Escola Secundaria Camilo Castelo Branco

Escola Secundaria Camilo Castelo Branco QUANDO OS ANTIBIÓTICOS NÃO FUNCIONAM? OS FAGOS COMO ALTERNATIVA ANA FILIPA MACHADO MARIA JOÃO GONÇALVES PEDRO COSTA TIAGO CARVALHO Ano 12º Turma A / E Disciplina Biologia 12º Professor Hélder Silva Vila Nova de Famalicão, Maio de 2010 1

Índice 1.Resumo 4 2.INTRODUÇÃO 4 2.1CARACTERISTICAS DA E.COLI 5 2.2CARACTERISTICAS DOS FAGOS 5 2.3FAGOS COMO ALTERNETIVA AOS ANTIBIÓTICOS 6 2.4 PORQUE É QUE USAMOS ÁGUA DO RIO PELHE? 6 3.O TRABALHO EXPERIMENTAL 7 4.Actividade 1- Preparação do material e dos meios 9 4.1Objectivos 10 4.2Resultados 10 5.Actividade 2-Isolamento e purificação de E. coli de amostras de águas. 11 5.1Objectivos. 12 5.2Método: 12 5.3 Resultados: 13 5.4Interpretação dos resultados 14 5.5 Conclusão. 15 6.Actividade 3- Isolamento e purificação de fagos de E. coli. 16 6.1 Objectivo 17 6.2Método 17 6.3 Resultados 18 6.4Interpretação dos resultados 19 6.5 Conclusão 20 7.Actividade 4 Host Range do fago isolado 21 7.1 Objectivo 22 7.2Método 22 7.3 Resultados 22 7.4Interpretação dos resultados/conclusão 24 8. CONCLUSÕES FINAIS 24 9.Anexos 25 9.1 Cuidados a ter durante a elaboração da experiência 25 10.BIBLIOGRAFIA 26 2

1.Resumo: A Echerichia coli é uma bactéria que pode ser encontrada no intestino de animais homeotérmicos ou de sangue quente. A maioria das estirpes é inofensiva, no entanto, algumas podem causar graves intoxicações alimentares em humanos. A actividade experimental, realizada no âmbito do Projecto Ciência Viva, teve como principal objectivo analisar a actuação dos fagos patogénicos para Echerichia coli sobre estirpes diferentes de Echerichia coli e verificar se serão ou não uma alternativa à utilização de antibióticos. Foi possível constatar que caso os antibióticos não funcionem, os fagos podem ser utilizados como magic bullets e substituir totalmente os antibióticos se for isolado fagos específicos para determinadas estirpes Se o EOP for elevado. 2. Introdução Com esta actividade experimental, no âmbito da disciplina de Biologia 12º e do Projecto Ciência Viva, pretendeu-se isolar bactérias e fagos presentes em água recolhida no Rio Pelhe, e, de seguida, promover o contacto entre fagos e diferentes estirpes de bactérias de modo a saber se são uma alternativa aos antibióticos. Para cumprir os objectivos propostos pelo Projecto Ciência Viva, realizaram-se actividades experimentais como: - Preparação dos meios - Recolha e selecção de amostras de água do Rio Pelhe - Verificar se existem bactérias Echerichia coli na amostra de água recolhida e proceder ao seu isolamento - Isolamento a partir da amostra, de água recolhida no rio, os fagos - Colocação de fagos em contacto com estirpes de Echerichia coli isoladas a partir da amostra de água do rio e cedidas pelo Projecto Ciência Viva. Fig.1 Echerichia coli 3

2.1 CARACTERÍSTICAS DA E.COLI A Echerichia coli é mais conhecida por E. coli, e é normalmente encontrada no intestino de animais homeotérmicos ou de sangue quente. A maioria das estirpes de E. coli são inofensivas, no entanto, algumas podem causar graves intoxicações alimentares em humanos, quando estes consomem vegetais não lavados ou carne mal cozinhada. As estirpes inofensivas que fazem parte da microbiótica do intestino, podem ter uma acção benéfica sob o seu hospedeiro, através da produção da vitamina K2, ou evitando que bactérias patogénicas se instalem no intestino. Desde a descoberta do primeiro antibiótico, a penicilina, o tratamento de doenças de etiologia bacteriana tem sido efectuado com estas substâncias, contudo, com o passar do tempo, tem-se acentuado a resistência das bactérias aos antibióticos. 1 Desta forma, foi necessário arranjar alternativas que permitissem um combate eficaz contra o desenvolvimento de bactérias quando os antibióticos não actuam, a utilização de fagos poderá ser uma alternativa. Com esta actividade, pretendemos constatar a eficácia/ineficácia da utilização de fagos no combate ao desenvolvimento bacteriano. 2.2 CARACTERÍSTICAS DOS FAGOS Os bacteriófagos (fagos), são vírus que infectam e destroem bactérias, replicandose exponencialmente durante esse processo, sem no entanto atacarem outras células ou organismos. Os fagos ocupam todos os habitats onde se podem encontrar os seus hospedeiros. 2 Do ponto de vista estrutural os fagos são constituídos de uma capa proteica no interior da qual se situa o material genético. 1 Informação extraída do Protocolo fornecido pelo projecto Ciência Viva: E quando os antibióticos não funcionam (Página 1) 2 Informação extraída do Protocolo fornecido pelo projecto Ciência Viva: E quando os antibióticos não funcionam (Página 2) 4

São o grupo de organismos mais abundante e versátil existente na Terra. Os fagos co-evoluíram evoluíram com as próprias bactérias. 3 Fig.2 Esquema de um Fago 2.3 FAGOS COMO ALTERNETIVA AOS ANTIBIÓTICOS O uso generalizado e massivo dos antibióticos é apontado como uma causa do desenvolvimento crescente de resistência bacteriana a estes compostos, tornando-os tornando cada vez menos eficazes no combate a doenças. Á medida que as bactérias vão sofrendo mutações, os fagos como são parasitas obrigatórios são obrigados a acompanhar esta evolução bacteriana ao contrário dos antibióticos antibiótic que são substâncias químicas. Host Range e EOP dos d fagos isolados representam o painel de hospedeiros de cada fago e a sua eficiência de plaqueamento, respectivamente. O EOP é dado pela razão entre a concentração do fago numa determinada estirpe e a concentração 4 máxima observada em qualquer estirpe bacteriana. bac 3 Informação extraída do Protocolo fornecido pelo projecto Ciência Viva: E quando os antibióticos não funcionam (Página 2) 4 Informação rmação extraída do Protocolo fornecido pelo projecto Ciência Viva: E quando os antibióticos não funcionam (Página 19) 5

2.4 POR QUE É QUE SE USOU A ÁGUA DO RIO PELHE? O rio Pelhe atravessa a cidade de Vila Nova de Famalicão em várias zonas de indústrias relacionadas com o processamento de carnes. Por vezes ocorrem descargas ilegais de poluentes orgânicos que poderão propiciar o desenvolvimento de bactérias como a E. coli. Como se pretende isolar um fago parasita da E. coli optou-se pela água do rio Pelhe. O isolamento de um fago envolve a utilização de uma estirpe bacteriana específica, que vai funcionar como um hospedeiro, sobre a qual se espalha uma amostra ambiental água do Rio Pelhe. A existência de fagos patogénicos para as bactérias em análise vai levar ao aparecimento de placas de lise, cada uma das quais deverá ser proveniente de um único fago. Fig.3 Rio Pelhe zona dos Moutados (local de recolha da amostra ultilizada). 6

3.O TRABALHO EXPERIMENTAL: Este trabalho será dividido em 4 actividades: A actividade 1 tem como título Preparação de material e meios de cultura e o objectivo da mesma é preparar todo o material necessário para a realização das restantes actividades. A Actividade 2 tem como título: Isolamento e purificação de Escherichia coli de amostras de água e o seu objectivo é recolher amostras de um curso de água escolhido por nós (rio Pelhe na zona dos Moutados), com o intuito de determinar se essa água terá sido contaminada por alguma fonte de poluição orgânica e se ela pode ser utilizada para consumo humano directo. Para recolhermos a amostra de água do meio natural, utilizámos um frasco estéril para posterior análise, cumprindo vários cuidados de recolha e conservação. De seguida, foram feitas diluições da água do rio e, após estas estarem concluídas, 0.1 ml do seu conteúdo dos foi colocado e espalhado em placas com meio TBX que posteriormente ao plaqueamento foram incubadas a 37ºC até se verificar crescimento bacteriano. A etapa seguite foi a contagem das colonias obtidas, para determinar o CFU/ml e finalmente a elaboração de repicagens das colónias verdes entre outras encontradas. A Actividade 3 tem como título: Isolamento e purificação de fagos patogénicos para E. coli e teve como principal objectivo isolar fagos (vírus de bactérias), que são microrganismos que podem ser utilizados para o tratamento de infecções bacterianas, quando as bactérias se revelam resistentes aos antibióticos. Para se proceder ao isolamento de um fago foi necessária a utilização de uma estirpe bacteriana específica, que funcionou como hospedeiro, sobre a qual se espalha a amostra recolhida. A existência de fagos patogénicos para a bactéria em análise leva ao aparecimento de placas de lise, cada uma das quais deverá ser proveniente de um 7

único fago. No entanto, na maior parte dos casos, a sua concentração é tão baixa que é necessário um passo prévio de enriquecimento, de forma a aumentar o seu número. Neste caso, a maior parte das bactérias na amostra deverá ser removida, sendo posteriormente incubada durante um ou mais dias, à temperatura ideal para a bactéria, com nutrientes concentrados e diferentes bactérias hospedeiras. Após a amplificação, a cultura deverá ser plaqueada com cada uma das estirpes bacterianas utilizadas como hospedeira. A Actividade 4 tem como título: Host Range e EOP dos fagos isolados e o seu objectivo foi determinar o painel de hospedeiros que cada fago e a sua eficiência de plaqueamento. Após seguir as etapas necessárias desta actividade plaqueou-se os tubos, contendo o "LB Top" com a bactéria e o fago na respectiva placa de petri e depois da incubação a 37 ºC observou-se qual o fago que atingiu o maior número de estirpes bacterianas, e o que se encontra em maior concentração. 8

4. Actividade 1 Preparação do Material e dos Meios 4.1 Objectivos: Com esta actividade, pretendeu-se proceder à preparação do material e dos meios de cultura e reagentes necessários ao desenrolar das actividades, assim, fez-se a preparação de: - Soro fisiológico, -TBX, - LB Broth, - LB agar, -LB-10x, -LB Top - Tampão de conservação 9

4.2 Resultados: Fig.4 TBX Fig.7.LB Agar Fig.6 Tampão de conservação Fig.5 LB-Broth 10

5. Actividade 2 Isolamento e purificação de E. coli de amostras de águas. 5.1 Objectivos: Com esta actividade, pretende-se determinar se as amostras dos cursos de água, que fomos recolher ao Rio Pelhe, terão sido contaminadas por alguma fonte de poluição orgânica, e se poderá ser consumida directamente pelo Homem. Um outro objectivo desta actividade é calcular os CFU/ml de cada água, ou seja, o número de unidades de colónias formadas por ml da amostra. 11

5.2 Método: O primeiro passo para a realizaçao desta actividade é a recolha de água com um frasco devidamente esterelizado. O frasco só deve ser aberto dentro de água e no sentido da corrente, não deve ser enchido na totalidade e tapado ainda dentro de água. De seguida, devem ser feitas diluições da água do rio até à diluição Fig.8 Rio Pelhe zona dos Moutados (local de recolha da amostra ultilizada). menos quatro. Estas diluições necessitam de 4 tubos de ensaio esterelizados, com 4.5mL de soro cada um; de seguida, colocar no primeiro 0.5mL de água do rio, do primeiro tubo tiram-se 0.5mL de água para o segundo, do segundo 0.5mL para o terceiro e do terceiro 0.5mL para o quarto. Feitas as diluições, o conteúdo dos tubos deve ser pipetado com 0.1mL e colocado e espalhado em placas com meio TBX, devidamente identificadas( este meio permite que as colónias de E.coli apresentem uma tonalidade verde, possibilitando a repicagem). Posteriormente ao plaqueamento as placas, vão a encobar até se verificar crescimento bacteriano. Por fim, devem-se contar as colónias obtidas e calcular o CFU/ml; elaborar repicagens das colónias verdes entre outras encontradas; devem ser feitas até 3 repicagens de cada colónia. Estas repicagens são feitas em meio LB Agar e postas a encubar aquando da sua elaboração até novo crescimento bacteriano. 12

5.3 Resultados: Fig.9: Armazenamento da amostra de água recolhida. Fig.10 Resultado da incubação do meio TBX após plaqueamento com água proveniente do rio pelle em diluições ate 10-4 Fig.11. Placas em meio TBX com água proveniente do rio Pelhe em diluições 10-1 com colonia verdes visíveis indicadoras da presença de E.Coli. Fig.12 Placa com meio LB-A: Primeira repicagem de colónia de cor verde (E.coli). 13

5.4 Interpretação dos resultados: Tal como é possível observar na figura 10 nas placas em meio TBX com água proveniente do rio Pelhe em diluições até 10-4, detectámos a presença de colónias amarelas em todas as placas e colónias verdes na placa de diluição 10-4, ou seja, colónias de E. coli. Com as diluições, vimos que o crescimento bacteriano se deu em todas as placas tendo proliferado as verdes na diluição 10-1 o que demonstra que a água continha E. coli, mas à medida que a diluição vai aumentando o número de colónias diminui, pois a quantidade de bactérias vai diminuindo. Posto isto, vemos a diluição da amostra como uma forma de purificar a mesma. Na fig.12, observa-se a primeira repicagem elaborada a partir das colónias de cor verde, feita com o objectivo de obter colónias de E. coli individualizadas. 5.5 Conclusão Os resultados revelaram-nos que o local onde recolhemos a água não deve ser utilizado como fonte de abastecimento de água, pois contém E.coli. A presença destes na água indica-nos que esta foi contaminada por matéria fecal de natureza animal ou humana. Tal permitiu-nos inferir que, na zona do matadouro Moutados, o Rio Fig.13 Rio Pelhe zona dos Moutados (local de recolha da amostra ultilizada). Pelhe é vítima de poluição orgânica, constituindo um problema para a saúde pública. Considera-se uma água própria para consumo quando esta não tem presentes qualquer estirpe de E.coli, pois apesar de esta não ser patogénica para o Homem coexiste simultaneamente com bactérias patogénicas, logo a existência de E.coli marca a presença de bactérias patogénicas, daí a sua presença aconselhável na água para 14

consumo ser zero. O objectivo calcular os CFU/mL de cada água, ou seja, o número de unidades de colónias formadas por ml da amostra não foi cumprido. São várias as razões para contaminação da água com E.coli, sendo as mais perigosas e prejudiciais as fontes difusas ou pontuais, isto é, descargas dos sistemas de tratamento de águas residuais, tanques sépticos, enxurradas ou ainda populações de animais naturais. 15

6. Actividade 3 Isolamento e purificação de fagos de E. coli. 6.1 Objectivo O objectivo desta actividade é isolar fagos patogénicos para as estirpes de E. coli isoladas a partir das águas do Rio Pelhe e para a estirpe E. coli-b, previamente fornecida. Uma amostra pode possuir fagos numa concentração suficiente para ser plaqueada directamente, ou então, os fagos podem estar em concentrações elevadas, sendo necessário diluir a amostra antes de plaquear. No entanto, na maior parte dos casos, a 16

sua concentração é tão baixa que é necessário um passo prévio de enriquecimento, de forma a aumentar o seu número. Neste caso, a maior parte das bactérias na amostra deverá ser removida, sendo posteriormente incubada durante um ou mais dias, à temperatura ideal para a bactéria, com nutrientes concentrados e diferentes bactérias hospedeiras. Após a amplificação, será plaqueada com cada uma das estirpes bacterianas utilizadas como hospedeira. 6.2 Método No dia anterior à efectivação do isolamento de fagos, fizemos uma cultura nocturna da E.coli fornecida em 5 ml de LB Broth e colocámos a incubar 37 ºC. Fizemos uma cultura diária em 5 ml de LB Broth, a partir de uma diluição 1/100 da cultura nocturna e incubar durante 3 horas e a amplificação dos fagos na amostra de água. Para um volume final de 40 ml, mais uma vez colocámos a incubar, durante 24h. No dia seguinte, enchemos tubos de ensaio estéreis com 3 ml de LB Top e deixámos a arrefecer em banho-maria a 55 ºC. Fizemos uma cultura líquida com a E. coli B e colocámos a incubar durante 3 hora; efectuámos diluições seriadas do sobrenadante (até -8) em tampão de conservação; adicionámos a cada tubo de LB Top 0,1 ml de cultura bacteriana em fase exponencial de crescimento e posteriormente adicionámos 0,1 ml da respectiva diluição da amostra; plaquear os tubos contendo o LB Top com a bactéria e o fago na respectiva placa de petri. Após as placas terem incubado, no dia seguinte, enchemos tubos de ensaio estéreis com 3 ml de LB Top e deixámos a arrefecer em banho-maria a 55 ºC (durante pelo menos 30 minutos); Verificar a diluição onde se obtiveram placas de lise e proceder à purificação das mesmas. Após o período de incubação, fizemos diluições seriadas das diferentes amostras de fagos (até -8). Após 24 h de incubação, verificar a diluição em que se observam placas de lise individualizadas; repetimos os passos 19 a 21 do protocolo mais duas vezes, até que todas as placas de lise, presentes na placa ficassem uniformes; retirámos 3 a 4 placas de lise, repetindo os passos 19.2 a 21. 17

6.3 Resultados Fig.14 Placas de petri contendo placas de lise em meio de LB-A Placa de lise pequena (P1) Placa de lise grande (P2) 18

Fig.15 Placas de petri contendo placas de lise pequenas e grandes em meio de LB-A (diluição de 10-6 ) Fig.16. Placa de petri em diluição 10-3, resultante da placa de lise grande (P2) Fig.17 Placa de petri em diluição 10-4, resultante da placa de lise grande (P1) 6.4 Interpretação dos resultados Oservando as placas de petri em meio LB-A das diferentes diluições (fig 14), verificámos que estas continham placas de lise de diferentes dimensões, as quais designámos de grandes (P2) e pequenas (P1). Seleccionámos a placa de diluição 10-6 pelo facto de nesta as placas de lise se encontrarem com uma melhor visibilidade (em algumas das placas de petri não era possível garantir a existêcia de placas de lise). Na fig. 16, onde se encontram as placas de lise obtidas a partir da placa de lise grande seleccionada (P2), observa-se uma grande abundância de placas de lise em relação à figura 17 onde se encontavam as placas de lise obtidas a partir da placa de lise pequena seleccionada (P1). 19

6.5 Conclusão Os fagos possuem especificidade para determinadas estirpes bacterianas. Como tal, ao utilizarmos uma estirpe bacteriana especifica, saberemos qual o fago que possui especificidade para esta estirpe. Desta forma, as bactérias vão estar impedidas de crescer verificando-se assim placas de lise. Fig.18 Placa de petri no equipamento electrónico contador de colónias 20

7. Actividade 4 Host Range do fago isolado 7.1 Objectivos O objectivo desta actividade é verificar se o fago isolado tem especificidade para as estirpes de bactérias isoladas das águas do Rio Pelhe e inferir assim se pertencem à mesma estirpe da E. coli fornecida pelo Ciência Viva 21

7.2 Método Fizemos uma cultura líquida com as bactérias em teste e pusemo-las a incubar a 37 ºC até atingirem metade da fase exponencial de crescimento. De seguida, enchemos tubos de ensaio estéreis com "LB Top" e deixámos arrefecer em banhomaria a 55 ºC. Posteriormente, fizemos diluições seriadas 1/10 dos diferentes fagos em Tampão de conservação e marcámos as placas de petri com o código das bactérias, dos fagos e respectivas diluições. De seguida, adicionámos a cada tubo de "LB Top" 0,1 ml de cultura bacteriana em fase exponencial de crescimento e depois a diluição dos fagos. Em condições de assépcia, plaqueámos os tubos contendo o "LB Top" com a bactéria e o fago na respectiva placa de petri e consequente incubação. Depois, vimos qual era o fago que atingia o maior número de estirpes bacterianas, e o que se encontrava em maior concentração. 7.3 Resultados Placas de E.coli isoladas na água do rio Pelhe mais fagos Diluições Existência de placas de lise 10-1 X 10-2 10-3 X 10-4 X 10-5 10-6 X 10-7 X 10-8 X Fig.19 Placas de E.coli isoladas na água do rio Pelhe mais fagos diluição de 10-1 10-9 10-10 X 22

Placas de E.coli fornecidas pelo Ciência Viva mais fagos Diluições Existência de placas de lise 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 Fig.20 Placas de E.coli isoladas na água do rio Pelhe mais fagos diluição de 10-1 10-10 7.4 Interpretação dos resultados/conclusão: Verificámos que os fagos isolados eram específicos para a estirpe de E.coli fornecida pelo Ciência Viva, dado que havia placas de lise em todas as diluições. Por outro lado, o mesmo não aconteceu nas placas que continham E.coli isolada da água do rio Pelhe, havendo apenas três placas de lise em dez. Pudemos, assim, inferir que as bactérias eram de estirpes diferentes. Por outro lado, as nossas placas foram contaminadas por outras espécies de bactérias, que não foram afectadas pelos fagos, apenas as colónias de E.coli o foram. Isto comprova a especificidade dos fagos 23

8. CONCLUSÕES FINAIS Todo o trabalho desenvolvido teve como finalidade responder à pergunta inicial: E Quando os Antibióticos Não Funcionam? Quando estamos infectados por bactérias é-nos administrado um certo antibiótico, específico para o combate das supraditas bactérias. No entanto, as bactérias vão adquirindo resistência a essas substâncias. Com este trabalho, analisámos uma alternativa aos antibióticos: os fagos. Fig.21- Placa de petri observada em contador de colónias electrónico Os fagos, muito abundantes em ambientes aquáticos, podem ser utilizados, tal como os antibióticos, no combate a doenças de etiologia bacteriana: fagoterapia. Para tal, devem ser estudados os fagos capazes de combater certas bactérias de interesse com elevado EOP, assim como um reduzido Host Range. Uma das vantagens do uso de fagos é que estes não possuem substâncias químicas potencialmente perigosas, ao contrário dos antibióticos. No entanto, tal como estas substâncias, os fagos possuem uma desvantagem: quando usados massivamente, as bactérias podem aumentar a resistência à contaminação por eles provocada. O uso de várias estirpes de fagos com Host Range s diferentes permitem aos fagos o tratamento de infecções bacterianas múltiplas, quer em seres vivos como em cursos de água. Da realização da actividade podemos também concluir que o rio Pelhe possui contaminação microbiológica nomeadamente devido à presença de E.coli. Contudo pelo facto de o número de colónias desenvolvidas ter sido reduzido podemos afirmar que a contaminação embora seja diminuta impossibilita o consumo de água. 24

Da aplicação dos fagos isolados a partir da amostra de água do rio Pelhe sobre estirpe de E.coli B fornecido pelo Projecto Ciência Viva e sobre a estirpe de E.coli presente no rio Pelhe, podemos concluir, a partir dos dados obtidos na última actividade, que podemos estar perante estirpes de bactérias diferentes. Isto porque a eficiência de plaqueamento dos fagos sobre as amostras não foi igual demonstrando que os fagos têm tendência a apresentar especificidade na sua actuação. 25

9. Anexos Fig.22-Elementos do grupo a trabalhar na hote Fig. 23- Placas de petri com o conteúdo elaborado durante uma das actividades a serem colocadas na estufa a incubar a 37ºC 9.1 Cuidados a ter durante a elaboração da experiência A esterilização do material de vidro deve ser feita numa estufa ou forno a 180 ºC durante uma hora. Os tubos de ensaio devem ter tampa de metal ou então ser fechados com folha de alumínio para evitar contaminações e só depois esterilizados na 26

estufa. As pipetas de vidro devem ser colocadas em recipientes de vidro ou de metal fechados com papel de alumínio ou agrupados e embalados em pacotes de papel. Os meios de cultura líquidos devem ser esterilizados em autoclave durante 15 minutos a 1 atmosfera. Caso não haja acesso a uma autoclave, os meios de cultura podem ser esterilizados por ebulição numa estufa ou num forno a 180 C durante 2 horas. No entanto, esta ebulição não irá ter como resultado a esterilidade completa, devendo, contudo, ser suficiente para as actividades propostas. BIBLIOGRAFIA http://www.cienciaviva.pt/rede/oceanos/2desafio/fagos. pdf http://pt.wikipedia.org/wiki/fago http://pt.wikipedia.org/wiki/antibi%c3%b3tico http://olhares.aeiou.pt/rio_pelhe_devesa_2_foto256838 8.html CARRAJOLA, Cristina; CASTRO, Maria José; HILÁRIO, Teresa, (2009); planeta com vida biologia 12ºano, 1º edição, santillana constância, Carnaxide; 27