Introdução à Bioquímica Enzimas Dra. Fernanda Canduri Laboratório de Sistemas BioMoleculares. Departamento de Física.. UNESP São José do Rio Preto.. SP.
Enzimas Toda enzima é uma proteína, mas nem toda proteína é uma enzima! Catálise! Cinética enzimática! Inibição enzimática! Regulação
Informações gerais 1. As enzimas tem um enorme poder catalítico 2. São altamente específicas 3. A formação de um complexo enzima-substrato é o primeiro passo na catálise enzimática 4. As As enzimas aceleram reações, estabilizando estados de transição 5. A atividade catalítica de muitas enzimas são reguladas.
Características gerais! As enzimas são catalisadores de reações biológicas! Diferem dos catalisadores químicos em vários aspectos: 1. Velocidade de reação mais rápidas de 10 6 a 10 12 vezes maiores 2. Condições reacionais mais brandas temperaturas inferiores a 100 o C, pressão atmosférica e ph quase neutro 3. Maior especifidade da reação imensamente maior do que catalisadores químicos em relação à identidade dos seus substratos (reagentes)) e dos seus produtos 4. Capacidade de regulação a atividade catalítica pode variar em resposta às concentrações de outras substâncias
Nomenclatura! As enzimas são comumente denominadas adicionando-se o sufixo ase ao nome do substrato, ou a uma expressão que descreva sua ação catalítica Ex.: urease " catalisa a hidrólise da uréia álcool desidrogenase " catalisa catalisa a oxidaçã ção de álcoois em seus aldeídos dos
Classificação! As enzimas foram classificadas de acordo com a natureza da reação química que catalisam 1. Oxido-redutases (reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons) 2. Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil) 3. Hidrolases (reações de hidrólise de ligação covalente) 4. Liases (catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico) 5. Isomerases (reações de interconversão entre isômeros óticos ou geométricos) 6. Ligases (catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entre duas pré-existentes, sempre às custas de energia)
! A União Internacinal de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) adotou um esquema de classificação funcional sistemática e de nomenclatura! Para cada enzima são atribuídos dois nomes nome alternativo e nome sistemático e um número de classificação de quatro subdivisões Exemplo: Carboxipeptidase A (nome( recomendado) Peptidil-L-aminoácido aminoácido-hidrolase (nome sistemático) EC 3.4.17.1 (no. de classificação), sendo EC enzyme EC enzyme comission Os números representam a classe, subclasse,, sub-subclasse subclasse,, e seu número de série
Especificidade dos substratos! Complementaridade geométrica! Complementaridade eletrônica! Mudanças conformacionais (ajuste( induzido) Modelo chave-fechadura da função enzimática
Complementaridade geométrica e eletrônica Ajuste induzido
Presença de cofatores e coenzimas! Cofatores: Cu 2+, Fe 2+, Zn 2+ Cd 2+ e Hg 2+ - efeito tóxico Um exemplo enzima-cofator cataliticamente ativo é chamado de holoenzima. A proteína enzimaticamente inativa resultante da remoção do cofator da holoenzima é chamada de apoenzima apoenzima + cofator holoenzima (ativa)
! Coenzimas: NAD + (nicotinamida adenina dinucleotídeo) associam-se se temporariamente (co- substrato) Muitas vitaminas são precursoras das coenzimas. Muitos organismos não conseguem sintetizar certas porções das coenzimas essenciais. Tais substâncias devem estar presentes na dieta desses organismos são as vitaminas.! Grupos prostéticos associam-se se permanentemente (ligação covalente) Ex: grupamento heme
Energia de ativação e coordenadas de reação! Grande parte do nosso conhecimento sobre o modo como as enzimas catalisam reações químicas é proveniente da teoria do estado de transição 1930! Considerando uma reação bimolecular envolvendo 3 átomos: H A H B + H C " H A + H B H C H C deve aproximar-se da molécula diatômica H A -H B de modo que exista um complexo instável de elevada energia representado por H A H B H C
O ponto de mais alta energia é chamado de estado de transiçã ção do sistema.
Os reagentes se aproximam ao longo de uma rota de energia livre mínima - as coordenadas de reação desses reagentes! Caso os átomos no sistema reacional sejam de tipos diferentes A + B " X " P + Q em que A e B são s o os reagentes, P e Q são s o os produtos e X representa o estado de transiçã ção G, a energia livre do estado de transiçã ção o subtraída da energia livre dos reagentes é a energia livre de ativaçã ção A concentraçã ção o do estado de transiçã ção é pequena (10-13 10-14 s) 13 a
A decomposição do estado de transição em produtos é postulada como sendo o processo determinante da velocidade da reação total
! Quanto maior for o valor de G, menor será a velocidade da reação! menor será o no. de moléculas de reagentes com energia térmica suficiente para alcançar a energia livre do estado de transição! Os catalisadores atuam reduzindo a energia livre do estado de transição da reação catalisada.! A diferença entre os valores de G G de uma reação não- catalisada e de uma reação catalisada indica a eficiência do catalisador.
! Um catalisador reduz a barreira de energia livre na mesma proporção tanto para a reação direta como para a reversa.! A probabilidade de a reação ocorrer em uma ou outra direção depende somente da diferença de energia livre entre os reagentes e produtos.! Se G reação < 0, a reação ocorrerá espontaneamente dos reagentes em direção aos produtos; se G reação > 0, a reação reversa ocorrerá de modo espontâneo
Mecanismos catalíticos 1. catálise ácido-base 2. catálise covalente formação transitória de uma ligação covalente entre o catalisador e o substrato 3. Catálise por íons metálicos metaloenzimas.. Os íons metálicos participam de processos catalíticos de três maneiras: (a) (b) (c) ligam-se ao substrato Mediam reações de oxidação-redução Estabilizam eletrostaticamente, ou protegem cargas negativas
4. Catálise eletrostática exclusão de uma molécula de água do sítio ativo quando o substrato se liga. As interações eletrostáticas são muito mais fortes do que em soluções aquosas 5. Efeito de proximidade e orientação 6. Catálise por ligação preferencial do estado de transição enzimas tensionam mecanicamente seus substratos em direção ao estado de transição pelos seus sítios de ligação
RNase A exemplo de reação enzimática mediada pela catálise ácido-básica
Cinética de reação! Cinética química Reação de estequiometria global A " P Processos moleculares simples A " I 1 " I 2 " P sendo I 1 e I 2 intermadiários rios da reaçã ção
! A velocidade de uma reação é proporcional à frequência na qual as moléculas reatantes colidem.! A constante de proporcionalidade é a constante de velocidade (k)! Para a reação A " P, a velocidade (v) de formaçã ção do produto é V = d[p]/dt dt = d[a]/dt dt = k[a] A velocidade da reação é proporcional à concentração do reatante, em qualquer ponto no tempo.
! Reação de primeira ordem unimolecular A " P considerando a reaçã ção 2A " P! Reaçã ção de segunda ordem bimolecular Sua velocidade instantânea é V = d[a]/dt dt = k[a] 2 A velocidade da reação é proporcional ao quadrado da concentração de A, e k tem unidades de M -1.s -1
Considerando a reação A + B " P! Também é reação de segunda ordem,, com uma velocidade instantânea V = d[a]/dt dt = -d[b]/ d[b]/dtdt = k[a][b]! Considerada de primeira ordem em relação a [A] e de primeira ordem em relação a [B]
Equações de velocidade! Descreve o processo de uma reação em função do tempo e pode ser derivada de equações que descrevem a velocidade instantânea da reação! Sendo assim,, a equação de velocidade de primeira ordem é obtida a partir da equação Rearranjando, v = d[p]/dt dt = -d[a]/ d[a]/dtdt = k[a] d[a]/[a] = d ln[a] = -k dt
Integrando entre os limites de [A] 0 até [A], a concentração no tempo t [ A] = k [ A] 0 0 d ln[ A ] t dt resulta em ln[a] = ln[a] 0 kt ou o antilogaritmo de ambos os lados da equação [A] = [A] 0 e -kt
! A reação de primeira ordem resulta em uma linha cuja inclinação será k
Característica da reação de primeira ordem! O tempo para a decomposição de metade do reatante inicialmente presente (meio tempo) t 1/2 é uma constante e independe da concentração inicial do reatante! Substituindo,, [A] = [A] 0 /2, quando t=t ln ([A] 0 /2/[A] 0 ) = kt 1/2 t 1/2 = ln 2/k = 0,69/k t=t 1/2
Para uma reação de segunda ordem com um único tipo de reatante,, 2A " P A variação da [A] com o tempo é diferente da anterior. se v = d[a]/dt dt = k[a] 2 Então, [ A] d[ A] 0 [ ] = k de maneira que 1/[A] = 1/[A] 0 + kt A é uma equação linear em termos de 1/[A] e t. O meio tempo é expresso por t 1/2 = 1/k[A] 0 E depende da concentração inicial do reatante [ A] 2 0 t dt
Para determinar a constante de velocidade para a reação A + B " P, é mais fácil aumentar a concentraçã ção de um reatante em relaçã ção o ao outro quando [B] >> [A], a [B] não é significantemente alterada durante a reaçã ção A velocidade da reaçã ção depende de [A], que é limitante Assim,, a reaçã ção parece ser de primeira ordem em relaçã ção a [A] (reação de pseudo primeira ordem)
Cinética enzimática! As enzimas catalisam uma enorme variedade de reações usando difierentes combinações dos seis mecanismos catalíticos básicos: 1. Catálise ácido-básica 2. Catálise covalente 3. Catálise por íons metálicos 4. Catálise eletrostática 5. Catálise por meio de efeitos de proximidade e orientação 6. Catálise por ligação preferencial do estado de transição
! Algumas enzimas atuam somente em uma única molécula de substrato! Outras atuam em duas ou mais moléculas diferentes, cuja ordem de ligação pode ou não ser obrigatória! O início dos estudos sobre cinética enzimática foi em 1902, por Adrian Brown! Ele investigou as velocidades de hidrólise da sacarose pela enzima β-frutofuranosidase de leveduras. SACAROSE + H 2 O " GLICOSE + FRUTOSE
Quando [sacarose]] >> [enzima[ enzima], a velocidade de reação torna-se independente da concentração! Adrian Brown propôs então que a reação global é composta por duas reações elementares, nas quais o substrato forma um complexo com a enzima, que se decompõe em produto e enzima k1 k2 E + S ES " P + E K-1! Quando a concentração de substrato for alta o suficiente para converter completamente a enzima na sua forma ES, a segunda etapa da reação torna-se limitante da velocidade.! A velocidade da reação global não irá variar com o aumento [S]
Cada reação elementar descrita é caracterizada por uma constante de velocidade: : k 1 e k -1 para a reação direta e reversa da formação do complexo ES! K 2 para a decomposição de ES em P, a segunda reação! A segunda reação é irreversível k1 k2 E + S ES " P + E K-1
A equação de Michaelis-Menten Menten! Em um esquema cinético complexo,, a velocidade de formação de produtos pode ser expressa como o resultado da multiplicação da constante de velocidade da reação ao formar produtos e a concentração do seu intermediário imediatamente anterior.! A expressão geral para a velocidade da reação É portanto, k1 k2 E + S ES " P + E K-1 v = d[p] / dt = k 2 [ES]
Velocidade global da produção de ES! Diferença entre as velocidades das reações elementares que levam à sua formação e das que resultam no seu consumo: d[es] / dt = k 1 [E][S] k -1 [ES] k 2 [ES]! Essa equação não pode ser integrada sem considerações que a simplifiquem.
1. Consideração de que a reação está em equilíbrio 1913 Leonor Michaelis e Maud Menten supuseram que k 1 >> k 2, de maneira que a primeira etapa da reação alcance o equilíbrio K s = k -1 /k 1 = [S][E] / [ES] onde K s é a constante de dissociação da primeira etapa da reação O complexo enzima-substrato ES é conhecido como o complexo de Michaelis
2. Postulado da reação no estado estacionário, tendo assim um valor constante d[es] / dt = 0 As quantidades [ES] e [E] não são diretamente mensuráveis, com exceção da concentração da enzima, [E] T = [E] + [ES] Que pode ser facilmente determinada A equação de velocidade pode então ser derivada
A equação d[es] / dt = k 1 [S][E] k -1 [ES] k 2 [ES] é combinada com d[es] / dt = 0
Produzindo: K 1 [E][S] = k -1 [ES] + k 2 [ES] se [E] = [E] T [ES], rearranjando, ([E] T [ES]) [S] / [ES] = k -1 + k 2 / k 1 A constante de Michaelis (K M ) é definida como Então, K M = k -1 + k 2 / k 1 K M [ES] = ([E] T [ES]) [S]
Resolvendo para [ES], [ES] = [E] T [S] / K M + [S] A expressão para a velocidade inicial (v 0 ) da reação, a velocidade torna-se v = d[p] / dt = k 2 [ES] em t=0 v 0 = (d[p] / dt) t=0 = k 2 [ES] = k 2 [E] T [S] / K M + [S] [E] T e [S] são quantidades mensuráveis.
! O uso da velocidade inicial minimiza fatores complicadores como os efeitos de reações reversíveis,, e a inativação progressiva da enzima! A velocidade máxima, V máx ocorre a elevadas concentrações de substrato, na qual a enzima está saturada, ou seja, inteiramente na forma ES V máx = k 2 [E] T
Combinando as equações, v 0 = d[p] / dt = k 2 [ES] e V máx e v 0 = k 2 [ES] = k 2 [E] T [S] / K M + [S], máx = k 2 [E] T obtem-se v 0 = V máx [S] / K M + [S] Essa expressão (eq.. de Michaelis-Menten Menten) ) é a equação básica da cinética enzímática Ela descreve uma hipérbole retangular
! A função de saturação para a ligação de O 2 à mioglobina tem a mesma forma algébrica
Significância da constante de Michaelis! K M definição operacional simples quando [S] = K M, a equação v 0 = V máx [S] / K M + [S] torna-se De modo que: v 0 = V máx / 2 K M é a concentração de substrato na qual a velocidade da reação corresponde à metade da velocidade máxima
Se a enzima tiver valor pequeno de K M, ela atingirá a máxima eficiência catalítica em baixas [S]! K M é único para cada enzima-substrato! A magnitude do K M varia bastante com a identidade da enzima e a natureza do substrato! É também uma função da temperatura e do ph.
Enzima Substrato K (mm) m Catalase H 2 O 2 25 Hoxoquinase Glicose Frutose 0,15 1,5 Quimiotripsina N-benzoltirosinamida N-formiltirosinamida N-acetiltirosianamida Gliciltirosinamida 2,5 12,0 32 122 Anidrase carbônica HCO 3-9,0 Glutamato desidrogenase Glutamato α-cetoglutarato NH 4 + NAD ox NAD red 0,12 2,0 57 0,025 0,018 Aspartato amininotransferase Aspartato α-cetoglutarato Oxalacetato Glutamato 0,9 0,1 0,04 4,0
! K cat K cat / K M é uma medida da eficiência catalítica cat (constante catalítica) ) de uma enzima pode ser definida como: K cat = V máx / [E] T Número de reciclagem de uma enzima " representa o no. de processos reacionais que cada sítio ativo catalisa por unidade de tempo. Pela eq. V máx = k 2 [E] T um sistema simples como o modelo de reação de Michaelis-Menten Menten, k cat = k 2
! Quando [S] << K M, pouco ES é formado. Consequentemente, [E] ~ [E] T então,, se v 0 = k 2 [E] T [S] / K M + [S], A eq.. se reduz a v 0 ~ (k 2 / K M ) [E] T [S] ~ (k( cat [E][S] / K M ) Há um limite máximo para o valor de k cat / K M Ele não pode ser maior do que k 1 A decomposição de ES em E + P não pode ocorrer mais frequentemente do que o encontro de E e S para formar ES
Enzimas mais eficientes tem valores de k cat /K M próximos ao limite para reações controladas por difusão de 10 8 a 10 9 M -1 s -1! Estas enzimas catalisam uma reação quase todas as vezes que encontram uma molécula de substrato Atingem um estado de perfeição catalítica
Análise dos dados cinéticos! Há vários métodos para determinar os valores dos parâmetros da eq.. de Michaelis-Menten Menten (V máx e K M )! Para valores elevados de [S], a velocidade inicial v 0 aproxima-se de V máx! É muito difícil determinar V máx com precisão a partir do gráfico de v 0 versus [S]. O valor de V máx é subestimado! Um método mais adequado foi formulado por Hans Lineweaver e Dean Burk " usam o inverso da eq.. de MM
! A eq.. de Michaelis-Menten Menten v 0 = V máx [S] / K M + [S]! a eq.. de Lineweaver-Burk 1 / v 0 = (K M / V máx ) 1 / [S] + 1 / V máx é uma eq.. linear na forma de 1/ v 0 e 1 / [S] Necessita-se se trabalhar com uma faixa de [S] entre ~0,5 K M até ~5 K M Desvantagem: Pontos comprimidos à esquerda do gráfico
Valores pequenos de [S] " pequenos erros em v 0, e grandes erros em 1 / v 0 " desvios de K M e V máx
A cinética em estado estacionário não pode estabelecer um mecanismo de reação sem ambiguidade! Esta cinética fornece informações sobre as velocidades de formação e decomposição de ES! Mas não esclarece sobre a natureza de ES! A reação pode ocorrer por meio de vários estados intermediários ou E + S ES EX EP E + P E + S ES EX ou EY EP E + P caixa preta!
Reações bissubstrato! Reações enzimáticas que requerem múltiplos substratos e formam múltiplos produtos! Reações do tipo E A + B P + Q são responsáveis por ~60% das reações bioquímicas conhecidas. Reações de transferase E P - X + B P + B - X
Reações sequenciais! Mecanismo ordenado! Mecanismo aleatório! Reações de pingue-pongue pongue Reações de transferência de grupos, nas quais um ou mais produtos são liberados antes que todos os substratos tenham sido adicionados
Inibição enzimática! Muitas substâncias alteram a atividade de uma enzima associando-se se reversivelmente a ela, influenciando a ligação do substrato e/ou seu no. de reciclagem.! As substâncias que reduzem a atividade de uma enzima são conhecidas como inibidores! Grande parte do arsenal farmacêutico moderno é constituído por inibidores enzimáticos
Os inibidores atuam através de uma variedade de mecanismos! Alguns são substâncias que se assemelham estruturalmente aos substratos da enzima, mas não reagem, ou reagem muito lentamente! Estas substâncias são usadas para investigar a natureza química ou conformacional do sítio ativo da enzima para tentar elucidar seu mecanismo catalítico! Outros inibidores afetam a atividade catalítica sem interferir na ligação do substrato! Muitos realizam ambos os processos
Inibição competitiva! Uma substância que compete diretamente com o substrato normal pelo sítio de ligação de uma enzima é um inibidor competitivo! Esse inibidor é semelhante ao substrato, mas difere-se dele por não poder reagir como ele
! O modelo geral para a inibição competitiva é dado pelo esquema de reação K 1 K 2 E + S ES " P + E + K -1 I K I EI + S " NÃO H O HÁ REAÇÃ ÇÃO
Neste caso,, presume-se se que I (inibidor( inibidor) liga-se reversivelmente à enzima e está em equilíbrio com ela K I = [E][I] / [EI] e EI (complexo( enzima-inibidor inibidor) ) é cataliticamente inativo Um inibidor competitivo reduz a concentração de enzima livre disponível para a ligação do substrato
A eq.. de MM para uma reação inibida competitivamente tem um termo adicional que se refere à fração de [E] T que liga a I para formar EI([E] T + [ES] + [EI]) v 0 = V máx [S] / αk M + [S] É a eq.. de MM modificada por um fator α, definido como α = 1 + [I] / k 1 a é uma função da concentração do inibidor e sua afinidade pela enzima, não pode ser menor do que 1. Uma concentração de substrato infinitamente grande pode sobrepujar os efeitos do inibidor
A presença de I faz com que a [S] pareça mais diluída do que realmente é.
KI pode ser medido! O rearranjo da eq.. v 0 = V máx [S] / αk M + [S] na forma dos duplos recíprocos resulta em 1/v 0 = (αk( M / V máx ) 1 / [S] + 1 / V máx O gráfico desta equação é linear e tem uma inclinação de αk M / V máx
O K I pode ser calculado pela determinação de valores de α em diferentes concentrações de inibidor para uma enzima de K M conhecido! A comparação dos valores de K I de inibidores competitivos com diferentes estruturas pode fornecer informações sobre as propriedades de ligação do sítio ativo de uma enzima e do seu mecanismo catalítico.! Os estudos de inibição competitiva também são utilizados para determinar a afinidade de análogos do estado de transição pelo sítio ativo de uma enzima! O estudo de inibidores é o carro-chefe chefe do desenvolvimento de drogas
Inibição não-competitiva! O inibidor liga-se diretamente ao complexo enzima- substrato, mas não à enzima livre K 1 K 2 E + S ES " P + E K 1 + I K I ESI " NÃO H O HÁ REAÇÃ ÇÃO Neste caso, a etapa de ligação do inibidor tem a constante de dissociação K I = [ES][I] / [ESI]
O inibidor não-competitivo não se assemelha ao substrato. Ele provavelmente distorce o sítio ativo, fazendo com que a enzima seja cataliticamente inativa. O gráfico consiste em linhas paralelas com inclinação de K M / V máx. Tanto K M como V máx são menores
O inibidor afeta a função catalítica da enzima, mas não sua ligação pelo substrato. Portanto, só é significativa em enzimas com múltiplos substratos
Inibição Mista Se tanto a enzima como o complexo enzima-substrato ligarem o inibidor, K 1 K 2 E + S ES " P + E + K 1 + I K I EI I K I ESI " NÃO H O HÁ REAÇÃ ÇÃO
Este inibidor liga-se aos sítios enzimáticos que participam tanto da ligação do substrato, como da catálise! As constantes de dissociação K I = [E][I] / [EI] e K I = [ES][I] / [ESI] não são necessariamente equivalentes Os valores de K M e V máx são modulados pela presença do inibidor. Tem características de ambos inibidores, competitivos e não-competitivos
No gráfico, as linhas para diferentes valores de [I] cruzam- se à esquerda do eixo 1/v 0. Quando k I =k I (α=α ), a interseção é no eixo 1/[S]
A inibição mista é uma característica importante na cinética de enzimas multissubstratos! A inativação irreversível assemelha-se se à inibição não competitiva.! O inibidor será um inativador! Os inativadores reduzem o nível efetivo da [E] T e portanto V máx para todos os valores de [S] sem alterar K M
Regulação da atividade enzimática! Um organismo deve poder regular as atividades catalíticas das suas enzimas,, a fim de coordenar seus processos metabólicos,, responder às mudanças do meio, crescer e diferenciar-se
Formas de regulação da atividade enzimática 1. Controle da disponibilidade da enzima! Velocidade de síntese e degradação 2. Controle da atividade da enzima! Alterações estruturais influenciam na afinidade da ligação do substrato! Ligação de pequenas moléculas efeitos alostéricos Enzimas alostéricas são amplamente distribuídas na natureza e tendem a ocupar posições chaves na regulação nas rotas metabólicas São proteínas simétricas que contém subunidades! Fosforilação ou desfosforilação de resíduos específicos