Metabolismo e Endocrinologia Teórica-Pratica: 1 Tema: 1.Enzimologia 1.1 Noções de termodinâmica 1.2 Cinética 1.3 Inibição 2. Tópicos de resposta para a primeira teórico-prática Data: 30.03.2011 1 ENZIMOLOGIA 1.1 NOÇÕES TEÓRICAS A enzimologia é um ramo da bioquímica que estuda as reacções enzimáticas. As enzimas são um grupo de substâncias orgânicas de natureza normalmente proteica, com actividade intra ou extracelular que têm funções catalisadoras, catalisando reações químicas que, sem a sua presença, dificilmente aconteceriam mesmo em condições biologicamente favoráveis. Isto é, baixam a energia de activação necessária para que se dê uma reação química, resultando no aumento da velocidade da reação e possibilitando o metabolismo dos seres vivos. 1.1.1 NOÇÕES DE TERMODINÂMICA A energia livre de um sistema, G, depende da entalpia, H, da entropia, S, e da temperatura do sistema. Numa reação a temperatura, T, constante, a variação de energia livre de Gibbs, ΔG, está associada à variação da: Entalpia, ΔH: calor libertado/absorvido durante a reação. Reflete o tipo e número de ligações e interações quebradas e formadas; o Se ΔH<0 há absorção de calor e a reação diz-se endotérmica; o Se ΔH>0 há libertação de calor e a reação diz-se exotérmica; Entropia, ΔS: variação da desordem do sistema. Se ΔS>0 há aumento da desordem. A entropia dos sistemas tende sempre a aumentar. ΔG é uma medida da energia disponível pelo sistema para a realização de trabalho, aproxima-se do zero quando as reações tendem para o equilíbrio e prediz se uma reação é espontânea. É independente do percurso da transformação, ou seja, é independente do mecanismo molecular e não permite inferir sobre a velocidade de uma reação. Se ΔG<0, a reação ocorre espontaneamente; 1
Se ΔG>0, a reação não ocorre espontaneamente; Se ΔG=0, a reação encontra-se em equilíbrio; Muitas das reações fundamentais do metabolismo celular, como a síntese de proteínas e ácidos nucleicos, estão associadas a um ΔG positivo. Para contornar este facto e tornar as reações termodinamicamente favoráveis as células recorrem ao acoplamento de reações: ao acoplar uma reação desfavorável a uma reação com ΔG negativo, como a hidrólise de ATP, consegue-se que o ΔG global (ΔG de reações consecutivas somam-se) seja negativo e, portanto, que o processo global seja espontâneo. A energia livre de uma reação também se pode relacionar com a sua energia livre padrão, ΔG 0, e o quociente de reação, Q: R: constante dos gases ideais (R=8.314 J mol -1 K -1 ; R=1.987 cal mol -1 K -1 ); T: temperatura (Kelvin); Q: quociente de reação Ou de outra forma, dada uma reação ΔG 0 : energia livre padrão. Energia livre determinada a ph=0, T=25 C e em equilíbrio químico. Em equilíbrio Q=K eq e ΔG=0, pelo que Quando K eq >>1, [P]>>[R] e ΔG 0 é bastante negativo. Contrariamente, para K eq <<1, [P]<<[R], a reação tende a ser completa e ΔG 0 é bastante positivo. ΔG é uma medida da diferença de energia entre os produtos e os reagentes de uma reação. No entanto, para que ocorra a transformação dos reagentes em produtos é necessário quebrar ligações e interações existentes entre as moléculas e criar outras novas, passando-se por um estado de transição que está associado a uma energia Ilustração 1 - Ação das enzimas numa reação. 2
livre superior à dos reagentes. Essa energia, denominada energia de ativação, ΔG*, pode ser diminuída pela ação de enzimas. O centro ativo de uma enzima fornece uma superfície que complementa o estado de transição de uma reação na sua estereoquímica, carga e polaridade, pelo que a ligação enzimasubstrato é exergónica. A energia libertada baixa a energia de ativação da reação e permite que esta ocorra mais rapidamente. Entre as características das enzimas podemos destacar: São todas de natureza proteica, embora possam conter uma parte não proteica o cofator; Baixam a energia do estado de transição, diminuindo a energia de ativação necessária a uma reação aceleram a sua velocidade (velocidade até 10 16 x superior!); Não modificam a constante de equilíbrio K; Encontram-se intactas no final da reação; Têm elevada especificidade; A sua atividade pode ser sujeita a controlo. 1.1.2 CINÉTICA A reação entre uma enzima (E) e um substrato (S) de modo a dar um produto (P) pode ser representada por: (Numa fase inicial, assume-se que a reação inversa à formação do produto P é negligenciável porque se verifica [P]~0 ) No estado de equilíbrio assume-se que não há formação de produto, pelo que e. No estado estacionário assume-se que [ES] é constante, logo. A velocidade a que uma reação enzimática ocorre é, em geral, seguida através da quantidade de produto formado por unidade de tempo,. Numa fase inicial, a variação de [P] em função do tempo é linear, pelo que se pode calcular a velocidade inicial da reação (v 0 ). Já a variação da velocidade com a concentração de substrato pode ser estimada a partir da equação de Michaelis-Menten, que assume algumas condições: Formação de um complexo ES enzima substrato; Equilíbrio rápido entre o complexo ES e a enzima livre; A dissociação de ES em E+P é mais lenta que a formação do complexo ES a partir de E+S e que a reação inversa, a dissociação de ES para voltar a dar E+S. Equação de Michaelis-Menten: Velocidade máxima: 3
V max é a velocidade máxima da reacção quando há saturação da concentração do substrato. É uma constante e representa um valor teórico pois nunca é alcançada na realidade implicaria que todas as enzimas estivessem ligadas ao substrato. Constante de Michaelis: K m, constante de Michaelis, é a constante de equilíbrio para a dissociação do complexo ES e é definida como a concentração de substrato quando a velocidade de reação é metade da velocidade máxima. É característica de cada enzima e não depende da concentração do substrato. É ainda uma medida da afinidade da enzima em relação ao seu substrato, sendo 1/K m o valor dessa medida. Deste modo, quanto menor for o valor de K m maior é a afinidade enzima-substrato e menor é a quantidade de substrato necessária para atingir metade da velocidade máxima. Pode ainda definir-se um último parâmetro, o turnover number, que se representa por K cat e é uma medida da actividade catalítica máxima de uma enzima. O K cat é definido como o número de moléculas de substrato que são convertidas em produto por molécula de enzima e unidade de tempo quando a enzima está saturada de substrato. O quociente dá um índice da eficiência catalítica de uma enzima. Os gráficos seguintes representam a curva de Michaelis para diferentes enzimas e para diferentes concentrações de substrato, evidenciando os valores relativos de K m para cada caso. Ilustração 2 - Curvas de Michaelis. A interpretação da cinética enzimática de Michaelis não estabelece uma relação linear entre as grandezas em estudo, sendo mais difícil de manipular sem recurso a softwares informáticos. Na cinética de Lineweaver-Burk representam-se as variáveis 1/v e 1/[S], em vez de v e [S], obtendo-se uma relação linear mais fácil de interpretar. 4
Equação de Lineweaver-Burk: A partir desta equação e da sua representação gráfica é possível retirar facilmente os valores de K m e v max : Quando a reta corta o eixo das ordenadas retira-se o valor de v max : Quando a reta corta o eixo das abcissas retira-se o valor de K m : A velocidade das reações é afetada por uma série de fatores, tais como a temperatura e o ph do meio, ou a presença de ativadores ou inibidores. A atividade enzimática tende a aumentar com a elevação da temperatura de forma exponencial, até que se atinge um determinado valor de T a que a enzima desnatura. A relação da velocidade com o ph é um pouco mais complexa, na medida que o ph do meio influencia vários aspetos das enzimas, desde o seu estado de ionização à ionização dos aminoácidos do centro ativo e, em casos extremos, à desnaturação. Cada enzima tem assim uma gama de valores de T e ph para os quais a sua atividade é otimizada. Ilustração 3 - Efeito da temperatura e do ph na atividade de uma enzima. 1.1.3 INIBIÇÃO Inibidores são compostos que, ao se ligarem a uma enzima, reduzem a sua atividade e a velocidade da reação catalisada. Os chamados inibidores reversíveis não provocam alterações irreversíveis nas enzimas em que atuam. Existem diversos tipos de inibidores que provocam a diminuição da velocidade da reação atuando de modo diferente sobre a enzima: Inibidores competitivos: são quimicamente semelhantes ao substrato e ligam-se ao centro activo das enzimas impedindo a ligação enzima-substrato. Têm semelhanças 5
estruturais com o substrato para se conseguirem associar mas não reagem com a enzima e, portanto, não dão origem a nenhum produto. Uma inibição deste tipo diminui à medida que se aumenta a concentração de Ilustração 4 - Inibidores competitivos. substrato para concentrações mais elevadas é mais provável que a enzima se ligue ao substrato que ao inibidor, mantendo-se assim o valor de v max. Apenas K m é alterado, verificando-se o seu aumento; Ilustração 5 - Efeitos de um inibidor competitivo. Inibidores não competitivos: ligamse a locais da enzima que não o seu centro ativo antes ou depois da formação do complexo ES, pelo que podem formar-se três tipos de complexos: ES, ESI (enzimasubstrato-inibidor) ou EI. Como continuam a permitir a ligação do substrato o valor de K m mantém-se inalterado. No entanto, como apenas o complexo ES é funcional verifica-se a diminuição de v max ; Ilustração 6 - Inibidores não competitivos. 6
Ilustração 7 - Efeitos de um inibidor não competitivo. Inibidores anti-competitivos: ligamse a locais da enzima que não o seu centro ativo apenas após a formação do complexo ES. Há a formação de dois complexos, ES e ESI, sendo o complexo ES o único com atividade catalítica. Como o inibidor apenas se liga ao complexo ES, à medida que a concentração de substrato aumenta a inibição é mais acentuada. Verifica-se a diminuição do K m e de v max na mesma proporção. Ilustração 8 - Inibidores anti competitivos. Ilustração 9 - Efeitos de um inibidor anti competitivo. O modo mais eficaz de interromper uma via metabólica é deixar de sintetizar as enzimas que nela intervêm. No entanto, apesar de eficiente, este método é lento e não pode ser aplicado em todas as situações. Para interromper rapidamente uma via é mais eficiente inibir as suas enzimas, nomeadamente as suas enzimas-chave. Estas enzimas catalisam uma reação apenas no seu sentido direto ou inverso, ao contrário da maioria das enzimas de uma via, que catalisam reações em ambos os sentidos. Às enzimas que têm maior efeito regulador numa determinada via chamamos enzimas reguladoras. 7
A regulação da atividade das enzimas pode ser feita recorrendo-se a diversos mecanismos: A regulação alostérica permite controlar o nível de atividade de uma enzima através de ligações reversíveis e não-covalentes de componentes reguladores, os chamados efetores. Estes podem ser positivos ou negativos e atuam sobre o Km e Vmax. O substrato, por exemplo, pode ser um efetor homotrópico (molécula ligante e moduladora são a mesma substrato) e levar a fenómenos de cooperatividade (a sua presença aumenta a afinidade enzima-substrato e é caracterizado por uma cinética sigmoidal); já o produto pode ser um efetor heterotrópico (molécula ligante diferente da moduladora substrato e produto, respetivamente) e atuar sobre as enzimas iniciais de uma via metabólica controlo por retroalimentação; A regulação por modificação covalente consiste em adicionar ou remover grupos fosfato, metil, adenil, uracil, entre outros, à enzima. A fosforilação é a forma mais comum de regulação e dá-se principalmente em resíduos de serina (Ser), treonina (Thr) e tirosina (Tyr). Dá-se com recurso a ATP e é catalisada por cinases, sendo a desfosforilação catalisada por fosforilases. Dependo da enzima, a forma fosfatada pode ser ativa ou inativa e a poli-fosforilação (fosforilação de diversos resíduos) confere um caráter regulador muito preciso; A indução ou repressão da síntese de enzimas permite variar a sua concentração e estimular ou retardar uma via. É um mecanismo lento e está reservado para condições fisiológicas não habituais, como o aumento dos níveis de insulina em resposta a uma glicémia elevada. A coordenação das respostas dos diversos órgãos e tecidos ao mesmo sinal que permite a reação adequada do organismo como um todo é obtida por ação de hormonas. Estas atuam apenas nos tecidos para os quais são específicas e têm uma ação quer ao nível da expressão genética (inibindo ou estimulando a síntese de uma enzima), quer da atividade enzimática (fosforilações e desfosforilações). Evento regulador Efector típico Resultados Tempo necessário para a alteração Inibição pelo substrato Substrato Altera Vo Imediato Inibição pelo produto Produto Altera Km e/ou Vmax Imediato Controlo alostérico Produto Final Altera Km e/ou Vmax Imediato Modificação covalente Outra enzima Altera Km e/ou Vmax Imediato a minutos Síntese e degradação da enzima Hormona ou metabolito Altera a quantidade da enzima Tabela 1 - Tipos de regulação enzimática. Horas a dias As estratégias de regulação já mencionadas fazem parte de mecanismos de controlo do organismo e constituem processos, na grande maioria das vezes, reversíveis. Em 8
farmocologia, por outro lado, induzem-se frequentemente modificações irreversíveis nos reagentes ou enzimas. As interações entre grupos do centro ativo de uma enzima e um reagente ditam a reatividade do sistema, estando a especificidade enzima-substrato associada a uma base molecular. Deste modo, a modificação de grupos nos reagentes ou a alteração/adição/remoção de uma ligação pode influenciar a correta associação ou dissociação do substrato. Por exemplo, se uma modificação no substrato levar a que este estabeleça uma ligação covalente forte quando se encontra no centro ativo da enzima, então a dissociação do complexo ES pode ser impedida e a enzima deixa de estar funcional, ficando inibida irreversivelmente. 1.2 1ª AULA TEÓRICO PRATICA ENZIMOLOGIA 1. Considere a seguinte interconversão metabólica que ocorre na glicólise: Frutose-6-fosfato Glicose-6-fosfato K'eq = 1,97 a) Calcule G ' (em kj mol -1 ) para esta reação, assumindo uma temperatura de 25ºC. Aplicando a fórmula: Obtém-se b) Se as concentrações de frutose-6-fosfato e glicose-6-fosfato forem de 1,5 M e 0,5 M, respetivamente, qual será o valor de G? Novamente pela fórmula: Obtendo-se (Reação favorável de ocorrer no sentido direto) c) Porque são G ' e G diferentes? 1. Condições de equilíbrio em termodinâmica: 25 C, 1 atm, concentração de produtos e reagentes iniciais de 1 molar; 2. Em G ' as concentrações são todas de 1 molar, menos a quantidade de hidrogeniões que é de 10-7 e o ph é, portanto, 7. 3. Nesta reação temos produtos e reagentes: H 3 O +, H -, e a solução teria ph=0, pois havia 1M de hidrogeniões (=10 0 M ph=0) 9
Outras considerações: 1. Se G<0 então vai haver formação de produtos porque a reação é favorável pois a energia de Gibbs vai baixar e consequentemente o sistema vai ficar mais estável (aumenta a entropia e diminui a entalpia [energia interna do sistema]). 2. Para aumentar a entalpia do sistema temos de realizar trabalho sobre o mesmo, G>0. 3. Pela seguinte equação também se pode verificar como G ' e G se relacionam: = Frutose-6-fosfato Glicose-6-fosfato (reação de gluconeogenese) As enzimas não alteram o facto de a reação ser favorável ou não. Vão alterar a velocidade com que esta ocorre. Regulação de vias metabólicas: Inibição ou ativação de enzimas Regulação covalente Regulação alostérica Regulação competitiva/ não competitiva Regulação genética Podemos aumentar a concentração do reagente Podemos diminuir a concentração de produto Através da reação termodinamicamente desfavorável, o que acontece é que o destino metabólico da glicose é: fígado (armazena sob a forma de glicogénio, não se quer que vá para a glicólise). No fígado, quando os reservatórios de glicogénio estão cheios, vai usar-se então a glicólise. 2. Determine a concentração mínima de malato necessária para que a reação catalisada pela fumarase (Malato Fumarato + H 2 O) ocorra no sentido direto, a ph 7,0 e 25 C, se a concentração de fumarato for de 1 mm. G<0 3. A reação catalisada pela aldolase tem um G 0 ' = 5,7 Kcal/mol. Qual o mecanismo utilizado pelas células pera direcionar a recção no sentido da clivagem aldólica? A reação passa a ocorrer caso se verifique uma quantidade superior de reagente em relação ao produto; Na presença de muito produto G 0 '>0; Na presença de muito reagente G 0 '<0. 10
4. Diga de que forma a presença de uma enzima altera as características termodinâmicas de uma reação. Baixam a energia do estado de transição, diminuindo a energia de activação necessária a uma reação - aceleram a sua velocidade (velocidade até 10 16 x superior!); 5. Explique o significado reacional de estado de equilíbrio e de estado estacionário da reação de transformação do substrato S em produto P na presença de uma enzima. Constantes: Velocidade máxima Afinidade substrato com a enzima (quanto mais baixo for Km, maior será a afinidade) Cálculo: K 2 Condicionantes: 0 (Não há formação de produto) Fase inicial (Km declive no ponto zero Estado de equilíbrio) No estado estacionário complexo ES mantem-se constante e por isso, 6. A partir da Tabela 1A, represente graficamente a variação da velocidade inicial (Vo) da reação em função da concentração de substrato [S] na situação (a). 11
7. A partir da Tabela 1B, represente graficamente a linearização de Lineweaver- Burk para estimar os valores de Vmax e KM para as situações experimentais (a), (b) e (c). 12
8. Atendendo aos gráficos obtidos e aos valores de Vmax e KM estimados, caracterize o tipo de inibição em causa nas situações (b) e (c). Para as rectas de ajuste, : e Desprezando as diferenças entre e e entre e por não serem significativas, conclui-se que em b há inibição competitiva (mesma V max e maior K m ) e em c há inibição não competitiva (mesmo K m e menor V max ). 9. Faça uma representação gráfica hipotética, da variação da velocidade inicial em função da concentração de [S] para a mesma enzima E, a uma temperatura de 37ºC, que é a temperatura óptima da enzima E. (Consultar gráfico na parte teórica) 13
10. A desidrogenase lática (LDH) é uma enzima expressa nos organismos vertebrados sob a forma de 5 isoenzimas (Tabela 2), as quais se podem separar por electroforese (Figura 1), tendo utilidade clínica no diagnóstico diferencial de determinadas patologias. Sabendo que o perfil electroforético B corresponde a um indivíduo saudável, qual o perfil electroforético correspondente a um doente com enfarte agudo do miocárdio? Justifique. Para manter a glicose é preciso livrar o NADH convertendo piruvato em lactato, gastando NADH; O coração quase não consome glicose, capta lactato que transforma em piruvato e faz com que o piruvato entre no ciclo de krebs, por isso também usa a desidrogenase láctica; A, C doença lesão numa célula células morrem e libertam a enzima; Ou pode ter sido erro na colheita. Esta pode ter sido efetuada muito rapidamente havendo por isso destruição de células. 14