OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE CONCENTRAÇÃO DO ÁCIDO ALFA-LINOLÊNICO PROVENIENTE DO ÓLEO DE LINHAÇA POR MEIO DA FORMAÇÃO DE ADUTOS COM URÉIA

OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE CONCENTRAÇÃO DO ÁCIDO ALFA-LINOLÊNICO PROVENIENTE DO ÓLEO DE LINHAÇA POR MEIO DA FORMAÇÃO DE ADUTOS COM URÉIA Leandro Couto da Silva [PIBIQ/Fundação Araucária] 1, Marina Oliveira [PIBIQ/Fundação Araucária] 1, Clayton Antunes Martin [Orientador] 1, Jesuí Vergílio Visentainer [Colaborador] 2 1 Departamento de Tecnologia em Processos Químicos - COPEQ Universidade Tecnológica Federal do Paraná - UTFPR Rua Cristo Rei, 19 85902-490 - Toledo - PR 2 Departamento de Química Universidade Estadual de Maringá - Avenida Colombo, 5790 87020-900 Maringá PR leandro.c.s2@hotmail.com, nina.oliveiraa@hotmail.com, claytonmartin@utfpr.edu.br, jvvisentainer@uem.br Resumo - Um importante ácido da família ômega-3 é o alfa-linolênico (AAL), que é precursor dos ácidos eicosapentaenóico (EPA) e docosahexaenóico (DHA). Estes ácidos estão relacionados com a diminuição do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares. As principais fontes do AAL são as sementes de linhaça e perilla. Existem diversos métodos para concentrar o AAL, porém a complexação com uréia apresenta grande potencialidade, devido ao baixo custo e aos bons resultados. Assim, o objetivo do trabalho foi de concentrar o AAL proveniente do óleo de linhaça, utilizando o planejamento fatorial 2³ com ponto central, tendo como fatores: razão entre a massa de ureia e a massa de ésteres metílicos de ácidos graxos (A); temperatura de reação (B) e temperatura de cristalização (C). O modelo obtido (Y= 79.60-3.84B + 5.71C - 2.86AB + 2.36BC - 6.27B 2 + 4.20ABC) foi altamente significativo (p< 0,0001). O ponto ótimo para o AAL forneceu um valor de 85,63%. Esta condição corresponde ao valor de 2 para A, 57,8 o C para B e 25 o C para C. Nessa condição houve um aumento de 54,8 % no teor de AAL em relação ao óleo de linhaça. Somente os fatores B e C tiveram influência sobre a resposta. Palavras-chave: ácido alfa-linolênico; ômega-3; planejamento fatorial. Abstract - An important acid of omega-3 family is alpha-linolenic acid (ALA), a precursor of eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA). These acids are associated with decreased risk of developing cardiovascular diseases. The main sources of ALA are linseed and perilla There are several methods to concentrate the ALA but with urea complexation has great potential due to its low cost and good results. Thus, the objective was to concentrate the ALA from linseed oil, using the factorial design 2 ³ with central point, with the factors: weight ratio of urea and methyl esters of fatty acids (A), reaction temperature (B) and crystallization temperature (C). The polynomial model obtained (Y = 79.60-3.84B + 5.71C - 2.86AB 2.36BC + - + 6.27B2 4.20ABC) which was highly significant (p <0.0001). The optimal point for ALA provided a value of 85.63%. This condition corresponds to a value of 2 for A, 57.8 o C to B and 25 o C for C. In this condition there was an increase of 54.8% in content of ALA compared to the linseed oil. Only B and C factors influenced the response. Keywords: alpha-linolenic acid; omega-3; factorial design

INTRODUÇÃO Os ácidos graxos poliinsaturados (AGPI) são muito importantes para a nutrição humana e a prevenção de doenças. Estes são classificados em ômega-9 (ω-9), ômega-6 (ω-6) e ômega-3 (ω-3). O ácido α-linolênico (AAL) da família ω-3 é o precursor dos ácidos eicosapentaenóico (EPA) e docosahexaenóico (DHA), que são sintetizados pela ação de enzimas alongase e dessaturase. A ação dessas enzimas depende de vários fatores, tais como o envelhecimento, diabetes, alcoolismo, stress, ingestão elevada de gorduras trans, que contribuem para diminuir a produção destes ácidos graxos no organismo [1]. Ainda que em baixas concentrações estes ácidos são usados pelo corpo para prevenir doenças cardiovasculares, hipertensão, depressão, distúrbios inflamatórios e auto-imunes e certas alterações neurológicas [2]. As grandes fontes alimentares do AL são os óleos de soja, girassol e milho, e do AAL são os óleos de linhaça, canola, perilla e peixes de origem marinha. A semente de linho possui uma variação aproximada de 32 a 38% de óleo, denominado popularmente de óleo de linhaça, o qual apresenta em média teores elevados de AAL (44,6 a 51,5%), comparado com os principais ácidos graxos que constituem o óleo de linhaça, como o ácido oléico (ômega-9), com cerca de 19% e o ácido linoleico (15%).Sendo assim, o óleo de linhaça se torna uma das maiores fontes do AAL [3]. Existem diversos métodos para a concentração do AAL, como: cromatografia de adsorção, destilação molecular ou fracionada, divisão enzimática, extração por fluido supercrítico, transesterificação química e a formação de adutos de ureia [4]. A complexação com adutos de ureia é a forma mais simples e eficaz para a concentração de ácidos graxos. Esta é uma técnica bem estabelecida para a separação/eliminação de ácidos graxos saturados e monoinsaturados da fração lipídica. Inicialmente faz-se a esterificação dos ácidos graxos livres que existem no óleo de linhaça. Os ésteres são então misturados a uma solução de etanol e ureia, com proporções préestabelecidas para que haja a formação dos complexos de ureia. A fração lipídica saturada e monoinsaturada se complexa facilmente com a ureia, formando assim os cristais. Já a parte líquida é rica em ácidos graxos poli-insaturados [5]. Esta técnica tem as vantagens de que os complexos de adição com a ureia são extremamente estáveis, além de que é desnecessária a filtração à baixas temperaturas. O método também é favorecido devido ao fracionamento estar ligado à presença de ligações duplas e a sua configuração na estrutura do ácido graxo, não dependendo assim de propriedades físicas como ponto de ebulição ou solubilidade [5]. Considerando a importância fisiológica do AAL, já que este vem despertando grande interesse para a prevenção de diversas doenças, este trabalho teve como objetivo concentrar o AAL em óleo de linhaça, ajustando as condições necessárias para obter as maiores concentrações deste ácido. METODOLOGIA Purificação da uréia. A uréia foi recristalizada antes da realização dos experimentos, segundo método proposto por Voguel [6]. Esterificação dos lipídios. Foram pesados 15 g de óleo de linhaça em um balão de fundo chato, em seguida adicionou-se 50 ml de n-hexano e 30 ml de NaOH 2 mol L -1 em metanol. A mistura foi submetida a uma agitação vigorosa, durante um minuto, até a obtenção de solução levemente turva. Após a separação de fases, a superior contendo n-hexano e ésteres

metílicos de ácidos graxos, foi concentrada em evaporador rotativo. Os ésteres metílicos foram armazenados em freezer (-18 C) para posterior utilização [7]. Ensaios de recristalização dos ácidos graxos com a uréia. Para a preparação das misturas de ácidos graxos com a uréia foi utilizado um planejamento fatorial 2³ (dois níveis e três fatores) com ponto central, tendo como variáveis: razão de massa de uréia por massa de éster metílico (A), a temperatura de reação (B) e a temperatura de cristalização (C). Foram preparadas misturas contendo EMAG, ureia e etanol, com diferentes proporções entre a massa de ureia e a massa de ésteres metílicos de ácidos graxos (Fator A), para um volume de 150 ml de etanol, que foram aquecidas até temperaturas que variaram de 50 até 70 C (Fator B). Posteriormente, seguiram-se as condições estabelecidas pelo fator C para a cristalização. Foram realizados nove experimentos, sendo oito referentes ao planejamento fatorial e um ao ponto central (Tabela 2). Os experimentos foram realizados em quatro repetições, exceto para o ponto central, feito em seis repetições. Os adutos de uréia foram filtrados à vácuo, sendo lavados com n-hexano. O filtrado foi transferido para um funil de separação ao qual foram adicionados 60 ml de n-hexano e 30 ml de água destilada. Após a coleta da fase superior contendo somente os EMAG, foi realizada uma segunda extração, adicionando 50% dos volumes anteriores de n-hexano e água destilada. Em seguida a mistura de EMAG foi concentrada em evaporador rotativo, sendo armazenada a -18 C para posterior análise cromatográfica. Tabela 1. Condições dos experimentos em termos de variáveis reais e codificadas Experimento Massa (g) Temperatura ( C) Uréia/EMAG (A) Ureia EMAG Reação (B) Cristalização (C) 1 6,0 3,0 2,0-1* 50-1 25-1 2 12,0 3,0 4,0 1 50-1 25-1 3 6,0 3,0 2,0-1 70 1 25-1 4 12,0 3,0 4,0 1 70 1 25-1 5 6,0 3,0 2,0-1 50-1 -18 1 6 12,0 3,0 4,0 1 50-1 -18 1 7 6,0 3,0 2,0-1 70 1-18 1 8 12,0 3,0 4,0 1 70 1-18 1 9 9,0 3,0 3,0 0 60 0 5 0 *Considerando os níveis como: (-1) sendo o nível baixo, (1) o nível alto e (0) o ponto central de cada variável A, B e C. Análise Cromatográfica. Os ésteres metílicos de ácidos graxos foram separados em um cromatógrafo gasoso CP 3380 (Varian, Estados Unidos), equipado com coluna capilar de sílica fundida CP 7420 (100 m x 0,25 mm x 0,39 μm de cianopropil polisiloxano) e detector de ionização em chama. A temperatura inicial da coluna foi de 185 o C por 5 min, sendo elevada a 225 o C à taxa de 15 o C min -1, permanecendo nesta temperatura por 15 min. As temperaturas do injetor e detector foram 240 C. O volume injetado foi de 2,0 μl. As velocidades de fluxo dos gases foram 1,4 ml min -1 para o gás de arraste (H 2 ); 30 ml min -1 para o gás auxiliar (nitrogênio); 30 e 300 ml min -1 para os gases da chama, hidrogênio e ar sintético, respectivamente. A razão de divisão da amostra foi 1/100. As áreas dos picos foram determinadas através do software Workstation versão 5.0 (Varian).

Identificação dos ésteres metílicos. A identificação dos ésteres metílicos de ácidos graxos foi baseada na comparação dos seus tempos de retenção com o de misturas padrão de ésteres metílicos obtidas da Sigma (EUA) e por co-eluição de padrões com a amostra. RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram identificados e quantificados cinco ácidos graxos obtidos do óleo de linhaça, sendo: o palmítico (16:0) com teor de 5,8%, esteárico (18:0) com 4,6%, oléico (18:1n-9) cujo teor foi 19,8%, linoléico (18:2n-6) com 14,5%, e em maior concentração o alfa-linolênico (18:3n-3) 55,3%. Na Tabela 2 são apresentados os valores da concentração média do AAL, obtidos a partir dos experimentos desenvolvidos. A maior concentração de AAL foi alcançada no experimento 2 com os ácidos oléico e linoléico tendo os teores de 1,4% e 16,1%, respectivamente. Para este experimento não foi observada a presença de ácidos graxos saturados na fração solúvel dos EMAG. Tabela 2. Teor de AAL obtido para os experimentos do planejamento fatorial com os EMAG do óleo de linhaça Experimento Fatores A B C Teor de AAL 1-1 -1-1 66,33 ± 0,86 a 2 1-1 -1 81,38 ± 1,47 3-1 1-1 69,51 ± 3,47 4 1 1-1 60,41 ± 5,87 5-1 -1 1 78,14 ± 1,80 6 1-1 1 78,55 ± 5,31 7-1 1 1 79,16 ± 2,08 8 1 1 1 80,05 ± 4,33 9 0 0 0 78,43 ± 3,79 a Teor médio de AAL ± desvio padrão Análise de Variância do modelo obtido. Com base nos resultados obtidos na tabela 2 foi possível realizar a análise de variância (ANOVA) do modelo, o que possibilitou verificar a influência das variáveis estudadas no planejamento bem como as interações entre as mesmas. Inicialmente foi realizada a ANOVA considerando também os termos A e AC no modelo, o que resultou em um coeficiente de determinação (R²) de 0,9572. Como estes termos não foram significativos (p > 0,05) para o modelo, foi realizada a sua exclusão efetuando-se uma nova análise de variância, cujo valor de R 2 foi 0,9517. Por meio deste procedimento foi possível determinar a falta de ajuste, que não foi significativa (p > 0,05) para o modelo obtido, indicando que não ocorreu a falta de ajuste.

Tabela 3 Análise de variância (ANOVA) do planejamento fatorial 2 3 e ponto central para o AAL Efeitos Soma dos Grau de Media Valor Prob>F Quadrados Liberdade Quadrática F Modelo 1723,67 6 287,28 78,87 < 0,0001 B 358,78 1 358,78 98,49 < 0,0001 C 815,72 1 815,72 223,93 < 0,0001 AB 203,68 1 203,69 55,92 < 0,0001 BC 135,96 1 135,96 37,32 < 0,0001 B 2 163,68 1 163,68 44,94 < 0,0001 ABC 439,55 1 439,55 120,67 < 0,0001 Resíduo 87,42 24 3,64 Falta de ajuste 9,95 2 4,97 1,41 0,2648 Erro Puro 77,47 22 3,52 Total 1811,10 30 R 2 0,9517 Através do planejamento fatorial obteve-se um modelo (1) altamente significativo (p < 0,0001), que representa os efeitos principais e a interação das variáveis de controle na sua forma codificada, onde Y é o teor de AAL, A representa a massa de uréia/massa de ésteres metílicos, B é a temperatura de reação e C a temperatura de cristalização. Y = 79,60 3,84B + 5,71C 2,86AB + 2,36BC 6,27B 2 + 4,20ABC (1) O gráfico de superficie de resposta (figura 1) descreve o efeito das variáveis A (massa de uréia/massa de esteres metílicos), e B (temperatura de reação). Conforme se observa na superficie de resposta, o maior valor alcançado quando A está no nível baixo e o fator B está entre 0 e -0,5. Quando o fator B está em seu nível alto e o fator A passa do nível baixo para o alto, ocorre um aumento de 76,22% para 78,90% na concentração de AAL, o que corresponde a um aumento de 3,52%. Quando a análise é feita avaliando o fator B em seu nível baixo e A passa do nível baixo para o alto, ocorre uma diminuição na concentração de AAL de 81,86% para 79,18%, o que representa uma queda de 3,38% no rendimento. Ao avaliar a resposta quando B é mantido constante em seu ponto ótimo (-0,22) e o fator A passa do nível baixo para o alto, há uma queda na resposta de 0,69%, passando de 85,63% para 85,04%, o que representa uma variação muito pequena. Esta condição indica que o fator A exerce pouca influência sobre a resposta obtida, conforme observado na ANOVA onde o fator A não foi significativo (p>0,05). Foi observado que o fator B (temperatura da reação) influenciou de forma significativa (p<0,05) a concentração de AAL. Para temperatura de 70 ºC foi observado menor rendimento, e isto está associado com a elevada pressão de vapor do etanol nesta temperatura, o que favorece a diminuição do volume do solvente devido a vaporização. Na temperatura de 50 ºC a solubilidade da uréia em etanol é de 12,5g/150 ml de solvente [8]. Embora as quantidades de uréia sejam bem diferentes nos níveis alto (12g/150 ml de etanol) e baixo (6g/150 ml de etanol) do fator A, e a solubilidade da uréia seja mais crítica no nível alto, não houve influência sobre a concentração de AAL. Isso pode ser explicado pelo fato de no nível alto de A haver uma maior razão entre a uréia e os EMAG, o que a despeito da dificuldade de solubilização da uréia, atua aumentando a probabilidade de formação de adutos com a uréia envolvendo EMAG saturados.

Figura 1 Superfície de resposta para as variáveis A e B, C=1. Para a superficie de resposta da figura 2, onde são analisados os efeitos das variáveis B e C, a região que apresenta a maior resposta se encontra no intervalo entre 0 e -0,5 para o fator B e no nível alto de C. Ao analisar os efeitos dos fatores para verificar a sua influência na resposta, é possível verificar para o caso do fator B permanecer constante em seu nível alto e o fator C variar do nível baixo para o nível alto, que a resposta varia de 68,48% para 76,22%, o que representa um aumento de 11,3%. Quando se mantém o fator B em seu nível baixo e o fator C passa de baixo para alto, a resposta varia de 66,76% para 81,86%, o que representa um aumento de 22,61%. Quando a análise é feita mantendo-se o fator C constante no nível baixo e variando B do nível baixo para alto, a resposta tem uma variação baixa, passando de 66,76% para 68,48%, correspondendo a um aumento de 2,57%. Por outro lado, quando se mantém o fator C constante no nível alto e ocorre a variação de B do nível baixo para alto, ocorre uma queda considerável na resposta, que passa de 81,86% para 76,22%, o que representa a diminuição de 7,4% na resposta. Analisando-se a resposta quando o fator B é mantido constante no seu ponto ótimo (-0,22) e o fator C passa do nível baixo para alto, a resposta tem um acréscimo de 14,3%, passando de 73,39% para 85,63%. O nível alto de C está relacionado com um resfriamento mais lento, pois a mistura permanece a 25 ºC. No níveis intermediário (5 o C) e baixo (-18 o C) o resfriamento foi mais rápido, considerando que pouco tempo após completar a solubilização da uréia e dos EMAG, as misturas foram colocadas em sistemas refrigerados que estavam nestas temperaturas. A uréia pura cristaliza em uma estrutura tetragonal com canais de 5,67 Å de diâmetro. Na presença de moléculas de cadeia longa a uréia cristaliza em uma estrutura hexagonal, formando canais de 8 a 12 Ǻ de diâmetro. Os canais são suficientes para acomodar compostos de cadeia alifática com números de carbono maior do que seis. A presença de insaturações na cadeia carbônica com a configuração cis aumenta o volume ocupado pela molécula, diminuindo a probabilidade de inserção dos compostos nos canais dos cristais de uréia, o que permite o fracionamento de misturas de ácidos graxos [2]. Quando a etapa de resfriamento da mistura de uréia e ésteres metílicos de ácidos graxos é mais lenta a seletividade do fracionamento é aumentada devido a menor formação de cristais tetragonais de uréia, cujos canais não contêm moléculas de ésteres metílicos de acidos graxos [10].

Figura 2 Superfície de resposta para as variáveis B e C, A=-1. Determinação do ponto ótimo. A determinação do ponto ótimo foi realizada utilizando o método SIMPLEX através do próprio software utilizado para realizar o planejamento experimental, que forneceu 27 soluções que apresentaram os maiores níveis de concentração de ácido alfa linolênico. Das soluções apresentadas a que forneceu a maior resposta foi de 85,63, que corresponde aos valores de -1 para A, -0,22 para B e 1 para C, em termos de variáveis codificadas, e 2, 57,8 ºC e 25 ºC, respectivamente, em termos de variáveis reais. CONCLUSÕES O modelo obtido para o AAL teve uma boa adequação. O ponto ótimo para o AAL forneceu um valor de 85,63. Esta condição corresponde ao valor de 2 para o fator A, 57,8 o C para fator B e 25 o C para fator C. Nessa condição houve um aumento de 54,8 % no teor de AAL em relação ao óleo de linhaça. A metodologia de planejamento fatorial foi adequada para a otimização da concentração do AAL. Nesse sentido, foi possível verificar que somente os fatores B (temperatura de reação) e C (temperatura de cristalização) tiveram influência sobre a resposta. Considerando a incorporação do AAL em alimentos para aumentar a ingestão diária de ácidos graxos ômega-3, é possível constatar que quanto maior for a concentração deste ácido em uma mistura contendo outros ácidos, menor será a quantidade de lipídios a ser incorporada ao alimento, o que constitui uma condição extremamente desejável do ponto de vista nutricional. Dessa forma, os estudos sobre a concentração do AAL contribuem de modo importante para alcançar este objetivo. AGRADECIMENTOS À Fundação Araucária pela concessão da bolsa de Iniciação científica. REFERÊNCIAS [1] MARTIN, C. A.; ALMEIDA V. V,; RUIZ, M. R; VISENTAINER, J. E. L.; MATSHUSHITA, M.; SOUZA, N. E.; VISENTAINER, J. V. Ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e ômega-6: importância e ocorrência em alimentos. Revista de nutrição. Campinas, v. 6, n. 19, p. 761-770, nov./dez. 2006.

[2] HAI-BO, G., MA, X., WU, J., ZHANG, Q., YUAN, W., CHEN Y. (2009), Concentration of alpha-linolenic acid of perilla by gradient cooling urea inclusion. Agricultural Sciences in China, 8, 685, 2009. [3] CEOTTO, B. O que é que a linhaça tem. Dentro das sementes da planta que dá origem ao linho há componentes que equilibram os hormônios femininos e reforçam as defesas do corpo. Revista da Saúde. Campinas. v. 23, n. 3, p. 37-40, 2000. [4] WANASUNDARA, Udaya N.; SHAHIDI, Fereidoon. Concentration of omega 3- polyunsaturated fatty acids of seal blubber oil by urea complexation: optimization of reaction conditions. Food Chemistry, Canadá, n. 65 p. 41-49, 1999. [5] WU, M., DING, H., WANG, S. e XU, S. Optimizing Conditions for the Purification of Linoleic Acid from Sunflower Oil by Urea Complex Fractionation. J Am Oil Chem Soc. China, n. 85 p. 677-684, 2008. [6] VOGEL, Arthur I.; Química Orgânica Análise Orgânica Qualitativa. 3ª ed., Rio de Janeiro: Ao Livro Técnico, 1987. [7] ISO - International Organization for Standardization. Animal and vegetable fats and oils preparation of methyl esters fatty acids, ISO, Geneve, Method ISO 5509, p. 1-6, 1978. [8] HAYES, Douglas G.; BENGTSSON, Ylva C.; ALSTINE, James M.; SETTERWALL, Fredrik; Urea complexation for the rapid, ecologically responsible fractionation of fatty acids from seed oil. The Journal of the American Chemists Society. Champaign. V. 75, n. 10, p. 1404, jun. 1998. [9] LEE, Fu-Ming; LAHTI, Leslie E. Solubility of Urea in Water-Alcohol Mixtures. Journal of Chemical and Engineering Data. University of Toledo, Ohio, EUA. v. 17, n. 3, p. 304-306, 1972. [10] HAYES, Douglas G.; BENGTSSON, Ylva C.; ALSTINE, James M.; SETTERWALL, Fredrik; Urea complexation for the rapid, ecologically responsible fractionation of fatty acids from seed oil. The Journal of the American Chemists Society. Champaign. V. 75, n. 10, p. 1404, jun. 1998.