Biologia Celular e Molecular

DEPARTAMENTO DE ZOOLOGIA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA Biologia Celular e Molecular Detecção da presença de organismos geneticamente modificados em alimento por PCR 2007-2008 1

Neste segundo bloco de aulas práticas serão realizadas uma série de actividades que permitiram identificar a presença, ou ausência, de alimentos geneticamente modificados em alguns alimentos. Para tal serão efectuadas as seguintes actividades: 1. Ampliação de um fragmento de DNA por PCR. 2. Visualização dos produtos da ampliação por electroforese. Protocolos desenvolvidos e adaptados por: Ana Luísa Carvalho Paulo Santos 2

Introdução Desde o lançamento da primeira cultura geneticamente modificadas (GM) nos EUA, em 1996, os cientistas têm debatido o uso dessas culturas devido aos potenciais riscos para o ambiente e para a saúde. Alimentos geneticamente modificados são alimentos que contêm componentes de culturas GM - plantas que foram geneticamente modificadas pela inserção de material genético estranho. Este material genético pode ter origem em outras plantas, mas também em espécies de outro reino (animais, fungos, bactérias). O material genético estranho é geralmente um gene que codifica uma proteína que dá à planta uma vantagem sobre plantas semelhantes como, por exemplo, resistência a pragas, tolerância a herbicidas, atraso no amadurecimento de frutas, melhoria no rendimento ou o aumento no teor de determinados nutrientes, entre outras. Como modificar geneticamente uma cultura? O primeiro passo no processo de modificação genética é identificar uma proteína que tem o potencial para melhorar a cultura. Uma das mais populares linhas de culturas GM tem um gene da bactéria do solo Bacillus thuringiensis, (Bt) inserido em seu genoma. As culturas Bt produzem uma proteína chamada delta-endotoxina que é letal para European corn borers, uma praga comum no milho. Os agricultores que plantam culturas Bt, não necessitam de aplicar pesticidas, porque as plantas produzem a proteína tóxica. O segundo passo consiste em isolar (clonar), o gene que codifica a proteína. Todo o gene deve, primeiro, ser localizado no genoma do organismo e depois copiado para ser clonado fora do organismo. Embora a região do gene que codifica possa ter apenas algumas centenas ou milhares de pares de bases, o gene em si pode ter dezenas de milhares de pares de bases, devido aos seis intrões (sequências não codificantes). A clonagem de toda uma genética pode ser muito trabalhoso e pode durar vários anos. Os genes contêm sinais que regulam a sua expressão nas células do hospedeiro, mas estes sinais não são, muitas vezes, compreendidos pelas células de outro organismo. Assim, o terceiro passo é construir um gene que seja correctamente lido pela célula da planta a modificar, de modo que esta seja capaz de sintetizar a proteína de interesse. Isso é feito através da racionalização do gene, eliminando os intrões desnecessários e adicionando, ou alterando, sequências, que permitirá o gene ser expresso dentro das células das plantas a modificar, incluindo um promotor e um terminador (ver Figura 1). O promotor serve como um local de ligação para a RNApolimerase e como sinal de onde ela deve começar a transcrição de um gene. O terminador é o sinal para parar a transcrição. O promotor mais utilizado em 3

culturas GM é o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV 35S). Este promotor é escolhido porque já é concebido pela natureza para activar a transcrição em todos os tipos células vegetais. O terminador mais utilizado em culturas GM é a nopalina sintase (NOS), terminador da Agrobacterium tumefaciens. Cerca de 85% das culturas GM apresentam uma ou as duas alterações genéticas referidas. As análises que realizará durante as próximas aulas permitirão identificar a existência destas duas modificações genéticas em produtos alimentares. Promotor Gene Terminador RNA polimerase Fig. 1 Estrutura de um gene. Depois de construir o gene com o promotor e o terminador adequado, este precisa de ser introduzido na planta. O gene não pode ser inserido em todas as células de uma planta já existente. Em vez disso, células vegetais individuais são transfectadas com o gene pretendido e, em seguida, novas plantas vão se desenvolver a partir dessas células únicas. Como identificar plantas geneticamente modificadas? Actualmente utilizam-se dois métodos distintos. O teste de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) é um teste imunoenzimático que permite a identificação de proteínas específicas produzidas pelas plantas geneticamente modificadas. O ELISA só pode ser utilizado em produtos frescos, devido à degradação das proteínas durante o processamento dos alimentos. Além disso, como o teste por ELISA identifica as proteínas produzidas pelos OGM, os testes têm ser específicos para cada tipo de cultura. Por exemplo, um teste ELISA para Bt apenas detecta milho Bt, e não milho GM tolerante a herbicidas. No entanto, é uma técnica pouco dispendiosa. Outro teste utilizado é por PCR (Polimerase Chain Reaction; reacção em cadeia catalizada pela DNA polimerase) que identifica sequências de DNA que foram inseridas na planta geneticamente modificada. Em contraste com as proteínas, o DNA é uma molécula relativamente estável. Assim, fragmentos de DNA podem ser isolados de alimentos 4

processados e amplificados por PCR. Em oposição à técnica de ELISA, que é específica para uma única cultura, um único teste de PCR pode detectar 85% de todas as culturas geneticamente modificadas. Isto porque na engenharia genética utiliza-se um pequeno número de sequências reguladoras (promotor e terminador) para controlar a expressão dos genes introduzidos. Assim, estas sequências são comuns à maioria das culturas geneticamente modificadas. Uma versão modificada do PCR, o PCR em tempo real, pode também quantificar a percentagem de material geneticamente modificado nos alimentos amostra. 5

Aula 1 Parte A Nesta parte irá extrair o DNA de alimentos livres de OGM bem como de alimentos elaborados a partir de OGM. Os OGM mais comuns são o milho e o feijão de soja. Assim, os testes devem ser realizados em milho fresco, soja ou, em alternativa, preparados alimentares contendo estes alimentos. Deve preparar os controlos (negativos para OGM). Para tal deve pesar a comida, misturar com água até obter uma massa uniforme. Esta mistura deve ser adicionada a um tubo com rosca contendo InstaGene matrix e depois fervida durante 5 minutos. O conteúdo celular, libertado pela maceração, contém enzimas (DNAses) que podem degradar o DNA que se está a tentar extrair. O InstaGene matrix é composto de partículas microscópicas carregadas negativamente que capturam os iões metálicos da solução (por exemplo, Mg 2+ ), que funcionam como cofactoes nessas reacções enzimáticas. Quando o DNA da amostra é extraído na presença de InstaGene matrix, as partículas carregada negativamente aprisionam o Mg 2+ e tornam-no indisponível para as enzimas que degradam o DNA. Isto permite que se extraia o DNA sem ocorrer a sua degradação. O ferver das amostras desnatura as enzimas. Depois de centrifugar as amostras, para remover o InstaGene matrix e restos celulares, obtém-se um sobrenadante que contém o DNA, que será utilizado como DNA alvo. Nota: Processe os controlos (ONGM) antes das amostras, para reduzir o risco de contaminação. Preparação dos alimentos e extracção do DNA 1. Identifique os tubos com rosca com (-) e teste. 2. Pipete 500 µl de InstaGene matrix para cada um dos tubos. 3. Pese 1 2 g de alimentos não contendo OGM e coloque num almofariz. 4. Adicione 5 ml de água destilada por cada grama de alimentos. 6

5. Moa com o pilão durante, pelo menos, 2 minutos até formar uma pasta uniforme. 6. Adicione 5 volumes de água e agite até obter uma mistura uniforme e suficientemente liquida para pipetar. 7. Utilizando uma ponta amarela cortada na extremidade, pipete 50 µl da mistura para o tubo marcado com (-) que deve já conter 500 µl de InstaGene matrix 8. Tape os tubos e agite bem. 9. Lave bem o almofariz e o pilão com detergente e seque. 10. Repita os passos anteriores de 3 a 6, agora com os alimentos que pretende testar. 11. Utilizando uma ponta amarela cortada na extremidade, pipete 50 µl da mistura para o tubo marcado com (teste) que deve já conter 500 µl de InstaGene matrix 12. Tape os tubos e agite bem. 13.Coloque os tubos num banho com água a 95 ºC durante 5 minutos. Banho a 95 ºC 14. Retire os tubos do banho, e centrifugue-os a 14000rpm, durante 5 minutos. Parte B Nesta parte irá realizar a amplificação de um fragmento de DNA por PCR. Irá utilizar dois conjunto de dois oligonucleótidos sintéticos de DNA, em cadeia simples, complementares às extremidades 3 dos fragmentos de DNA a amplificar. Estes dois oligonucleótidos, os primers, devem ser adicionados à reacção em grande quantidade. São também necessários nucleótidos livres, para sintetizar novas cadeias de DNA. Um dos conjuntos de primers (coloridos de vermelho) permitiram detectar sequencias especificas nos OGM e o outro conjunto de primers (coloridos de verde) para identificar DNA de plantas, sejam ou não OGM. A utilização deste segundo conjunto de primers 7

permitirá verificar se um resultado negativo se deve à ausência de material geneticamente modificado ou se apenas se deve a uma extracção de DNA mal sucedida. Este segundo conjunto de primers amplia uma região, com 455pb, do gene que codifica o fotossistema II dos cloroplastos, comum em muitas plantas. Para a detecção dos OGM utilizará um par de primers que amplia uma região, com 203pb, do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (cauliflower mosaic vírus;camv 35S), presente na grande maioria das plantas geneticamente modificadas. 1. Numere seis tubos de PCR (1 a 6) e identifique-os com o número do grupo. Os números correspondem com o seguinte conteúdo: Tabela I: Preparação dos tubos de PCR Tubo Grupo que o prepara DNA Master Mix 1 1 DNA Controlo (não OGM) 20 µl Plantas 20 µl 2 2 DNA Controlo (não OGM) 20 µl GMO 20 µl 3 1 DNA Teste 20 µl Plantas 20 µl 4 2 DNA Teste 20 µl GMO 20 µl 5 1 DNA (OGM) 20 µl Plantas 20 µl 6 2 DNA (OGM) 20 µl GMO 20 µl 2. Introduza cada tubo num tubo adaptador sem tampa o qual deverá ser colocado num suporte sobre o gelo 3. Seguindo o indicado na tabela anterior, pipete 20 µl do master mix* * indicado para cada um dos tubos com tampa. Atenção: deve utilizar uma ponta nova em cada pipetagem. 4. Também de acordo com o indicado na tabela anterior, pipete 20 µl da cada DNA indicado para o tubo respectivo, assegurando-se que não toca no sedimento existente no fundo da cada tubo. * O Master mix contém uma mistura dos nucleótidos (datp, dttp, dctp e dgtp), tampão e Taqpolimerase 8

Quando coloca os 20 µl no tubo, deve pipetar para cima e para baixa várias vezes, para se assegurar de uma mistura uniforme. 5. Tape os tubos. 6. Coloque os tubos no termociclador. 7. Programe o termociclador para ciclos de três etapas: 1º Desnaturação, 94 ºC durante 1 minuto; 2º Emparelhamento, 59 ºC durante 1 minuto 3º Extensão, 72 ºC durante 2 minutos Este ciclo deve repetir-se 40 vezes. Duração total do processo de amplificação: 3,5 horas. Fim da primeira aula 9

Aula 2 Parte A Na primeira aulas deste bloco completou a amplificação de uma porção de DNA por PCR. Contudo, ainda não pode determinar se tem, ou não, os produtos da amplificação. Para tal necessita separar e visualizar os vários produtos da reacção. Para tal irá realizar uma electroforese. 1. Monte o sistema de electroforese. 2. Prepare o gel (agarose 3%) onde irá correr as amostras. 2.1. Pese 1,5g de agarose 2.2. Adicione 50 ml de TEA (1X) num Erlenmeyer de 100 ml 2.3. Adicione a agarose que pesou e aqueça num microondas até derreter (3 minutos, agitando de 30 em 30 segundos). 2.4. Deixe arrefecer até aos 60 ºC. 2.5. Adicione 2 µl de de etídeo 10 mg/ml. 2.6. Prepare a tina de electroforese, selando-a com fita-cola grossa os topos do tabuleiro. 2.7. Verta o conteúdo numa tina de electroforese e deixe solidificar (10-20 min) 2.8. Durante o processo de arrefecimento introduza no gel o pente com 8 dentes, para formar os orifícios onde irá introduzir a amostra. 2.9. Retire a fita-cola e coloque o gel, no tabuleiro, numa câmara de electroforese, de modo a que os orifícios fiquem do lado do cátodo (preto). As amostras irão migrar para o ânodo (vermelho). 3.Utilizando uma ponta nova, adicione 10µl do corante de loading Orange G a cada tubo de PCR e misture bem. 4.Coloque 20µl do padrão de massa molecular na coluna 7 do gel. 5. Coloque, nas colunas 1 a 6 do gel, 20µl de cada uma das amostras, tal como indicado na tabela seguinte: Tabela II- Gel de agarose Coluna Amostra Volume 1 DNA Controlo (não OGM)l 20µl 2 DNA Controlo (não OGM) 20µl 3 DNA Teste 20µl 4 DNA Teste 20µl 5 DNA (OGM) 20µl 6 DNA (OGM) 20µl 7 Padrão de peso molecular 20µl 8 Vazia l 10

6. Preencha a câmara de electroforese com o tampão de corrida, cobrindo o gel com cerca de 2 mm de líquido. 7. Corra o gel de agarose durante 30 minutos a 100V. Atenção: Não deve permitir o corante laranja migrar para fora do gel. 8. Retire o gel para um tabuleiro. 9. Visualize o gel num transiluminador. O DNA adquire uma cor laranja. 10. Fotografe a imagem para posterior análise. Análise dos resultados 1. Preencha a tabela III com os resultados obtidos e preencha a figura com as bandas observadas. Coluna Amostra Nº bandas Tamanho das bandas (pb) 1 DNA Controlo (não OGM)l 2 DNA Controlo (não OGM) 3 DNA Teste 4 DNA Teste 5 DNA (OGM) 6 DNA (OGM) 7 Padrão de peso molecular 11

Questões: 1. Qual a comida de analisou? 2. A sua amostra gerou uma banda, com 200pb, na coluna com os primers para OGM? 3. Que outra informação necessita para confirmar a presença de OGM na sua amostra? 4. Se repetir estas experiências, o que faria diferente de modo a melhorar os resultados? 12

Anexo Amplificação de um fragmento de DNA por PCR No início da década de 80, SAIKI et al. (1986) desenvolveram a técnica de amplificação de DNA in vitro, conhecida como reacção em cadeia catalizada pela DNA polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR). Com a utilização desta técnica é possível amplificar especificamente um fragmento de DNA, tirando partido das características da DNA polimerase. Na reacção é necessário ter uma pequena quantidade do DNA que se pretende amplificar, e dois oligonucleótidos sintéticos de DNA, em cadeia simples, complementares às extremidades 3 do fragmento de DNA a amplificar. Estes dois oligonucleótidos, os primers, devem ser adicionados à reacção em grande quantidade. São também necessários nucleótidos livres, para sintetizar novas cadeias de DNA. A reacção de PCR consiste numa sucessão de vários ciclos (normalmente entre 25 e 30 ciclos), em que cada ciclo consiste de três etapas, que correspondem a incubação da reacção a três temperaturas diferentes (Figura Y). Na primeira etapa, aquece-se a reacção a 94ºC, para provocar desnaturação das cadeias de DNA. Na segunda etapa, faz-se descer a temperatura até 50ºC-60ºC, para que os primers emparelhem com o DNA a que são complementares. Na terceira etapa, sobe-se a temperatura a 72ºC, temperatura óptima de funcionamento da DNA polimerase que se utiliza na reacção de PCR. Utiliza-se frequentemente a Taq polimerase, uma DNA polimerase extraída de Thermus aquaticus, um microorganismo termófilo, e que resiste sem desnaturar às altas temperaturas utilizadas durante a primeira de cada ciclo da reacção de PCR (94ºC). A Taq polimerase polimeriza novas cadeias de DNA a partir dos primers de DNA, tendo como molde as cadeias de DNA previamente desnaturadas, às quais os primers se ligaram especificamente. Este ciclo de três etapas é repetido várias vezes. Em cada ciclo, o DNA sintetizado no ciclo anterior serve de molde à síntese de novas moléculas de DNA, de tal modo que a quantidade do fragmento de DNA pretendido aumenta exponencialmente. 13

Desnaturação das cadeias a 94 ºC Emparelhamento dos primers a 59 ºC Extensão a 72 ºC Repetir o ciclo 40x Fig. 2- Um ciclo completo da reacção de PCR. Início 1º Ciclo 2º Ciclo 3º Ciclo 4º Ciclo 5º Ciclo 6º Ciclo Contagem ao fim de 20 ciclos DNA intermédio DNA molde Sequência exacta de DNA Fig. 3- Representação esquemática da ampliação dum fragmento de DNA por PCR. 14

Soluções a preparar: 50x TAE (500 ml) 121 g Tris 28,5 ml ácido acético glacial 50 ml 0,5 M EDTA, ph 8 H 2 O até 500 ml 10x Loading Buffer 10 g Ficoll 400 10 ml 0.5 M EDTA 30 ml H 2 O 5 ml 10% SDS 0.125 g Azul de Bromofenol 0.125 g Xileno de Cianol Brometo de etídeo (10 mg/ml) 250 mg de brometo de etídeo em 25 ml ml de H2O; proteger da luz. 15