Caracterização de Proteínas

Aula de Bioquímica I Tema: Caracterização de Proteínas Prof. Dr. Júlio César Borges Depto. de Química e Física Molecular DQFM Instituto de Química de São Carlos IQSC Universidade de São Paulo USP E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br

Eletroforese Movimento de partículas carregadas num campo elétrico externo. - Técnica que se baseia no uso das cargas elétricas das biomoléculas (DNA, RNA e Proteínas) para separar e analisar as suas propriedades físico-químicas. Alta resolução de separação depende do meio e da partícula Introdução Uma partícula de carga Z em um campo elétrico E experimenta a força F F = ZE A partícula carregada no campo elétrico sofre a ação contrária da fricção (f = coeficiente friccional), que é proporcional à velocidade v da partícula no meio. No estado-estacionário movimento constante F ZE = vf v = = 0 = ZE vf Logo f ZE

Eletroforese A Mobilidade Eletroforética de partículas carregadas num campo elétrico externo e constante, definido como µ, é a velocidade da molécula por unidade de campo elétrico. v = ZE f µ = v = E Z f (cm 2 /V.sec) - Princípio teórico de todos os métodos eletroforéticos µ é proporcional à razão z/f z depende da relação pi da molécula versus ph da solução f = coeficiente friccional depende das condições experimentais f = 6 πrη = 6πR H η R sph = 3M V 4πN kt f RT N A 6πηR H Portanto, a migração de uma partícula num campo elétrico é dependente: da carga Z e coeficiente f, portanto depende também da Massa molecular M bar A 1/ 3 D = =

Eletroforese de Proteínas Fase estacionária Gel de poliacrilamida - Forma polímero com uma rede entrelaçada ou entrecruzada - Formado pela reação radicalar entra Acrilamida-Metilenobisacrilamida - Necessita de Persulfato de amônio e TEMED

Eletroforese de Proteínas Gel de poliacrilamida Montado entre duas placas de vidro - Solução estoque de Acrilamida/Bisacrilamida 30%/2,7% Acrilamida é tóxico para o Sistema Nervoso Central e Cancerígeno - Gel de corrida fase de separação das proteínas - Gel de concentração fase de aplicação das amostras pente Qualidade do Gel depende - Qualidade da Acrilamida/Bisacrilamida (Pureza); - Água deionizada (sem metais pesados); - Armazenamento da solução em vidro Âmbar (evitar reação Fotoradicalar); - Deaeração; - Tempo de armazenamento do gel; - Temperatura; - Etc.

Eletroforese de Proteínas Em condições não-desnaturantes, a separação depende da Z da proteína Dependendo da relação do pi versus ph, a Z proteína pode ser + ou - pi ph no qual o somatório das cargas é igual a 0 - Funciona para DNA/RNA Z total negativo independente do ph Proteína + migra para o pólo Proteína migra para o pólo + Net positive charge Net negative charge + Increasing cationic No net charge Increasing anionic 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ph

Eletroforese de Proteínas

Eletroforese de Proteínas Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na presença de SDS SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate poliacrylamide gel electrophoresis Interação da proteína com SDS deixa a proteína com Z total Negativa SDS Molécula anfipática Desnatura a proteína na formação de complexo SDS:Proteína 1,4g SDS/1g de proteína Z total negativa será proporcional ao tamanho da proteína Rateio Z/M será aproximadamente constante (ou f) para proteínas de M diferentes - Densidade de carga Z constante SDS interage mais com a parte hidrofóbica da proteína

Eletroforese de Proteínas Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na presença de SDS

SDS-PAGE Permite separação baseada na filtração molecular da proteína na peneira formada pelo polímero entrecruzado de Acrilamida-Bisacrilamida

SDS-PAGE Permite análise direta da M em função do mobilidade eletroforética (RF) SDS normaliza efeitos devido ao formato da partícula, pois desnatura a proteína Curva padrão deve ser corrida nas mesmas condições experimentais - mesmo gel preferencialmente

SDS-PAGE - Log da M versus RF y = a( x) + b log M = a( RF ) + b M = e a ( RF ) + b

SDS-PAGE Influencia da porosidade do Gel

SDS-PAGE Interferências na determinação da M Resistência à desnaturação química e térmica -Efeitos da forma da partícula Menor interação com SDS - Menor densidade de carga Z Reduz força Motriz - Migração anormal aumenta M App Degradação devido à desnaturação térmica (principalmente) Necessidade de agentes redutores Presença de glicosídeos Presença de grupos PO 4 3- Proteína muito carregada negativamente (pi ácido) - Reduz o número de moléculas de SDS por proteína repulsão entre cargas - Menor densidade de carga Z Reduz força Motriz - Migração anormal aumenta M App Proteína muito carregada positivamente (pi básico) - Grupos positivos agem como fator de resistência Reduz força Motriz - Migração anormal aumenta M App

Eletroforese Métodos de detecção/visualização Colorimétricos Coloração com Comassie Brilliant Blue RG-250 - Limite de detecção ~0,1-1,0 µg de proteína Impregnação por Prata (2000 x mais sensível) - Limite de detecção ~0,01-0,1 µg de proteína Comassie Brilliant Blue Impregnação por Prata

Eletroforese Métodos de detecção/visualização Radiométricos - Proteínas ou DNA/RNA marcadas com radioisótopos - Uso de sondas de DNA/RNA marcadas com radioisótopos Requer: 1) Transferência da amostra do gel 2) Imobilização das moléculas numa membrana de nitro-celulose 3) Incubação com a Sonda 4) Exposição ao filme fotográfico Southern Blot - DNA Northern Blot - RNA Western Blot - Proteínas

Eletroforese Métodos de detecção/visualização Imunológicos - Detecção intermediada por um anticorpo ou outra sonda específica - Detecção do anticorpo que interagiu especificamente com a proteína de interesse - Anticorpos marcados com radioisótopos ou um fluoróforo/cromóforo Métodos Imunológicos requerem transferência do gel de poliacrilamida

Eletroforese Métodos de detecção/visualização Quantificação A quantidade de uma determinada banda em uma eletroforese pode ser estimada - Análise das bandas por densitrometria Uso de padrões quantitativos - Curva padrão Área sob a curva densitrométrica é proporcional à quantidade

Focalização isoelétrica Metodologia para determinar o pi de uma proteína Proteína nativa migrará numa mistura de anfólitos orgânicos até alcançar o ph no qual a somatória de suas cargas seja igual a 0. A corrida é feita entre tampões com ph ácido (cátodo) e básico (ánodo) A mistura de anfólitos é corrida anteriormente no PAGE e vão se posicionar no campo elétrico segundo o balanço de cargas

Focalização isoelétrica Metodologia para determinar o pi de uma proteína A corrida é feita entre tampões com ph ácido (cátodo) e básico (ánodo) Gradiente de ph imobilizado IPG: Immobilized ph Gradient CH 2 CH C N R O R= carboxil ou amina 3º - Gradiente de concentração de substâncias com diferentes pka é co-polimerizado com a fase estacionária (poliacrilamida) Low ph (+) High ph ( )

Eletroforese Bidimensional (2D) 1º Dimensão: Focalisação isoelétrica 2º Dimensão: SDS-PAGE

Eletroforese Bidimensional (2D) GRANDE IMPORTÂNCIA PARA A PROTEÔMICA Resolve proteínas de mesma MWapp com diferentes pi Resolve proteínas de diferentes MWapp com mesmos pi pi Cada spot é uma proteína!! O spot pode ser retirado do gel e identificado por seqüenciamento do N-terminal ou por Espectrometria de Massas. Mapp Uso em conjunto com banco de dados BIOINFORMÁTICA Mais de 1000 proteínas podem ser resolvidas e identificadas num único gel.

Eletroforese Bidimensional (2D) Permite análise diferencial do conteúdo protéico de um célula/tecido em diferentes condições experimentais PROTEÔMICA - Necessidade de padrões internos para identificar coordenadas do gel. Cada gel é único!!!

Espectropolarimetria de Dicroísmo Circular (CD) Assimetria em Biomoléculas PROTEÍNAS - Estrutura primária: carbono alfa dos aminoácidos (exceção Gly). - Estrutura secundária: transições eletrônicas na cadeia principal e alfa-hélice - Estrutura terciária: moléculas simétricas colocadas em um campo assimétrico (Tyr)

Espectropolarimetria de Dicroísmo Circular (CD) Diferença de Absorção entre a luz Circularmente polarizada - À Esquerda - À Direita CD signal = Θ λ = A A ( nm ) Esquerda λ ( nm ) Direita λ ( nm ) Luz Circularmente Polarizada A combinação de duas ondas linearmente polarizadas, uma vertical e outra horizontal, de mesma amplitude e eletricamente DEFASADAS em 90 graus, resulta em uma onda CIRCULARMENTE POLARIZADA Amplitudes diferentes - uma onda elipticamente polarizada http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo1.htm

Espectropolarimetria de Dicroísmo Circular (CD) Estudo de PROTEÍNAS Conformação da estrutura secundária Alfa-hélice Folha-beta paralela Folha-beta antiparalela Desordenada +10 0-10 Comprimento de onda (nm)

Espectropolarimetria de Dicroísmo Circular (CD) Estudo de PROTEÍNAS Conformação da estrutura secundária Aplicações 1. Enovelamento de Proteínas 2. Comparação de estruturas Proteínas obtidas de diferentes fontes Mutantes de uma mesma proteína Controle de qualidade de proteínas estrutura secundária 3. Estabilidade Química ph Desnaturantes 4. Estabilidade Térmica 5. Mudanças conformacionais e ensaios de interação Interações proteína-proteína Interações proteínas-ligantes

Fluorescência Intrínseca de Proteínas Energia versus tempo Uma molécula absorve energia quantizada e atinge o estado excitado No retorno ao estado basal, parte o excesso de energia é perdido na forma de calor O restante é perdido na forma de luz Espectro de absorção dos aminoácidos aromáticos Fluorescência de proteínas conta com excitação em 280 nm. Maior parte dos fotons emitidos deve-se ao Trp, depois à Tyr e então Phe. λ exc 280 nm Tyr e Trp λ exc 295 nm Trp

Fluorescência Intrínseca de Proteínas O λ Max de Fluorescência do Trp é sensível ao ambiente Efeito do Enovelamento da Proteína na Sonda de fluorescência Intensidade de Fluorescência Perturbações do estado enovelado e na dinâmica - λ max (nm) de emissão é a melhor indicação do ambiente do fluoróforo Resíduos de Trp expostos à água apresentam λ max de emissão 340-350 nm, enquanto totalmente enterrados < 330 nm. - Depende do número de W na proteína

Fluorescência Intrínseca de Proteínas O λ Max de Fluorescência do Trp é sensível ao ambiente Sonda para estrutura terciária local MUDANÇAS CONFORMACIONAIS UNFOLDING PROBE LIGAND PROBE F0 F log = log K A + n log[ L] F

Cromatografia de Exclusão Molecular Analítica Separação pelo tamanho (pela M) Modo Preparativo: purificar proteínas Modo Analítico: analisar macromoléculas em solução Fase Estacionária: Matriz ou Resina Porosa Inerte Esférica Estável Fase Móvel Tampão salino Eluição isocrática Sem variação da fase móvel Existem resinas para 100 a 1x10 6 Da

Cromatografia de Exclusão Molecular Analítica Determinando a M aparente Precisa de uma curva padrão de proteínas de M conhecidas; Sofre influências do formato da macromolécula de interesse; A M diretamente determinada está relacionada à partículas globulares; K av V V V V e 0 = K av = a (log M ) + b t 0

Ultracentrifugação analítica - UAL Uso da força gravitacional para sedimentar uma partícula Sedimentação precipitação de partículas dissolvidas em solução por ação da força do campo gravitacional Centrifugação partícula submetida a uma força externa centrífuga Hidrodinâmicos Baseia-se em princípios Termodinâmicos É UMA TÉCNICA ABSOLUTA!!! M sem desnaturação da proteína; Coeficiente de sedimentação; Formato das partículas (assimetria); Independe de padrões externos Através da UAL é possível determinar: Homogeneidade e estados de agregação; Constantes de associação e estequiometria; Técnica Padrão Ouro. Em condições experimentais diversas!!! Sem interferências externas!!! Theodor Svedberg (1884-1971) Nobel Prize winner for Chemistry (1926)

Ultracentrifugação Analítica As forças sobre uma partícula sob um campo centrífugo F 2 C = ω rm F Emp 2 = ω rm L 2 = ω rmv bar ρ L m = L mv bar ρ L F f = fv ω = velocidade angular; V bar = volume parcial específico da partícula; r = raio; ρ L = densidade do Líquido; m = massa da partícula; f = coeficiente friccional. m L = massa do líquido deslocado; A m de uma partícula está relacionada com a massa molecular M desta pelo Número de Avogrado. m = M N Av

Ultracentrifugação Analítica Se a velocidade da partícula é constante: a soma das forças sobre ela é igual a 0. F C + F Emp + F f = 0 = ω 2 r M N Av + ( ω 2 r M N Av V bar ρ f ) + ( fv) Resolvendo em função da Velocidade: v 2 ω r(1 V = f bar ρ ) f M N Av M (1 V N Av bar f ρ Resolvendo pelos fatores internos e externos!!! f ) v = s 2 ω r Equação de Svedberg s = Coeficiente de Sedimentação = 10-13 seg = S = 1 Svedberg O s representa a velocidade da partícula por unidade gravitacional e depende das propriedades das partículas: M efetiva e forma da partícula.

Ultracentrifugação Analítica 1) A velocidade de sedimentação de uma partícula depende de sua M Quanto maior a M maios o valor de s Protein M (kda) s (S) s = M ( 1 V ρ N Av bar f ) f Citocromo C 12,3 1,83 Mioglobina 17,8 1,97 Tripsina 23,2 2,5 Anidrase Carbônica 28,8 3,8 Malato Desidrogenase 74,9 5,76 Lactato Desidrogenase 146,2 7,54 2) O coeficiente de atrito f reduz o valor de s Quanto menos globular for uma proteína menor a sua velocidade de sedimentação 3) Quanto maior a densidade de uma partícula maior a sua velocidade de sedimentação Quanto maior o valor da componente (1 V bar ρ f ) maior a velocidade de sedimentação OBS: 2 e 3 permitem o estudo estrutural de proteínas comparadas a proteínas de mesma M

Ultracentrifugação Analítica 4) A velocidade de sedimentação depende da densidade do líquido ρ f - Se V bar ρ f < 1 a partícula sedimentará - Se V bar ρ f > 1 a partícula flutuará - Se V bar ρ f = 1 a partícula não se movimentará (Zera o numerador da Eq. de Svedberg) Base da técnica de Centrifugação em gradiente (ou zonal, ou em faixas, ou em bandas) - Gradiente linear de sacarose

Sequenciamento de Aminoácidos O conhecimento da sequência de Aminoácidos uma proteína é o primeiro passo para a determinação de sua função Insulina bovina

Sequenciamento de Aminoácidos O conhecimento da sequência de Aminoácidos uma proteína é o primeiro passo para a determinação de sua função 1º Permite comparação da sequência de aminoácidos com banco de dados de proteínas para avaliar sua função, família de proteínas, tipos de estruturas 3D, localização, etc. 2º Comparar proteínas de diferentes espécies permite avaliação evolutiva 3º Avaliar padrões de repetições internas eventos de duplicação de domínios 4º Identificas seqüências motivo para sinalização de processamento, ativação/inativação 5º Permite construir anticorpos específicos 6º permite construir sondas de DNA para engenharia genética O sequenciamento de Aminoácidos por intermédio do seqüenciamento do DNA GENOMA

Sequenciamento de Aminoácidos A seqüência de aminoácidos de uma proteína pode ser determinada pela ciclo de degradação de Edman automatizada 1º Etapa Determinar a composição de aminoácidos da proteína A G D F R G - Hidrólise ácida da ligação peptídica HCl 6 mol/l a 110 o C - Reação com Ninhidrina coloração rocha permite detecção Cromatografia de troca iônica HPLC: Cromatografia Líquida de alta performance (Asp, Arg, Ala, Phe, Gly 2 )

Sequenciamento de Aminoácidos 2º Etapa Identificação do AA N- terminal Marcação do N-terminal com um corante (1-fluoro-2,4- dinitrobenzeno) seguida de hidrólise da cadeia peptídica 3º Etapa (Cíclica) 1º Passo Proteção Aminoterminal com Isotiocionato de fenila 2º Passo Liberação do AA marcado (PTC: feniltiocarbamoil) em meio levemente ácido 3º Passo Identificação do derivado de AA da Feniltioidantoína PTH-AA

Sequenciamento de Aminoácidos Identificação de cada PTH- AA por Cromatografia de troca iônica HPLC: Cromatografia Líquida de alta perfomance 1º ciclo 2º ciclo

Sequenciamento de Aminoácidos A degradação de Edman permite seqüenciar até 50 resíduos -Limitação pela eficiência da clivagem seqüencial de 99% por AA Sequenciamento completo de Proteínas grandes A clivagem diferencial de proteínas por métodos diferentes - método de escolha depende do conteúdo de aminoácidos da proteína Separação dos fragmentos Sequenciamento individual dos fragmentos A sequência de aminoácidos de proteínas grandes pela sobreposição de seqüências individuais dos fragmentos Mesmo princípio é empregado para o sequenciamento Genômico.

Sequenciamento de Aminoácidos (1) (2) (3) (4) (5)

Síntese de peptídeos Sequências de até 50 resíduos podem ser sintetizados pelo Método de Fase sólida 1) Uso na produção de Anticorpos 2) Identificação de receptores 3) Como medicamentos 4) Estudos Estruturais diversos - Envolve eventos de Ancoragem na resina e ciclos de Desproteção e Acoplamento e finalmente liberação da resina Proteção do N-terminal Ativação do C-terminal

Síntese de peptídeos Síntese é feita a partir do C-terminal para o N-terminal 1) Ancoramento 3) Acoplamento 2) Desproteção

Síntese de peptídeos em fase sólida (1) - Permite lavagem dos produtos entre os ciclos 1) proteção do N-terminal Fmoc/Tboc (2) 2) Ancoramento 3) Desproteção do N-terminal para atacar o C- terminal ativado 4) Ativação do C-terminal - DCCD (3) 5) Acoplamento 6) Repetição dos ciclos anteriores 7) Liberação (4) (5) (6) - proteção da cadeia lateral (quando necessário)

Espectrometria de Massas Mass Spectrometry (MS) Depende da relação m/z: Íons mais leves são mais rápidos no campo elétrico Permite determinar a M de uma proteína com precisão de 0,1-0,2 Da A M determinada por MS pode ser considerada como um rótulo e permite identificar a proteína se for conhecido o Genoma do organismo fonte Bioinformática Permite identificar modificações pós-traducionais Grande aplicação na Proteômica em conjunto com Eletroforese 2D e Bioinformática

Espectrometria de Massas Mass Spectrometry (MS) Ionização é o fator limitante MALDI: Espectrometria por desabsorção e ionização a laser, assistida por matriz (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization)

Espectrometria de Massas ESI: Espectrometria por Eletro-nebulização (Electrospray ionization)

Espectrometria de Massas ESI: Espectrometria por Eletro-nebulização (Electrospray ionization) - Picos sucessivos diferem por uma carga iônica (m/z) 2 do pico 2 M da proteína n 2 : número de cargas (m/z) 1 do pico 1 M da proteína n 2 : número de cargas X: m do grupo adicionado M e n 2 são as incógnitas em duas equações

Espectrometria de Massas Sequenciamento de Aminoácidos por MS Depende do uso de uma Espectrômetro de Massas em Tandem MS/MS Várias etapas envolvidas

Espectrometria de Massas Sequenciamento de Aminoácidos por MS Depende do uso de uma Espectrômetro de Massas em Tandem MS/MS 1º Etapa: Clivagem da proteína com Tripsina; 2º Etapa: Determinação da M do peptídeo n 1 no MS-1; 3º Etapa: Seleção e Isolamento do peptídeo n 1 em análise na câmara entre o MS-1 e MS-2; 4º Etapa: Fragmentação das ligações peptídicas do fragmento n 1 com carga adequada; -Não ocorre hidrólise vácuo - Permite identificar AA N- e C-terminal 5º Etapa: Determinação M da mistura de peptídeos gerados pelo MS-2 Série N-terminal Série C-terminal

Espectrometria de Massas Os picos sucessivos possuem m que diferem pela M do aminoácido no peptídeo original Superposição de sequências de diferentes fragmentos permite identificar a seqüência de aminoácidos da proteína completa Se o Genoma está disponível, a sequência de AA de um único fragmento pode resultar na identificação da proteína Bioinformática Série N-terminal (massas não indicadas no espectro) Série N-terminal (massas indicadas no espectro) Identificação limitada para Leu e Ile Isômeros constitucionais

Cristalografia de Proteínas Permite a determinação da estrutura de proteínas em alta resolução - Primeiro método de estudo estrutural de proteínas em alta resolução - Representa uma foto da proteína em uma de suas conformações possíveis - Sensível às condições experimentais e presença de ligantes na Etapa de Cristalização Cristalização da proteína Padrão de difração de raios X Mapa de densidade eletrônica Monocristais (bem organizados) CONSTRUÇÃO DO MODELO

Cristalização da Proteína Cristalização da proteína * O cristal atua como um amplificador Moléculas arranjadas na mesma orientação Monocristais (bem organizados) Ondas espalhadas podem ser adicionadas em fase, aumentando o sinal em um nível que possa ser medido

Cristalização da Proteína Obtenção de cristais adequados: - Altamente ordenados; -Difratam em alta resolução; - Tamanho adequado.

Cristalização da Proteína Cristais de insulina

Cristalografia de Proteínas Os elétrons da proteína dispersam Raios X ** O cristal de proteína obtido é irradiado por raios X O feixe espalhado produz um padrão de difração Cristal de proteína Difração de raios X pelo cristal

Cristalografia de Proteínas Os elétrons da proteína dispersam Raios X O espalhamento do feixe de raios X pelo cristal produz um padrão de difração A organização dos pontos no padrão de difração está relacionada com a distribuição das moléculas no cristal Diferença de intensidade: Relacionada com a distribuição dos átomos na molécula

Cristalografia de Proteínas Os elétrons da proteína dispersam Raios X A resolução é um indicador do nível de detalhes do dado experimental

Cristalografia de Proteínas A resolução é um indicador do nível de detalhes do dado experimental

Cristalografia de Proteínas Refinamento Controle de qualidade Ajuste manual

Cristalografia de Proteínas Os elétrons da proteína dispersam Raios X As ondas dispersadas pelos elétrons de um cristal de proteína foram ondas convergentes. O padrão de formação de ondas convergentes depende do arranjo dos átomos no cristal.

Ressonância Magnética Nuclear Espectrometria sensível a átomos com Spin nuclear com momento angular 1 H, 13 C, 15 N, 19 F e 31 P O spin nuclear se orienta perante um campo magnético Absorve Energia do campo - A energia absorvida depende do Átomo e do ambiente que ele experimenta Permite o estudo estrutural e conformacional de proteínas em solução - Fator limitante tamanho da proteína e alta [Proteína] RMN 1 H em uma proteína

Ressonância Magnética Nuclear A RMN bi-dimensional permite determinar a relação espacial entre os AA numa proteína 1) Através dos sinais é possível identificar as relações espaciais entre os AA - Grande custo experimental determinar correlações espaciais dos AA 2) Sabendo das relações espaciais Modelagem da proteína

Ressonância Magnética Nuclear A RMN bi-dimensional pode requerer o uso de 13 C e 15 N podem ser inseridos na proteína por engenharia genética Grande custo computacional A estrutura obtida por RMN representa as várias Estruturas dinâmicas Possíveis 1º 2º