Os indivíduos selecionados para participarem da segunda fase do estudo responderam o questionário de Pittsburg (Buysse e col., 1989) para análise da qualidade de sono (anexo 9), utilizaram o tempatilumi e responderam o diário de sono (anexo 1) por três semanas nos meses de agosto e novembro. No mês de novembro, tivemos a desistência de 3 voluntários em Natal e problemas com o registro de 2 voluntários em São Paulo. Estes 5 voluntários foram excluídos da segunda fase do estudo (novembro). - Preparação dos dados para as análises dos parâmetros circadianos Após a coleta dos dados pelo tempatilumi, foram retiradas das séries temporais fases que os indivíduos ficaram sem o aparelho (edição dos dados), como por exemplo, para tomar banho. Os diários de sono nos auxiliaram nesta tarefa. Nos casos em que os indivíduos ficaram sem o aparelho por um dia inteiro ou mais, estes foram excluídos da série. Fizemos uma média móvel de 2h para cada indivíduo. A média móvel nos auxiliou na visualização dos actogramas de indivíduos que tiraram o aparelho muitas vezes. Assim, com o auxílio do programa El Temps, as séries foram plotadas em gráficos (actogramas, termogramas, periodogramas, curvas de onda e cosinor) para a primeira visualização. Para cada indivíduo, plotamos o dado bruto editado e o mesmo reeditado por meio da média móvel. - Análise dos parâmetros circadianos Com o programa El Temps, calculamos o início e final da fase de atividade e as acrofases da temperatura periférica (do punho) e da atividade. Os dados de início e final da atividade foram comparados com as declarações feitas pelos voluntários nos diários de sono e com os actogramas. Como o El Temps não calculou muito bem o final da atividade e tivemos bastante problemas com os horários das acrofases das temperaturas, optamos por utilizar regras baseadas em mé móveis, semelhante às 26
utilizadas nos animais, para calcular o início e final da atividade e nos baseamos nas regras que Witting e col. (199) criaram para determinar a extensão de fase de maior expressão da atividade diária (M1), para calcularmos a meia fase de M1 (MFM1) para atividade e a meia fase de M6 (MFM6) para temperatura. Desta forma, os valores de M1 correspondem a uma fase de 1h com os valores mais altos dos níveis de atividade, e a MFM1 foi utilizada em nossas análises da atividade e calculada diariamente para cada indivíduo. Baseados nestas mesmas regras, determinamos também o M6 da temperatura, ou seja, as 6h de maiores valores da temperatura do punho ao longo das 24h de um dia, e calculamos a partir daí a MFM6. Utilizamos o programa MATLAB (Mathworks, versão 7, Massachussetts, EUA) para determinação do início e final da atividade, MFM1 para atividade e MFM6 para temperatura. Todos estes dados apresentaram correlação positiva com os dados para acrofase calculados pelo programa El Temps (dados não mostrados). Comparamos também as relações de fase dos diversos parâmetros circadianos entre os grupos de indivíduos de São Paulo e Natal, tanto de uma forma geral como relativo aos genótipos (PER3 4/4, PER3 5/5 ) e também relativo aos dois momentos do ano analisados (agosto e novembro), utilizamos em média dados referentes a 21 de experimento, em cada fase, para cada indivíduo. Foram comparados os horários de início e final da atividade, MFM1 para atividade e MFM6 para temperatura em ambos os grupos divididos por local, genótipo e épocas do ano (agosto e novembro). Foram calculados também diversos ângulos de fase para visualizarmos as relações de fase entre os grupos estudados. Para o cálculo dos ângulos de fase consideramos também os horários de nascer e o pôr do sol em São Paulo e Natal, que foram obtidos no site http://www.timeandate.com. Os ângulos de fase calculados encontram-se na tabela 1. 27
Tabela 1: Ângulos de fase calculados em todos os grupos de estudo: São Paulo, Natal, PER3 4/4, PER3 5/5, agosto e novembro. Ângulos de Fases Variável 1 Variável 2 1 Início da atividade Nascer do Sol 2 Final da atividade Pôr do Sol 3 MFM6 da temperatura Início da atividade 4 MFM6 da temperatura MFM1 da atividade 5 (Duração da fase de atividade) Início da atividade Final da atividade 6 MFM6 da temperatura Final da atividade 7 Início da atividade MFM1 da atividade 8 MFM1 da atividade Final da atividade 3.2.4. Análises Estatísticas As análises estatísticas foram feitas no programa STATISTICA (StatSoft Inc., 1984-7, USA). O nível de significância adotado foi p <,5. Baseado nos resultados do teste de normalidade de Kolmogorov-Sminorv utilizamos o teste t de student para comparar os resultados. Para comparação entre duas fases (agosto e novembro) utilizamos o teste t pareado (para amostras dependentes). 28
4. resultados
4.1. Primeira fase experimental: Análise do ritmo circadiano da atividade locomotora em camundongos Per3 -/- e selvagens submetidos a diferentes fotofases. A observação dos periodogramas (Sokolove and Bushell, 1978) revela uma prevalência de ritmos circadianos em todos os regimes CE que foram utilizados no experimento, tanto nos animais selvagens como nos animais Per3 -/- (dados não mostrados). Visualmente, podemos observar nos actogramas (figuras 4, 5, 6, 7, 8 e 9) um aumento de atividade dos animais Per3 -/- na fase clara em relação aos animais selvagens. Na mudança para fotofase longa (16C/8E) podemos notar que os animais Per3 -/- levam ao menos um dia a mais para sincronizar. No geral, tanto os animais selvagens como os Per3 -/- parecem estar mascarados à luz na fotofase longa, pois quando submetidos a escuro constante eles voltam a mesma fase que estavam no ciclo 12C/12E 2.
Per3 -/- Per3 -/- 1 1 16C:8E 6 E:E 2 7 E:E 2 7 31 16C:8E 6 Figura 4: Actogramas em duplo plot de 2 animais do grupo Per3 -/-. As regiões em cinza escuro mostram as fases de escuro. Os com dados em branco foram devido ao inesperado travamento da roda de atividade. No eixo esquerdo temos os do experimento, no eixo direito os regimes CE utilizados e no eixo superior as 48h de registro.
Per3 -/- Per3 -/- 1 1 16C:8E 16C:8E 6 6 7 E:E 2 7 E:E 2 Figura 5: Actogramas em duplo plot de 2 animais do grupo Per3 -/-. As regiões em cinza escuro mostram as fases de escuro. Os com dados em branco foram devido ao inesperado travamento da roda de atividade. No eixo esquerdo temos os do experimento, no eixo direito os regimes CE utilizados e no eixo superior as 48h de registro. 32
Per3 -/- Per3 -/- 1 1 16C:8E 16C:8E 6 6 7 E:E 2 7 E:E 2 Figura 6: Actogramas em duplo plot de 2 animais do grupo Per3 -/-. As regiões em cinza escuro mostram as fases de escuro. Os com dados em branco foram devido ao inesperado travamento da roda de atividade. No eixo esquerdo temos os do experimento, no eixo direito os regimes CE utilizados e no eixo superior as 48h de registro. 33
Selvagem Selvagem 1 1 16C:8E 16C:8E 6 6 E:E 2 7 E:E 2 7 Figura 7: Actogramas em duplo plot de 2 animais do grupo selvagem (controles). As regiões em cinza escuro mostram as fases de escuro. Os com dados em branco foram devido ao inesperado travamento da roda de atividade. No eixo esquerdo temos os do experimento, no eixo direito os regimes CE utilizados e no eixo superior as 48h de registro. 34
Selvagem Selvagem 1 1 16C:8E 16C:8E 6 6 7 E:E 2 7 E:E 2 Figura 8: Actogramas em duplo plot de 2 animais do grupo selvagem (controles). As regiões em cinza escuro mostram as fases de escuro. Os com dados em branco foram devido ao inesperado travamento da roda de atividade. No eixo esquerdo temos os do experimento, no eixo direito os regimes CE utilizados e no eixo superior as 48h de registro. 35
Selvagem Selvagem 1 1 16C:8E 16C:8E 6 6 7 E:E 2 7 E:E 2 Figura 9: Actogramas em duplo plot de 2 animais do grupo selvagem (controles). As regiões em cinza escuro mostram as fases de escuro. Os com dados em branco foram devido ao inesperado travamento da roda de atividade. No eixo esquerdo temos os do experimento, no eixo direito os regimes CE utilizados e no eixo superior as 48h de registro. 36
Utilizando o valor do raio da roda de atividade, calculamos o quanto cada animal andou em centímetros por dia nas fases clara e escura, separadamente. Os resultados mostram que os animais do grupo Per3 -/- realmente são mais ativos na fase clara. Foi encontrada uma diferença significantiva somente na fotofase longa (figura 1). Figura 1: Atividade em centímetros dos animais do grupo controle (selvagens) e do grupo Per3 -/-. O gráfico A mostra a atividade dos animais na fase clara dos ciclos claro/escuro. Existe uma diferença significativa somente na fotofase longa (p=,3). O Gráfico B mostra a atividade dos animais na fase escura dos ciclos claro/escuro. Os ângulos de fase de sincronização ao CE (diferença entre o horário do início da fase escura e início da atividade) foram calculados em cada regime de CE (figura 11). Não existe diferença estatística entre os grupos em nenhum regime CE analisado, no entanto, 37
nas fotofases 12C/12E 1 e 16C/8E há uma tendência para um menor ângulo de fase nos animais Per3 -/- em relação aos selvagens (p=,56 e p =,88, respectivamente). Existe uma alta variabilidade (desvio padrão foi maior que a média) encontrada nestes regimes CE (12C/12E 1 e 16C/8E), principalmente entre os animais do grupo Per3 -/-. Figura 11: Ângulos de fase de sincronização ao CE em cada regime de luz analisado. Ângulos de fase com valores negativos mostram que os animais começaram a atividade depois das luzes apagaram. Comparamos o número de que os animais selvagens e Per3 -/- levam para sincronizar nas fotofases curta e longa (8C/16E, 16C/8E) e o número de que os animais selvagens e Per3 -/- levam para sincronizar no ciclo 12C/12E 2. Optamos por não calcular os transientes na primeira fotofase (12C/12E 1), pois os animais já estavam 38
sincronizados a este regime CE. Existe realmente uma diferença na fotofase longa (16C/8E), os animais Per3 -/- levam em média um dia a mais para sincronizar do que os animais selvagens (p =,1). De maneira geral, nossos resultados mostram um aumento de atividade dos animais do grupo Per3 -/- na fase clara, na fotofase longa (16C/8E). Os animais do grupo Per3 -/- levam em média um dia a mais para sincronizar ao início do regime de fotofase longa e aparentemente a relação de fase entre o apagar das luzes e o início da atividade é a mesma quando comparados o grupo controle com o grupo Per3 -/-. No entanto, a alta variabilidade dos animais do grupo Per3 -/- provavelmente interfere em nossas análises. Visualmente, esta relação de fase aparenta ser diferente quando comparados os grupos no regime de fotofase longa, mas estatisticamente não foi possível comprovar esta informação (Figura 11). 4.2. Segunda fase experimental: Organização temporal dos indivíduos em função da latitude e do genótipo PER3. 4.2.1. Primeira Fase: caracterização populacional - fenotipagem, genotipagem e caracterização demográfica Todos os indivíduos selecionados em Natal (n=198) e em São Paulo (n=237), para este primeiro momento do estudo de caracterização populacional, foram classificados quanto à idade, sexo, tendência à matutinidade ou vespertinidade pelos questionários HO e MCTQ e genotipagem do polimorfismo de repetição do gene PER3 (PER3 4/4, PER3 4/5, PER3 5/5 ) (Tabela 2). Encontramos uma diferença estatisticamente significativa na pontuação do MCTQ entre São Paulo e Natal. O grupo em Natal apresenta valores médios menores do que em São Paulo. Esta diferença não aparece na análise do questionário HO. 39
Tabela 2: Caracterização da amostra coletada em Natal e em São Paulo. Natal (RN) São Paulo (SP) (N=198) (N=237) Idade Sexo Pontuação HO MCTQ (meia fase do sono) PER3 4/4 PER3 4/5 PER3 5/5 22,45 ± 6,97 62,12% F 48,28 ± 12,25 4,49 ± 1,42 N = 78 (39%) N = 98 (49%) N = 22 (11%) 21,59 ± 9,17 81,1% F 47,9 ± 12,3 4,83 ± 1,71*(p<,1) N = 14 (44%) N = 16 (45%) N = 27 (11%) As figuras 12 e 13 mostram a distribuição da população deste estudo em relação à preferência diurna para os questionários HO e MCTQ em São Paulo e no Rio Grande do Norte. Figura 12: Distribuição da população analisada quanto à preferência diurna em São Paulo e no Rio Grande do Norte por meio do questionário HO.
Figura 13: Distribuição da população analisada quanto a preferência diurna em São Paulo e no Rio Grande do Norte por meio do MCTQ. 4.2.2. Segunda Fase Caracterização amostral Os indivíduos selecionados para participarem da segunda fase também foram caracterizados segundo à idade, o sexo, a pontuação nos questionários HO e MCQT, pontuação da escala de qualidade do sono de Pittsburg e pelos genótipos PER3 4/4 e PER3 5/5 (Tabela 3). De maneira geral, selecionamos uma amostra bastante homogênea para podermos comparar os diferentes genótipos (PER3 4/4 e PER3 5/5 ). Dos 29 indivíduos selecionados, nenhum trabalha ou trabalhou nos últimos 2 anos durante a madrugada. Somente 2, dos 29 indivíduos não têm uma rotina regular de sono durante a semana, podendo 41
variar os horários de sono em até 2h de um dia para o outro. Nenhum indivíduo fez uso de medicamentos que pode afetar a qualidade do sono. Dos 29 indivíduos, somente 3 roncam às vezes, mas não se queixam de cansaço durante o dia. Somente 2 indivíduos queixaram-se de insônia, mas com pouca frequência. Nenhum voluntário selecionado queixou-se de problemas de sono. Todos os voluntários selecionados para participarem da segunda fase do estudo moram próximo ou na mesma cidade que nasceram. Tabela 3: Caracterização dos indivíduos selecionados para participarem da segunda fase do estudo. Natal (RN) N = 14 São Paulo (SP) N = 15 Idade Sexo Pontuação HO MCTQ Pontuação Pittsburg PER3 4/4 PER3 5/5 21,14 ± 2,38 73,3% F 49,57 ± 9,74 4,71 ± 1,62 4,28 ± 2,7 N = 7 (%) N = 7 (%), ± 2,96 64,3% F 51,7 ± 5,72 4,27 ± 1,6 4,53 ± 2,56 N = 8 (%) N = 7 (%) - Análise dos parâmetros circadianos A observação dos periodogramas (Sokolove and Bushell, 1978) revela uma prevalência de ritmos circadianos tanto no ritmo de atividade como no ritmo de temperatura. A visualização dos actogramas nos ajudaram a definir as fases de início e final da atividade. Os dados obtidos nas análises feitas no El Temps e no MATLAB apresentaram correlação positiva com os dados calculados pelo programa El Temps (dados não mostrados) e portanto, decidimos trabalhar com os dados do MATLAB relativos às variáveis de início e final da atividade, MFM1 da atividade e MFM6 da temperatura 42
(Witting e col.,199; Van Someren e col., 1996). Alguns horários sobre o final da atividade obtidos com as análises pelo El Temps não condiziam com os dados do diário de sono e actogramas e alguns dados da acrofase de temperatura não seguiam o padrão esperado. Neste ponto, as fórmulas que usamos para calcular os dados no MATLAB foram mais eficientes e os dados ficaram de maneira geral mais coerentes. Reduzimos os dados de 21 para dados médios de 24h por indivíduo, em cada fase do estudo (agosto e novembro), para todas as variáveis circadianas analisadas: início da atividade, final da atividade, MFM1 da atividade e MFM6 da temperatura. Foram excluídos das análises os dados MFM6 da temperatura de um indivíduo em São Paulo e três indivíduos em Natal, ambos em novembro, pois os dados ficaram muito fora do padrão esperado. E além disso, na segunda fase (novembro), como já descrito nos materiais e métodos, tivemos a desistência de dois voluntários em São Paulo e 3 voluntários em Natal, reduzindo bastante o tamanho da amostra em nossos grupos de estudo. 43
- Sugestão de leitura para os próximos passos das análises dos resultados De maneira geral, o escopo de dados para este segundo momento do experimento (actimetria, temperatura corporal, horários sociais e de nascer e pôr do sol), suas relações e as formas como foram analisados são bastante extensas e complexas e como consequência de difícil visualização como um todo. Desta forma optamos, para facilitar a leitura, por expor as análises em duas formas: 1. Mais formal no formato de tabelas com os números e valores absolutos obtidos e 2. Em forma gráfica criada por nós para tornar possível a visualização da ordem temporal externa (Menna-Barreto e Díez-Noguera, 12). Sugerimos, veementemente, ao leitor, que inicie a leitura da seção resultados pela observação das formas gráficas (figuras) que são muito mais inteligíveis do que as tabelas e que use as últimas para verificação dos valores médios para cada variável e seus respectivos desvios padrão, se achar necessário. Essas figuras têm como horário de referência o horário social ou horário do relógio local e incluem, portanto, a mudança deste em São Paulo durante os meses de horário de verão. Toda a discussão que seguirá se baseará nos resultados obtidos da análise, nos valores mostrados nas tabelas e nessas figuras. Além disso, realizamos também figuras que têm como horários de referência fases específicas, endógenas ou ambientais, das variáveis estudadas. Estabelecemos, por exemplo, como hora zero nestas figuras, a MFM6 da temperatura, o início da atividade, ou ainda o pôr ou nascer do sol ou o meio da fotofase. Pela extensão do arquivo e pela ausência de discussão específica desta forma de olhar os dados, esta leitura é opcional e encontra-se no anexo 11. Optamos por mostrá-las na esperança que tenham algum valor heurístico para um leitor que tenha um interesse mais profundo no conjunto dos dados. 44
- Tabelas Primeiramente, serão mostradas as comparações gerais feitas entre os grupos amostrais em São Paulo e Natal para cada variável circadiana analisada: início e final da fase de atividade, MFM1 e MFM6 (tabelas 4 e 5). Em seguida, serão mostradas as comparações dos grupos amostrais em São Paulo e Natal subdivididos pelos genótipos (PER3 4/4 e PER3 5/5 ) (tabelas 6, 7, 8 e 9). Então, as comparações dos diferentes genótipos (PER3 4/4 e PER3 5/5 ) nos grupos amostrais em São Paulo (tabelas 1 e 11) e Natal (tabelas 12 e 13) e por fim, as comparações entre as duas fases do estudo (agosto e novembro) no grupo amostral em São Paulo (tabelas 14, 15 e 16) e, separadamente, no grupo amostral em Natal (tabelas 17, 18 e 19). Como descrito na seção métodos, iniciamos a comparação das fases das variáveis circadianas do estudo entre os grupos amostrais em São Paulo e Natal (tabelas 4 e 5). De maneira geral, as fases circadianas das variáveis analisadas estão atrasadas no grupo amostral em Natal, principalmente na segunda fase do estudo (tabela 5). Tabela 4: Comparações gerais das fases circadianas entre os grupos amostrais em São Paulo e Natal, na primeira fase do estudo (agosto). Variáveis circadianas Média ± DP São Paulo (h:min) Média ± DP Natal (h:min) São Paulo (N) Natal (N) Início da atividade 6:43 ± 1:56 7:28 ± :54 15 14. Final da atividade :2 ± 1:23 :25 ± 1:6 15 14.42 MFM1 da atividade 14:2 ± 1:39 15:19 ± 1:16 15 14.3 MFM6 da temperatura 3:6 ± 1:17 3:47 ± :59 15 14.12 DP = Desvio Padrão p 45