UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB LABORATÓRIO MULTIUSUÁRIO DE ESTUDOS EM BIOLOGIA PROTOCOLO PADRÃO DE TÉCNICAS PARA SECÇÕES EM CRIOSTATO REVISADO EM 26/07/2017 RECOMENDAÇÕES Antes do uso do Criostato, recomendamos a fixação prévia do material, no entanto, o usuário poderá seguir o protocolo mais conveniente ao seu tipo de análise; Para evitar a formação de cristais de gelo no interior dos tecidos durante o uso do criostato, é recomendado a utilização prévia de soluções crioprotetoras, como a sacarose 30%; Para a correta aderência das secções histológicas nas lâminas de vidro, é importante a utilização de substâncias adesivantes, como a gelatina, o silano ou a polilisina. Seguem abaixo os protocolos mais utilizados nas técnicas com criostato: 01) DISSECAÇÃO Se o órgão for muito grande, deve-se fazer a macrotomia deste antes, mas isto vai depender do tipo de análise a ser realizada. 02) FIXAÇÃO Esta etapa consiste na utilização de substâncias que interrompam o metabolismo celular, estabilizando as estruturas e os componentes bioquímicos intra e extracelulares, mantendo assim a arquitetura normal do tecido. Além disso, os fixadores também fornecem maior resistência ao tecido para suportar as demais etapas; Dependendo do tipo de análise, deve-se optar por um fixador específico, por exemplo, para análise em microscopia de fluorescência, é muito utilizado o paraformaldeído tamponado. Neste caso não se deve utilizar o glutaraldeído, pois este gera autofluorescência. Para microscopia de luz branca, o glutaraldeído é um ótimo fixador, mas pode ser utilizado também o paraformaldeído. A formalina neutra tamponada também é utilizada para microscopia de luz branca, mas para uma análise histológica mais geral, não é indicada para análises mais detalhadas; O volume do fixador deve ser em torno de 20x o volume das amostras.
FIXADORES: PARAFORMALDEÍDO 4% TAMPONADO PH 7,2: PFA (Paraformaldeído)... 12 g Água destilada... 150 ml PBS 0,2M... 150 ml Hidróxido de Sódio... 2 pedrinhas ou 3 gotas (1N) Preparo: Aquecer a água destilada até 70 C, no misturador, colocar o imã (bailarina) e liga-lo, acrescentando aos poucos o PFA; Jogar duas pedrinhas ou mais de hidróxido de sódio ou de 3 a 5 gotas de hidróxido de sódio 1N até a mistura ficar clara e homogênea (transparente); Por último, acrescentar a solução de PB 0,2M; Medir o ph (ph ~ 7,2) e filtrar a solução. Observações: O material deve permanecer no fixador de 12-24h; Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, ph 7,2 (30 minutos) e em seguida em H 2 O destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação. FORMALINA NEUTRA TAMPONADA PH 7,2: Observações: Formol 37%... 100 ml Água destilada... 900 ml Fosfato de Sódio Monobásico (1H 2 O)... 4,0 gramas Fosfato de Sódio Dibásico (7H 2 O)... 12,2 gramas Formol 37%... 100 ml Água destilada... 900 ml Fosfato de Sódio Monobásico (Anidro)... 4,0 gramas Fosfato de Sódio Dibásico (Anidro)... 6,5 gramas O material deve permanecer no fixador por aproximadamente 24h; Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, ph 7,2 (30 minutos) e em seguida em H 2 O destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação. ou
GLUTARALDEÍDO 2,5% TAMPONADO PH 7,2: Glutaraldeído 25%... 5mL Tampão Fosfato de Sódio 0,1M... 45mL Observações: O material deve permanecer no fixador de 4-24h; O Glutaraldeído não deve ser usado para testes de imunofluorescência; Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, ph 7,2 (30 minutos) e em seguida em H 2 O destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação. Solução Tampão Fosfato de Sódio (PBS - 0,2M) Água destilada... 1 L Fosfato de Sódio dibásico anidro... 11g Fosfato de Sódio monobásico monohidratado...2,75g Solução Tampão Fosfato de Sódio (PBS - 0,1M) Água destilada... 1 L Tampão PBS 0,2M... 1 L 03) PROCESSAMENTO COM SACAROSE Esta etapa consiste na retirada do fixador por substituição da sacarose, uma solução crioprotetora. Fazer as soluções de sacarose no momento do uso (máximo 1/2 dia); Dependendo do tecido é importante fazer mais diluições (10%, 20% e 30%). Reagentes: Solução de sacarose 10% Tampão utilizado na fixação... 100ml Sacarose... 10g
Solução de sacarose 20% Tampão utilizado na fixação... 100ml Sacarose... 20g Solução de sacarose 30% Tampão utilizado na fixação... 100ml Sacarose... 30g Procedimento: Deixar de 1 a 2 horas na solução de 10 e 20% e no mínimo 4 horas na solução de 30% (esta pode ficar por até 48hs); Após 2 horas na sacarose 30% deve-se conservar o material em geladeira; Levar o material para ser seccionado no Criostato mergulhado na sacarose 30% ou se preferir, pode levá-lo já congelado ou emblocado com o meio de montagem para espécimes em congelamento. Importante: Caso o material esteja no fixador, antes de colocar nos banhos de sacarose deve-se primeiramente lavar o material em tampão (no mesmo tampão do fixador) por aproximadamente 30 minutos. O tampão da sacarose também deve ser o mesmo utilizado no fixador. Se o material já estiver em álcool 70%, recomendamos hidrata-lo antes de proceder com os banhos de sacarose realizando o seguinte procedimento: de 30min a 1 hora no álcool 50%; de 30min a 1 hora no álcool 30%, de 30min a 1 hora em água destilada ou tampão (o mesmo da sacarose). Em seguida proceder com os banhos de sacarose descritos acima.
04) ENDURECIMENTO DO MATERIAL Esta etapa consiste no endurecimento do tecido através da técnica de congelamento, permitindo assim, a realização de secções finas (5 a 50 micrômetros); O congelamento das amostras pode ser realizado diretamente na câmera criostática, na temperatura de - 15ºC à -30ºC. A temperatura de congelamento vai depender do tipo de amostra, por exemplo, amostras com maior teor de água requerem temperaturas mais altas e com maior teor de gordura temperaturas mais baixas; As amostras poderão ser previamente congeladas em freezers antes do uso do criostato. Neste caso, recomenda-se a ambientação das amostras na câmara criostática por no mínimo 1 hora; Amostras muito pequenas poderão ser emblocadas com o uso de meio de montagem para espécimes em congelamento. Este emblocamento pode ocorrer utilizando a câmara criostática ou freezer. A temperatura de congelamento do bloco vai depender do tipo de amostra. 05) ADERÊNCIA DAS SECÇÕES HISTOLÓGICAS NAS LÂMINAS HISTOLÓGICAS Para melhor aderência das secções histológicas nas lâminas de vidro, é importante a utilização de substâncias adesivantes nessas, como a gelatina, o silano ou a polilisina. GELATINIZAÇÃO DAS LÂMINAS: Solução de revestimento: Preparo: Água destilada... 750 ml Sulfato de Cromo e Potássio... 0,48 g (ou 5 gotas de toluol ou fenol) *Estes reagentes são antifúngicos Gelatina incolor e sem sabor... 3,75g Aquecer a água destilada até 70 C, e então colocar a gelatina sob agitação, Tomar cuidado para não empelotar a gelatina; Quando a solução estiver homogeneizada coloque o antifúngico; Filtrar a solução. Fazer a solução de gelatinização no momento do uso (máximo 1/2 dia).
Procedimento: Mergulhar as lâminas em água destilada e depois mergulhar na solução de gelatina. Tomar cuidado com as bolhas; Escorrer e deixar secar em estufa (45ºC) na posição vertical, no suporte de lâminas; Mergulhar novamente na solução de gelatina; Escorrer e deixar secar novamente em estufa (45ºC) na posição vertical, no suporte de lâminas. Quando as lâminas estiverem bem secas, estas podem ser guardadas a temperatura ambiente por um longo período de tempo. Importante: Caso não seja utilizado o antifúngico, guardar as lâminas por no máximo 2 semanas a temperatura ambiente; Para análise de imunofluorescência não recomendamos o uso da gelatina. SILANIZAÇÃO DE LÂMINAS - PARA IMUNOHISTOQUÍMICA Solução de revestimento: Silano... 10 ml Acetona... 400ml Procedimento: Mergulhar as lâminas na solução de silano 2,5% (5 min); Mergulhar em água Destilada (2 min); Escorrer e deixar secar a temperatura ambiente na posição vertical, no suporte de lâminas. Não utilizar luvas com talco. POLINIZAÇÃO DE LÂMINAS - PARA IMUNOHISTOQUÍMICA Solução de revestimento: poli-l-lisina 0,01% Procedimento: Mergulhar as lâminas na solução de poli-l-lisina 0,01% por 30 min; Escorrer e deixar secar em estufa (40ºC) na posição vertical, no suporte de lâminas. Não utilizar luvas com talco.