32 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS PUC Goiás ESCOLA DE ENGENHARIA CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS Aula nº 7 e 8 Quantificação de Microrganismos: Diluição e Plaqueamento Spreader Plate e Pour Plate Introdução A presença de microrganismos nos alimentos pode ser considerada prejudicial em alguns casos, enquanto que em outros são considerados benéficos, como certos microrganismos que são necessários na preparação de alimentos tais como queijos, iogurte, chucrute, etc. e por isso são intencionalmente adicionados. No entanto, alguns microrganismos prejudiciais podem ser adicionados através do manuseio do alimento durante o empacotamento e a estocagem. Estes podem alterar as características como aroma, textura, sabor e cor de muitos alimentos. No caso da presença de microrganismos patogênicos ou seus produtos em um alimento como toxinas, podem levar a pessoa consumidora a sérios casos de infecção ou mesmo intoxicação, e em alguns casos à morte. Estudos envolvendo a análise de materiais tais como alimentos, água, leite e em alguns casos o ar, requerem a enumeração quantitativa de microrganismos nestes materiais. Na quantificação do tamanho das populações destes microrganismos, é necessário o uso de esquemas de diluição. Isto porque o tamanho da população pode ser tão grande que sua enumeração direta em meio sólido torna-se impossível. O método também é conhecido como contagem do número de células viáveis em uma determinada população, também denominada Contagem em Placa. Trata-se de um método indireto que se baseia no princípio de que cada célula viável, quando presente no meio sólido, pode se multiplicar repetidas vezes e origina uma colônia visível a olho nu. A técnica se baseia no princípio de que quando se espalha uma quantidade suficientemente pequena de material, pode-se obter células individuais, separadas uma das outras, permitindo que o crescimento de uma célula não interfira com o da outra. Provavelmente cada colônia isolada é descendente de uma única célula e portanto, uma cultura pura. No caso de isolamento de estafilococos e estreptococos, em que as células formam grupamentos característicos, as colônias se desenvolvem a partir de um grupo
33 de células do mesmo tipo, representando, também, uma cultura pura. A morfologia das colônias formadas em meio sólido pode auxiliar na diferenciação do microrganismo. As diluições são feitas pipetando-se as amostras e adicionando-as a um líquido diluente que pode ser cloreto de sódio 0,85%, água peptonada ou outro diluente conforme o tipo de alimento. Dos frascos com diluições são tiradas alíquotas e semeadas em meio de cultura sólido. Partindo da suposição de que as células com as quais estamos trabalhando não se agregam, cada uma dará origem a uma colônia. Contando as colônias que cresceram nas placas, teremos o número de bactérias da cultura que estamos ensaiando. Porém, como algumas bactérias formam agrupamentos ou arranjos, não é possível fazer esta relação, ou seja, estabelecer o n.º de colônias e o n.º de células. Por isso, o resultado deve ser expresso em UFC (Unidades Formadoras de Colônias). Tipos de Plaqueamento Existem duas técnicas de contagem: a Contagem em superfície ou Spreader Plate e a Contagem em Profundidade ou mistura ou Pour Plate. Em ambas as técnicas, a suspensão microbiana é diluída em série (normalmente uma diluição decimal) e uma alíquota de volume conhecido de cada diluição é transferida para a placa com posterior derramamento do meio fundido ou no próprio meio de cultura na placa de Petri. A escolha da técnica depende da análise de qual grupo ou microrganismos, apresentando vantagens ou desvantagens. A técnica Pour Plate, é mais trabalhosa, dificulta a visualização de microrganismos que produzem micélio (fungos filamentosos bolores e actinobactérias), porém é mais exata. Técnica "Spreader Plate": é um método comumente empregado na análise de alimentos. Amostras de alimentos são maceradas e diluições do produto são pipetadas em placas de Petri esterilizadas contendo o meio de cultura requerida para a análises. Após incubação, as colônias bacterianas são contadas em um contador de colônias que pode ser manual ou digital. O método de contagem total de microrganismos de alimentos por meio de placas baseia-se no plaqueamento de alíquotas do alimento homogeneizado e de suas diluições, onde é utilizado o meio de cultura Ágar Padrão para Contagem. A mudança de
34 temperatura e tempo de incubação permite a contagem de grupos diferentes de microrganismos como: psicrotróficos, mesófilos, termófilos e termodúricos. Esta metodologia também se aplica para análises de estafilococos, bolores e leveduras, variando-se o meio de cultura e a temperatura de incubação. Para determinar o número de microrganismos na amostra original são selecionadas placas com o número de colônias entre 25 e 250. Menos de 25 colônias o resultado não é confiável, uma vez que contaminantes podem causar ao menos 4% de erro. No caso de uma placa com mais de 250 colônias, a contagem é mais difícil e portanto mais trabalhosa. A contagem é expressa em número de bactérias por mililitro do meio de cultura ou UFC/mL. Este número de bactérias na amostra original é calculado usando a seguinte equação: Bactérias/mL = Nº de Colônias (UFC/mL) Diluição* *Diluição refere-se a diluição da amostra. Por exemplo, se 37 colônias estão presentes em uma placa com diluição 1:100, o cálculo pode ser: Bact./mL ou UFC/mL=37 = 37 x 10 2 = 3700 = 3,7 x 10 3 bact/ml ou UFC/mL 10-2 Como muitas bactérias ocorrem em arranjos característicos e não isoladas como células únicas, pode ocorrer que a colônia seja formada desse arranjo ou unidade. Neste caso, o mais apropriado de se expressar será 3,7 x 10 3 UFC/mL. (UFC- Unidade Formadora de Colônia). Técnica em Mistura (técnica da placa derramada ou Pour plate ): é também conhecida como técnica em profundidade. Nesta a amostra é diluída em tubos diluentes e adicionadas alíquotas em uma placa de Petri esterilizada vazia, onde posteriormente será adicionado ágar liquefeito (fundido), e após solidificação, as placas serão incubadas. Como alguns microrganismos são retidos abaixo da superfície do ágar durante a solidificação, a placa mostrará colônias na superfície e colônias situadas logo abaixo da mesma. Esta técnica é recomendada para isolamento de microrganismos móveis ou quando há suspeita de microrganismos anaeróbios e também muito utilizado para a contagem microbiana em diferentes diluições, em uma análise de alimento.
Cultura mista 10-1 10-2 10-3 **15-20 ml Microbilogia de Alimentos I - Curso de Engenharia de Alimentos 35 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml de sólido meio Esquema do plaqueamento Pour Plate. ** A forma de se obter a contagem é a mesma da técnica de plaqueamento Spreader Plate. Essa técnica se aplica a diferentes grupos microbianos, considerando o meio de cultura e a temperatura. Parte Experimental para o Plaqueamento Spreader Plate - Com as condições mais assépticas possíveis, pesar 25g ou medir 25 ml do alimento selecionado para a análise; - Transferir para o saquinho do "stomacher", contendo 225 ml de água peptonada ou salina esterilizada e bater por alguns minutos. Isto cria a diluição 1:10 (10-1 ); - Transferir 1,0 ml desta diluição para um frasco contendo 9,0 ml do diluente (diluição 1:100 10-2 ).e assim por diante, conforme o esquema do professor;
36 - Pipetar 0,1mL (100μl) de cada diluição e transferir para uma placa contendo meio de cultura esterilizados e espalhar a alíquota com o auxílio da alça de Drigalsky até que o líquido tenha sido absorvido pelo meio; - Incubar as placas em posição invertida a 35 o C por 24h. Parte Experimental para o Plaqueamento Pour Plate - Com as condições mais assépticas possíveis, pesar 25g ou medir 25 ml do alimento selecionado para a análise; - Transferir para o saquinho do "stomacher", contendo 225 ml de água peptonada ou salina esterilizada e bater por alguns minutos. Isto cria a diluição 1:10. - Transferir 1,0 ml desta diluição para um frasco contendo 9,0 ml do diluente (diluição 1:100).e assim por diante, conforme o esquema da aula anterior; - Pipetar 1,0mL de cada diluição e transferir para uma placa esterilizada (fazer em duplicata) e verter 15-20 ml de meio sólido fundido e homogeneizar a placa em movimentos em 8 por 10 vezes e esperar solidificar; - Incubar as placas em posição invertida a 35 o C por 24h.