ALTERAÇÕES MOLECULARES COMO CAUSA DE DOENÇAS GENÉTICAS Profa. Dra. Vanessa Silveira
Genoma Humano - DNA Variações genéticas Alterações Erros de replicação do DNA Erros durante a divisão celular Agentes externos Mutagênicos químicos Vírus
Alterações genéticas - mutações Ø Somáticas: não transmissíveis Ø Germinativas: herdáveis Tecido somático Setor mutante Tecido germinativo Progênie normal Progênie normal Setor mutante Progênie com mutação
1. Marcadores genéticos Qualquer característica situada na mesma região em um par de cromossomos homólogos que permite distinguir um homólogo do outro Ø Um locus que tenha alelos facilmente classificáveis e que possa ser usado em estudos genéticos. Ø Pode ser um gene ou um sítio de enzima de restrição, bem como qualquer característica do DNA que permita que versões diferentes de um locus (ou seu produto) sejam distintas umas das outras e seguidas nas famílias Variabilidade genética
Variabilidade genética q Modificação no material genético de um organismo q Alteração fenotípica? q Fonte da variabilidade q Variações no genoma - novos alelos q Matéria prima para o processo de evolução q Recombinação: Rearranjo da variabilidade Desenvolvimento de marcadores genéticos
Marcadores moleculares - Definição q Sequências de DNA herdáveis e distintas q São baseados na ocorrência natural de polimorfismos de DNA q Adições/deleções de poucas bases q Substituições, inserções q Deleção/Duplicação q Repetições I. Polimórficos Informativos II. Herança co-dominante III. Distribuídos aleatoriamente pelo genoma IV. Fácil detecção V. Reprodutibilidade
2. Tipos de marcadores moleculares Mutações Polimorfismos genéticos SSLP SNP RFLP CNV Microssatélite STR Minissatélite VNTR
3. Identificação de genes de doenças humanas
Perspectiva histórica Linha do Tempo 1865 Gregor Mendel, Leis da hereditariedade 1866 Johann Miescher, Purificação do DNA 1949 1953 Anemia Falciforme, Mutação Watson and Crick, Estrutura do DNA 1970 Tecnologia do DNA Recombinante 1977 Sequenciamento de DNA 1985 Amplificação In Vitro do DNA (PCR) 2001 Projeto Genoma Humano
Evolução histórica: 1953: Watson e Crick - Estrutura do DNA 1956: Estabelecimento do número de cromossomos A genética especialidade clínica; 1959: Síndrome de Down. Anormalidades cromossômicas Translocação, mosaicos, triploidias e microdeleções.
Evolução Histórica: q 1960-1973: Cromossomo Filadélfia q Técnicas de identificação de cromossomos q Citogenética-molecular q Mapeamento citogenético q Hibridização in situ Técnicas de mapeamento: 1968: Gene do Daltonismo 1980: Análise de células somáticas através do uso de sondas 1983-1993: Mapeamento do 1º gene - Doença de Huntington
Mapeamento gênico Mapa gênico humano 30.000 genes nos 24 cromossomos Identificação de genes responsáveis por doenças humanas Aplicação ao diagnóstico a aconselhamento genético Mapeamento genético Mapeamento físico Análise de ligação Reflexo da distância física
Era Pós Genoma
Métodos de mapeamento Método Híbridos de células somáticas (roedor/ humana) Objetivo Localização no cromossomo Mapeamento de híbrido de radiação Localização regional Análise de dosagem gênica Hidridização in situ com fluorescência (FISH) Cromossomo X e regional Cromossomo/regional dentro de uma banda FISH de fibra de cromatina/restrição de longo alcance Clonagem em cromossomos artificiais/ bactérias Reação em cadeia da polimerase (PCR) Sequenciamento de DNA Mapeamento fino da região gênica Clonagem gênica (fragmentos grandes ou médios e pequenos) Clonagem e mapeamento gênico Sequência de nucleotídeos
Ø Cromatografia Líquida desnaturante Ø Sequenciamento Indivíduo com alteração
4. Diagnóstico de doenças genéticas
Diagnóstico molecular q q Detecção de alterações no DNA ou RNA Viabilizar o diagnóstico, detecção, sub-classificação, prognóstico, etc q q q Expansão do conhecimento científico Identificação de indivíduos e determinação de risco de doenças específicas Diagnóstico molecular - Revolução
Base do diagnóstico molecular Causa Mecanismo (Patogênese) Alterações estruturais Consequências funcionais
Impacto Hematologia Farmacogenômica Oncologia Marcadores moleculares Identificação Indivíduos Doenças genéticas
Entendimento da patogênese molecular das doenças humanas permite o uso efetivos dos ensais moleculares q Diagnóstico q Prognóstico q Terapia: predição de resposta terapêutica q Mutações que diminuem a eficiência do tratamento em cancêr de pulmão por exemplo (k-ras, p53)
Hemoglobinopatias Ø Anemia Falciforme Ø Talassemias Ø Medicina Forense Ø Mapeamento genético Ø Medicina clínica Ø Interferência na expressão gênica Ø eqtl - Expression quantitative trait loci Ø Variantes genéticas que interferem com a expressão de genes associados a doenças complexas Ø Ex. Obesidade
Anemia Falciforme Hemáceas normais Causa: Substituição de um único nucleotídeo Hemáceas falciformes cadeia B da hemoglobina Linus Pauling Determinou o início do diagnóstico molecular
Genótipos: Hb A Hb A Hemáceas normais Hb S Hb S Anemia servera; hemáceas em forma de foice Hb A Hb S Não ocorre anemia, mas hemáceas adquirem forma de foice sob baixas concentrações de oxigênio q Alelos: Hb A, Hb S q Códon CAG- CTG Hemáceas normais Hemáceas falciformes
Hemoglobinopatias Ø Variantes Ø S, Anemia falciforme Ø C, D Los Angeles Ø Talassemias Ø Alfa Ø Beta
Desordens neuromusculares Ø Distrofia Muscular de Duchene Ø Distrofia de Becker Ø Atrofia muscular espinhal (SMN1) Ø Deteção de portadores Procedimento cirúrgico Teste para aberrações cromossômicas Distrofia Muscular de Duchene
Microssatélites X Desordens de repetição Doença de Huntington Autossômica dominante Acúmulo de Repetições..CAG.. Huntington Penetrância influenciada pela idade Normal
Desordens genéticas Ø Desordens trombóticas Ø Mutações Ø Fator de Leyden Ø Fator II Ø PCR Ø Sequenciamento Ø Demais desordens Ø Fibrose cística: 4 mutações Ø Doença de Tay Sachs Ø Síndrome do X Frágil Ø Síndrome de Frederich (Ataxia) Ø Distrofia muscular miotônica
Oncologia q Diagnóstico q Estratificação de grupos de risco q Seguimento terapêutico q Amplificação MYCN Neuroblastoma q Translocações q t9;22 q Síndrome mielodisplásica q t4;11 q Leucemia mielóide crônica q t12;21 q Leucemia linfóide aguda q Doença residual mínima q Marcadores de rearranjos de imunoglobulina q Identificação clonal
Leucemia mielóide crônica Cromossomo filadélfia- Ph1 ü Tirosino quinase 46, XX, t(9;22)(q34; q11.2) ü Imatinibe
Aplicação em genética médica Ø Utilização como marcador genético: análise de ligação Ø Diagnóstico pré-natal de doenças genéticas Ø Detecção de portador heterozigoto Ø Avaliação de pessoas com risco de predisposição a doenças complexas: câncer, doenças coronarianas e diabete Ø Teste de paternidade e aplicações forenses Ø Tipagem tissular para transplante de órgão
Exercício de fixação q Descrever uma aplicação do uso de alterações moleculares em medicina clínica q Caracterização da alteração molecular q Doença