 1a 125 UI/ml 250 UI/ml 500 UI/ml
Genotipagem por PCR em Tempo Real Total 319 amostras 9 amostras RNA VHC Não detectável 310 amostras RNA VHC detectável 194 amostras Genótipo 1 36 amostras Genótipo 2 80 amostras Genótipo 3 190 amostras detectadas 31 amostras detectadas 80 amostras detectadas
Comparação dos métodos de seqüenciamento e PCR em tempo real para a genotipagem do κ=0,6222; p=0,002
Análises Filogenéticas
Comparação dos métodos de genotipagem por PCR em tempo real e LiPA κ=0,6933; p<0,0001
Números de amostras com subtipos discordantes, indefinidos ou resultados incompletos pelo LiPA (5'UTR) quando comparados com genotipagem por PCR em tempo real da região NS5B do VHC κ=0,1111; p<0,2218
Valores por reação para cada teste de genotipagem por PCR em tempo real
Algoritmo sugerido para laboratório de saúde pública para a realização da genotipagem do VHC por PCR em tempo real
Algoritmo sugerido para laboratório de saúde pública para a realização da genotipagem do VHC por PCR em tempo real R$ 42,28
Algoritmo sugerido para laboratório de saúde pública para a realização da genotipagem do VHC por PCR em tempo real R$ 42,28 R$ 59,56
Algoritmo sugerido para laboratório de saúde pública para a realização da genotipagem do VHC por PCR em tempo real R$ 42,28 R$ 59,56 R$ 58,34
Cytomegalovirus Córioretinite encefalite pneumonite hepatite gastroenterite
RISCO DE INFECÇÃO TMO Fase I Fase II Vírus respiratório Fase III HHV-6 Herpes virus Cytomegalovirus Epstein-Barr virus Varicella zoster Neutropenia Mucosite GVHD agudo 30dias imunidade celular GVHD agudo e crônico 100dias imunidade celular e humoral GVHD crônico >100dias
STATUS SOROLÓGICO D+/R- D+/R+ D-/R+ D-/R- 44% 30% 22% 11%
Pesquisa Quantitativa do Cytomegalovirus Gene ien expressa na replicação viral Controle interno plasmidial Limite de detecção de 10 à 500.000 cópias/ml
Pesquisa Quantitativa do Cytomegalovirus
Identificação do Mycobacterium tuberculosis por PCR em Tempo Real Dificuldades na identificação de M. tuberculosis de amostras diretas em amostras extra pulmonares Presentes em baixa densidade e em baixo número em bacteremias intermitentes (Kiehn, T. JCM, 1986)
Sensibilidade, Especificidade, Valor preditivo positivo e negativo de amostras pulmonares e extrapulmonares Amostras Pulmonares : 3817 amostras Amostras extra pulmonares : 622 amostras Amostras Sensibilidade Especificidade VPP% VPP% Escarro 72,7 97,5 91,4 90,7 LBA 82,1 97,4 89,4 82,1 Urina 11.1 95,2 14,2 93,7 Líquor 5,8 100 100 95,1 Sangue 0 100 0 96,1 Lavado gástrico NAUCK, R,2004 66,6 100 100 90
Identificação do Mycobacterium tuberculosis por PCR em Tempo Real Desenvolvimento da detecção do M. tuberculosis conforme Takahashi, T (JCM, 2006),baseado no gene MPT64
Identificação do Mycobacterium tuberculosis por PCR em Tempo Real Amostras de 139 LCRs: 3 detectadas por PCR convencional 7 detectadas por PCR Tempo Real PCR convencional : 4,5% qpcr : 8,2%
Meningites Bacterianas PCR em Tempo Real (Triplex) para a detecção de Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae N.meningitidis gene ctra-transporte de cápsula polissacarídica Streptcoccus pneumoniae gene lyta responsável pela produção de autolisina Haemophilus influenzae gene bexa responsável pela expressão da cápsula polissácarídica
Meningites Bacterianas Aumentar a sensibilidade da identificação bacteriana Implantação no LACEN-PR através da CGLAB-MS e Instituto Adolf Lutz Implantado em Janeiro de 2008
Meningites Padronização Bacterianas
Meningites Padronização Bacterianas Comparação entre Latex e PCR em tempo real 400 300 Nº amostras LCR 200 100 0 40 369 56 351 112 299 Cultura Látex qpcr Posi6vo Nega6vo
Comparação entre Latéx Padronização e PCR em Tempo Real em amostras de soro 50 38 25 13 0 8,3% Latex posi6vo nega6vo 29,16% PCR em tempo real
Diagnóstico da Padronização Gripe Pandêmica H1N1 Pesquisa por PCR em Tempo Real Protocolo do CDC: 4 genes: Gene da Matriz Nucleoproteína Hemaglutinina RnaseP
Diagnóstico da Padronização Gripe Pandêmica H1N1
Diagnóstico da Padronização Gripe Pandêmica H1N1
Diagnóstico da Padronização Gripe Pandêmica H1N1
PERSPECTIVAS Desenvolvimento de novos diagnósticos
Obrigada pela atenção!