UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ - UNOCHAPECÓ Área de Ciências da Saúde Curso de Graduação em Farmácia.

UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ - UNOCHAPECÓ Área de Ciências da Saúde Curso de Graduação em Farmácia Daniela Dalazen AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE DE ISOLADOS CLÍNICOS ORAIS E VULVOVAGINAIS DE Candida spp. AOS ANTIFÚNGICOS ANFOTERICINA B, FLUCONAZOL E MICONAZOL Chapecó SC, 2010.

DANIELA DALAZEN AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE DE ISOLADOS CLÍNICOS ORAIS E VULVOVAGINAIS DE Candida spp. AOS ANTIFÚNGICOS ANFOTERICINA B, FLUCONAZOL E MICONAZOL Monografia de Conclusão de Curso apresentada à Unochapecó como parte dos requisitos para obtenção do grau de bacharel em Farmácia. Orientadora: Profa. Msc. Nelci Lopes da Silva Co-orientador: Prof. Dr. Alexandre Meneguelo Fuentefria Chapecó SC, jun. 2010.

BANCA EXAMINADORA NELCI LOPES DA SILVA Farmacêutica-Bioquímica, Mestre em Farmacologia Professora UNOCHAPECÓ MARINEZ AMABILE ANTONIOLLI Farmacêutica-Bioquímica, Mestre em Ciências dos Alimentos Professora UNOCHAPECÓ RENATA C. DE ALMEIDA Farmacêutica, Farmácia Escola UNOCHAPECÓ

DEDICATÓRIA Aos meus pais Dirceu e Ivani, pelo incentivo, cooperação e apoio dedicado a mim.

AGRADECIMENTOS Nada mais importante do que agradecer... A Deus, por pegar na minha mão e guiar meus passos, por ser meu mestre, por me confortar... Aos pais, Dirceu e Ivani Dalazen, agradeço pela família maravilhosa, pela educação, pelos bons exemplos de dignidade e perseverança, pelo incentivo, pelos sacrifícios... Vocês são a minha fonte, obrigada por tudo. Às irmãs, Talita e Ezaquiela, obrigado pela amizade, pelo incentivo e companheirismo... Ao sobrinho Davi, obrigado pelos momentos felizes que você proporciona... Ao namorado Anderson, obrigado pelo carinho, companheirismo e apoio... Aos professores, obrigado pelo ensino e dedicação... Aos amigos, que cresceram comigo, obrigada pelas lembranças boas que carrego, e pela amizade que persiste. Aos que conquistei durante a graduação, obrigada por estarem comigo. Juntos lutamos e conseguimos.

Apesar dos nossos defeitos, precisamos enxergar que somos pérolas únicas no teatro da vida e entender que não existem pessoas de sucesso e pessoas fracassadas. O que existem são pessoas que lutam pelos seus sonhos ou desistem deles. Augusto Cury

RESUMO Nos últimos anos, o oportunismo das leveduroses vem se tornando cada vez mais recorrente e de difícil tratamento, em virtude principalmente da emergência de novas espécies bem como devido à diminuição da susceptibilidade aos antifúngicos. O sucesso do tratamento das infecções causadas por Candida depende cada vez mais do conhecimento da espécie causadora e do seu perfil de sensibilidade aos antifúngicos. Este estudo teve por objetivo realizar uma investigação do perfil de susceptibilidade de amostras de candidíase oral e vulvovaginal, de pacientes do oeste de Santa Catarina, aos antifúngicos anfotericina B, fluconazol e miconazol. A susceptibilidade de 60 cepas de Candida spp. foram avaliadas frente aos antifúngicos. As determinações das concentrações inibitórias mínimas e concentrações fungicidas mínima foram realizadas com base no documento M27-A2 do CLSI. No estudo foi observado um alto índice de resistência para o fluconazol e para a anfotericina B. O miconazol foi o antifúngico que demonstrou maior eficácia sobre as cepas testadas. As cepas de origem oral apresentaram maior sensibilidade aos antifúngicos, enquanto que as de origem vaginal demonstraram um perfil de resistência maior. Os dados desta pesquisa são semelhantes ao encontrado por outros autores. As amostras da região oeste do estado de Santa Catarina demonstraram uma baixa susceptibilidade aos antifúngicos testados, o que sugere uma alta taxa de recidivas nas infecções e alerta para a emergência de cepas com resistência adquirida. O teste de suscetibilidade aos antifúngicos deveria ser realizado na rotina laboratorial para fornecer dados para a escolha do tratamento da candidíase oral e vaginal, se não em todos os casos, pelo menos naqueles pacientes que apresentam falha terapêutica e/ou recidivas. Palavras-chave: Candida, antifúngicos, perfil de susceptibilidade.

ABSTRACT In recent years, the opportunism of yeast infections is becoming more and more recurrent and difficult to treat, mainly due to the emergence of new species as well as due to decreased susceptibility to antifungal agents. The successful treatment of infections caused by Candida is increasingly dependent on knowledge of the causative species and its susceptibility profile to antifungals. This study aimed to conduct an investigation of the susceptibility profile of samples of oral and vulvovaginal candidiasis in patients of western Santa Catarina, to the antifungals amphotericin B, fluconazole and miconazole. An assessment of the susceptibility of 60 strains of Candida spp. to the antifungal agent was performed. The determination of minimum inhibitory concentrations and minimal fungicidal concentrations were based on document M27-A2 of the CLSI. This study observed a high rate of resistance to fluconazole and amphotericin B. The miconazole antifungal was significantly more effective on the strains tested. The strains of oral origin showed greater sensitivity to antifungal agents, while those from vaginal demonstrated a greater resistance profile. Data from this study are similar to that found by other authors. Samples from the western state of Santa Catarina showed a low susceptibility to antifungal agents tested, suggesting a high rate of relapses in infections and alert to the emergence of strains with acquired resistance. The antifungal susceptibility test should be performed routinely in the laboratory to provide data to the choice of treatment for oral and vaginal candidiasis, if not in all cases, at least in those patients with treatment failure and / or relapse. Keywords: Candida, antifungal agents, susceptibility profiles.

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 8 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA... 10 2.1 Infecções Fúngicas... 10 2.2 Gênero Candida... 11 2.2.1 Aspectos Gerais... 11 2.2.2 Candida albicans... 11 2.2.3 Candida tropicalis... 12 2.2.4 Candida krusei... 12 2.2.5 Candida glabrata... 13 2.2.6 Candida dubliniensis... 13 2.2.7 Candida parapsilosis... 13 2.3 Candidíase... 14 2.3.1 Candidíase oral... 14 2.3.2 Candidíase vulvovaginal... 15 2.3.3 Candidíase sistêmica... 16 2.3.4 Candidíase cutânea... 16 2.4 Agentes Antifúngicos... 17 2.4.1 Anfotericina B... 18 2.4.2 Fluconazol... 19 2.4.3 Miconazol... 20 2.5 Resistência Antifúngica... 20 3 MÉTODOS... 22 3.1 Amostra... 22 3.2 Procedimento... 22 3.3 Antifungigrama... 22 3.4 Análise e Interpretação dos Resultados... 27 4 RESULTADOS... 28 5 DISCUSSÃO... 33 6 CONCLUSÃO... 35 7 REFERÊNCIAS... 36 8 APÊNDICE... 41

1 INTRODUÇÃO O gênero Candida pertence ao Reino Fungi, grupo Eumycota, filo Deuteromycota, classe Blastomycetes e faz parte da família Criptococcacea (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). As principais espécies de interesse clínico neste gênero são Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis, entretanto outras espécies emergentes deste gênero tem sido isoladas em diversos casos de candidíase e candidemias (CARDOSO, 2004). As leveduras do gênero Candida sp. colonizam como agentes comensais a cavidade bucal de cerca de 30% a 35% da população adulta sem evidência de infecção. A candidíase da mucosa oral, também chamada de estomatite cremosa ou sapinho, caracteriza-se pelo aparecimento de placas brancas, isoladas ou confluentes, aderentes à mucosa, com aspecto membranoso, às vezes rodeada por halo eritematoso (DONGARI-BAGTZOGLOU et al., 2009). Os principais fatores relacionados à candidiase oral é a infecção pelo HIV, má-higiene de prótese dentária e aparelhos ortodônticos, e outras patologias imunossupressoras (RODRIGUES et al., 2007). A candidíase vulvovaginal ocorre principalmente nas mulheres que estão entre a puberdade e a menopausa. Caracteriza-se por lesões na vulva e na vagina, com presença de prurido, ardência e corrimento vaginal de cor branca (ANDRIOLI et al., 2009). É encontrada principalmente em pacientes grávidas, diabéticas, que receberam terapêutica antimicrobiana prolongada, ou que fazem uso de contraceptivos orais (HOLANDA et al., 2007). Estima-se que cerca de 75% das mulheres adultas apresentem pelo menos um episódio de vulvovaginite fúngica em sua vida, e que 20 a 25% das mulheres saudáveis e assintomáticas apresentam culturas positivas para leveduras (FERRAZA et al., 2005). A candidíase vulvovaginal, juntamente com a candidíase oral, são consideradas as duas formas mais comuns de infecções fúngicas oportunistas, e a transformação da condição assintomática para a sintomática indica uma transição da forma saprófita para a forma patógena (RODRIGUES et al., 2007; PIROFSKI; CASADEVALL, 2009). Numerosos estudos indicavam que C. albicans é mais frequente do que as espécies não-albicans, respondendo por 80 a 90% dos casos. Entretanto, nos últimos anos, tem-se observado um aumento expressivo na frequência das espécies não-albicans, principalmente C. glabrata, C. tropicalis e C.

9 guillermondi, indicando uma tendência de mudança na etiologia da candidíase, após décadas de predomínio de C. albicans (HOLANDA et al., 2007; COLOMBO; GUIMARÃES, 2003; CROCCO et al., 2004). Além desse aumento na incidência das infecções fúngicas, as diferentes espécies de Candida spp. tem-se demonstrado mais virulentas e menos susceptíveis aos antifúngicos, o que tem dificultado a terapia antifúngica e tornado os casos de infecções mais graves (CROCCO et al., 2004). Diversos antifúngicos têm sido indicados no tratamento de candidíase oral e vaginal, no entanto, a literatura tem demonstrado a ocorrência de cepas com sensibilidade diminuída e outras resistentes in vivo e in vitro a determinados quimioterápicos (CANDIDO; AZEVEDO; KOMESU, 1999). A introdução dos antifúngicos azólicos representou um grande avanço no tratamento das infecções fúngicas, porém seu amplo emprego como profilaxia por pacientes imunocomprometidos, como no tratamento de infecções por leveduras tem favorecido a seleção de cepas resistentes aos antifúngicos, principalmente por espécies de C. não-albicans (RODRIGUES et al., 2007). Por sua vez, o perfil de sensibilidade de Candida spp. aos antifúngicos difere, o que torna fundamental a identificação do agente etiológico causador da candidíase antes de iniciar a terapêutica empírica, bem como a realização do antifungigrama para determinar a sensibilidade do agente (LINARES et al., 2005). Devido à importância clínica desse tema e, sobretudo a ausência de estudos sobre a avaliação do perfil de susceptibilidade em amostras de Candida oral e vulvovaginal no estado de Santa Catarina surgiu a ideia de estudar o perfil de susceptibilidade de cepas de Candida spp. aos antifúngicos. Portanto, o presente estudo teve por objetivo realizar uma investigação do perfil de susceptibilidade de amostras de candidíase oral e vulvovaginal aos antifúngicos anfotericina B, fluconazol e miconazol, no qual foi avaliado qual a espécie de Candida sp. mais susceptível aos antifúngicos e qual o antifúngico com maior espectro de ação sobre as diferentes espécies de Candida. Para a realização do estudo foi utilizada a metodologia de diluição em caldo, baseando-se no documento M27-A2 do CLSI.

10 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1 Infecções Fúngicas Os fungos são microorganismos muito diferenciados, são seres vivos eucarióticos (comportam o DNA circulado por envoltório nuclear), podem ser unicelular ou pluricelular, possuem mitocôndrias e retículo endoplasmático no citoplasma e esteróis de membrana celular. Suas paredes celulares são constituídas de um polímero contendo ergosterol. Durante várias décadas os fungos foram considerados vegetais (Reino Plantae), hoje estão classificados no Reino Fungi (GOMPERTZ et al., 2004-2005). A maioria dos fungos não é primariamente patogênico para o homem, embora todos tenham potencial para invasão. Clinicamente, os fungos se classificam em patogênicos (infectam o hospedeiro hígido) e oportunistas (raramente causam infecção, a menos que as defesas do hospedeiro estejam diminuídas) (GOMPERTZ et al., 2004-2005). As leveduras são fungos oportunistas responsáveis pela maior parte das infecções fúngicas nos seres humanos. Durante as últimas décadas a incidência de infecções causadas por leveduras em humanos sofreu um grande aumento. O gênero Candida é o principal e o maior causador de infecções fúngicas leveduriformes, nesse caso denominadas candidíases (CARDOSO, 2004). Segundo Cardoso (2004), os fatores predisponentes a essas infecções incluem uso prévio de antibióticos de amplo espectro (suprimindo a microbiota competidora), neutropenia, deficiência da imunidade celular, como ocorre na síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), uso prolongado de corticosteróides e outros imunossupressores, quimioterapia do câncer e linfomas, altas concentrações de estrógenos pelo uso de contraceptivos orais ou gravidez e diabetes mellitus.

11 2.2 Gênero Candida 2.2.1 Aspectos Gerais Cerca de 200 espécies de Candida são conhecidas e classificadas como pertencentes ao Reino Fungi e divisão Eumycota. A maioria das espécies é classificada na subdivisão Deuteromycotina, enquanto algumas espécies são da subdivisão Ascomycotina (LEÃO RIBEIRO et al., 2004). As leveduras de Candida possuem blastoconídeos globosos, ovóides, cilíndricos, alongados e raramente triangulares no estado saprofítico (na forma leveduriforme), estando associado à colonização assintomática; já em processos patogênicos apresentam pseudo-hifas e hifas verdadeiras (forma filamentosa). A reprodução na maioria das vezes é por brotamento multipolar. Candida albicans e Candida dubliniensis apresentam clamídiosporos em condições apropriadas (GOMPERTZ et al., 2004-2005). Este fungo apresenta como principais fatores de virulência a aderência, dimorfismo (formação de micélio), variabilidade fenotípica ( switching ), produção de toxinas e enzimas extracelulares (LEÃO RIBEIRO et al., 2004). De acordo com Crocco (2004), a Candida albicans é o patógeno mais comum nas candidíases cutâneas e da orofaringe, porém outras espécies têm aumentado em número e importância nas candidíases vaginal e sistêmica. 2.2.2 Candida albicans Candida albicans é a espécie mais frequentemente isolada de infecções superficiais e invasivas em diferentes sítios anatômicos e em casuísticas de toda parte do mundo (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). Esta levedura é um organismo comensal estando presente no ser humano sem causar infecções, coexistindo com o hospedeiro. Pode colonizar o trato intestinal, oral, vaginal, respiratório, urinário, etc. Em pacientes imunocomprometidos pode causar sérias infecções nas mucosas, que incluem candidíases vaginais e infecções orais ou sistêmicas (CARDOSO, 2004).

12 A candidíase oral causada por C. albicans é muito comum em pessoas idosas que usam próteses dentárias. Embora as infecções nas mucosas sejam a forma de doença mais comum, as infecções sistêmicas causadas por essa levedura aumentaram particularmente em doentes com o sistema imunitário comprometido, como os infectados com o vírus HIV (CARDOSO, 2004). Trata-se de uma levedura com potencial patogênico bastante conhecido, apresentando como principais fatores de patogenicidade e virulência a capacidade de aderência a diferentes mucosas e epitélios, o dimorfismo com produção de estruturas filamentosas que auxiliam a invasão tissular, a termotolerância significativa, e a produção de enzimas como proteinases e fosfolipases (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). 2.2.3 Candida tropicalis No homem essa espécie de Candida é isolada da cavidade oral, do intestino, da vagina, das fezes e urina, depois da C. albicans é considerada a Candida mais frequentemente isolada e mais virulenta (VIDOTTO, 2004). Possui considerável potencial biológico como agente oportunista quando o hospedeiro encontra-se neutropênico, quando há supressão da flora bacteriana pelo uso de antimicrobianos e danos na mucosa gastrointestinal. A C. tropicalis tem sido relatada como o segundo agente etiológico mais comum de candidemia em pacientes com neoplasias, sendo sua frequência maior em leucemias e menor em tumores sólidos. Os isolados clínicos desta espécie são sensíveis a anfotericina B e, na grande maioria das vezes, aos triazólicos (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). 2.2.4 Candida krusei Ela é considerada uma levedura de fraca patogenicidade. Em humanos é isolada do esôfago, peritônio, sangue, trato urinário e respiratório, vagina, úlceras gástricas, queimaduras, unhas e fezes (VIDOTTO, 2004). Frequentemente é isolada de pacientes imunodeprimidos com diversas formas de neoplasias, leucemias ou submetidos a transplantes, e de pacientes com

13 AIDS. O aumento da colonização de C. krusei nesses últimos pacientes está ligado à profilaxia com fluconazol, uma vez que essa espécie se demonstrou resistente a este fármaco (VIDOTTO, 2004). 2.2.5 Candida glabrata Segundo Colombo e Guimarães (2003), a C. glabrata constitui a terceira espécie mais comum de candidemia relatadas nos EUA e Europa. É uma das leveduras mais comumente associadas às infecções fúngicas humanas, com consequentes micoses superficiais e sistêmicas. No homem é isolada do sangue, urina, vagina, cavidade oral e fezes (VIDOTTO, 2004). Isolados clínicos de C. glabrata apresentam menor sensibilidade ao fluconazol. Consequentemente um aumento nos índices de colonização/infecção por C. glabrata tem sido observado em grupos de pacientes expostos prolongadamente ao fluconazol (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). 2.2.6 Candida dubliniensis Identificada pela primeira vez em 1995, está normalmente associada à colonização oral e a infecções em doentes com AIDS. No entanto foi também isolada de indivíduos saudáveis, do trato oral, intestinal, vaginal, respiratório e urinário (CARDOSO, 2004). É fenotipicamente semelhante a C. albicans, porém é menos patogênica, mas tem maior facilidade em desenvolver resistência a azólicos. Atualmente ainda são raros os casos de doenças sistêmicas relacionadas a essa espécie, sendo a maior parte dos casos associadas à mucosa oral (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). 2.2.7 Candida parapsilosis Isolada frequentemente de secreções das vias respiratórias, do sangue, da vagina, das unhas e da pele. Os casos de candidíase atribuíveis a esta levedura são

14 cerca de 5-10%, mas esse número tem aumentado principalmente em pacientes imunodeprimidos com AIDS e leucemias. Também tem-se demonstrado virulenta em infecções vaginais (VIDOTTO, 2004). Sua ocorrência é maior em crianças e recém-nascidos prematuros internados em unidades de terapia intensiva, onde a prevalência de candidemias por C. parapsilosis é de 17 a 50% dos casos (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). Isolados clínicos desta espécie são sensíveis a anfotericina B e aos triazólicos (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). 2.3 Candidíase A candidíase, também denominada de candidose, é a infecção causada por fungos do gênero Candida spp, e ocorre quando há um desequilíbrio entre os mecanismos de defesa do hospedeiro e a microbiota autóctone, isto é, do comensalismo à doença fatal (CROCCO et al., 2004). As infecções por Candida apresentam diferentes manifestações dependendo do local que infectam. 2.3.1 Candidíase oral A candidíase oral é uma infecção fúngica oportunista freqüente, causada por uma proliferação ou infecção da cavidade bucal por leveduras do gênero Candida, observada principalmente na primeira infância, senescência e em pacientes imunocomprometidos. Sendo que cerca de 30% a 35% da população adulta apresenta como agentes comensais sem evidência de infecção (DONGARI- BAGTZOGLOU et al., 2009) A candidíase da mucosa oral, também chamada de estomatite cremosa ou sapinho, caracteriza-se pelo aparecimento de placas brancas, isoladas ou confluentes, aderentes à mucosa, com aspecto membranoso, às vezes rodeadas por halo eritematoso. É mais frequente em pacientes gravemente enfermos e em recémnascidos quando se associa à candidíase da mucosa vaginal da mãe (GOMPERTZ et al., 2004-2005).

15 Os principais fatores relacionados à infecção oral é o advento da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), má-higiene de prótese dentária e aparelhos ortodônticos, e outras patologias imunossupressoras (RODRIGUES et al., 2007). 2.3.2 Candidíase vulvovaginal A candidíase vulvovaginal (CVV) é um processo infeccioso do trato geniturinário inferior feminino, que compromete principalmente vulva e vagina e desenvolve-se em decorrência de infecção por leveduras, as quais podem ser habitantes normais dessas mucosas (ANDRIOLI et al., 2009; FERRAZA et al., 2005) Essa infecção caracteriza-se por prurido, ardor, dispareunia e pela eliminação de um corrimento vaginal em grumos, semelhante à nata de leite. Com frequência, a vulva e a vagina encontram-se edemaciadas e hiperemiadas, algumas vezes acompanhadas de ardor ao urinar e sensação de queimadura. As lesões podem se estender pelo períneo, região perianal e inguinal. Em casos típicos, nas paredes vaginais e no colo uterino aparecem pequenos pontos branco amarelados (ALVARES; SVIDZINSKI; CONSOLARO, 2007). Geralmente a CVV se desenvolve quando o ph vaginal diminui devido ao aumento da quantidade de glicogênio, principalmente no período pré-menstrual. Outros fatores considerados predisponentes para o desenvolvimento de CVV incluem diabete melito e uso de antibióticos de largo espectro, de corticóides e de anticoncepcionais orais. A gravidez, hábitos higiênicos e vestuário inadequado, como roupas muito justas ou de fibras sintéticas também contribuem para o aparecimento da CVV (ANDRIOLI et al., 2009). Segundo Ferraza et al., (2005) cerca de 75% das mulheres adultas apresentem pelo menos um episódio de vulvovaginite fúngica em sua vida, sendo que destas 40 a 50% vivenciam novos surtos e em 5% a candidíase torna-se recorrente. Por outro lado 20 a 25% das mulheres saudáveis e assintomáticas apresentam culturas positivas para leveduras. A condição de CVV recorrente é definida quando são diagnosticados pelo menos quatro episódios durante um ano, enquanto as vaginites de repetição ocorrem esporadicamente, com menos de três ao ano. A transmissão sexual tem

16 sido citada como fator importante na reincidência da doença (ANDRIOLI et al., 2009). No homem a balanite, infecção na glande causada por Candida, é considerada sexualmente adquirida (GOMPERTZ et al., 2004-2005). 2.3.3 Candidíase sistêmica A candidíase sistêmica é uma infecção potencialmente fatal, que pode comprometer vísceras como resultado de disseminação hematogênica da levedura pelo organismo. Ocorre principalmente em indivíduos debilitados, indivíduos com câncer, indivíduos sob tratamento com corticosteróides sistêmicos e pacientes tratados com antibióticos de amplo espectro. A candidíase sistêmica pode envolver o trato gastrintestinal, os rins, o fígado e o baço (HARVEY; CHAMPE; FISHER, 2008). Acredita-se que a maioria dos casos de candidemia seja adquirida por via endógena, pela translocação do patógeno através do trato gastrointestinal, assim qualquer variável que provoque desequilíbrio da microbiota ou lesão da mucosa gastrointestinal pode ser um agente facilitador de translocação de Candida spp. aos capilares mesentéricos. Sendo assim, fatores que aumentam a colonização intestinal por Candida ou determinem atrofia ou lesão da mucosa intestinal podem potencializar o fenômeno de translocação no tubo gastrointestinal (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). Infecções sistêmicas por Candida também podem ser adquiridas por via exógena, através do contato das mãos ou objetos contaminados com pacientes portadores de catéteres vasculares, implante de próteses contaminadas, bem como pela administração parenteral de soluções contaminadas (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). 2.3.4 Candidíase cutânea A candidíase cutâneo-mucosa crônica é rara, acomete geralmente pacientes com deficiências imunológicas, anomalias genéticas e endócrinas (GOMPERTZ et al., 2004-2005).

17 A candidíase cutânea-generalizada é comumente crônica e é observada em pacientes com deficiências nutricionais e em imunodeprimidos. As lesões são eritematosas, crostosas e com exsudatos (GOMPERTZ et al., 2004-2005). 2.4 Agentes Antifúngicos A eficácia da terapêutica antifúngica depende diretamente da precocidade do diagnóstico, assim como do estado imunológico do paciente. Portanto, pacientes com depressão do sistema imunológico podem não responder satisfatoriamente ao tratamento antifúngico utilizado (LEÃO RIBEIRO et al., 2004). A ação dos antifúngicos sobre os agentes infecciosos provoca dois tipos de reação, desde que o microrganismo seja sensível à droga, a morte do agente ou a interrupção do crescimento e reprodução. A morte do agente denomina-se efeito fungicida, e a parada de seu crescimento e reprodução chama-se efeito fungistático. Estes efeitos são determinados por mecanismos de ação, ainda não completamente conhecidos, e são variáveis com a concentração do antifúngico no meio em que se encontra o fungo. (TAVARES, 1993 apud LEÃO RIBEIRO et al., 2004, p. 117). Apesar da anfotericina B, ser um dos antifúngicos mais antigos e seu emprego quase que exclusivamente na administração sistêmica, ainda hoje é considerada a droga de referência para a maioria das infecções fúngicas. Com a descoberta dos azóis, um grande avanço foi dado à terapia antimicótica. Estes são considerados menos tóxicos que a anfotericina B, e apresentam largo espectro de atividade (BATISTA; BIRMAN; CURY, 1999). Porém, o aparecimento de microorganismos resistentes aos azóis e o aumento no número de pacientes com risco de adquirir infecções fúngicas criaram novos desafios para a terapêutica antifúngica (SHEPPARD; LAMPIRIS, 2003). Os agentes antifúngicos são classificados de acordo com o tipo de ação que exercem sobre as células dos fungos. Nas classes mais comumente utilizadas encontram-se, os polienos (ex: anfotericina B e nistatina), os nucleosídeos análogos (pirimidinas-fluorotinadas ex. 5-fluorocitosina), azóis (ex. miconazol, cetoconazol, fluconazol e itraconazol) e equinocandinas (micafungina e caspofungina) (SHEPPARD; LAMPIRIS, 2003).

18 Os polienos formam complexos com o ergosterol produzindo poros na membrana plasmática, o que leva ao aumento da permeabilidade da membrana, liberando o conteúdo intracelular acabando por conduzir à morte celular. São classificados como fungicidas e possuem largo espectro de ação (RANG et al., 2004). Os nucleosídeos análogos inibem o metabolismo das pirimidinas, interferindo com a síntese protéica e a do RNA das células (RANG et al., 2004). Os azóis inibem a enzima fúngica 3A (CYP3A) do citocromo P450, a lanosina 14-α-desmetilase, que é responsável pela conversão do lanosterol em ergosterol, o principal esterol encontrado na membrana celular dos fungos. A consequente depleção de ergosterol altera a fluidez da membrana, interferindo na ação das enzimas associadas à membrana. O efeito final consiste em inibição da replicação. Os azóis também inibem a transformação das células leveduriformes de Candida em hifas, a forma invasiva e patogênica do parasita (RANG et al., 2004). As equinocandinas inibem a síntese do 1,3-β-glicano, polímero de glicose necessário para manter a estrutura das paredes celulares dos fungos. Na ausência deste polímero, as células fúngicas perdem a sua integridade, e ocorre rapidamente a lise das mesmas. A caspofungina, mostra-se ativa in vitro contra ampla variedade de fungos e demonstrou ser eficaz no tratamento da candidíase e de formas de aspergilose invasiva que são refratarias à anfoteracina. A micafungina (FK463) está sendo objeto de estudos clínicos e já mostra-se muito eficaz contra espécies de Aspergillus e Candidas spp., até mesmo em pacientes imunocomprometidos pela SIDA (RANG et al., 2004). 2.4.1 Anfotericina B Segundo Cardoso (2004) a anfotericina B vem sendo utilizada há mais de 30 anos e mantém-se como um dos antifúngicos de escolha para o tratamento de infecções graves. É quase insolúvel em água, sendo preparada na forma de suspensão coloidal de anfoteracia B e desoxicolato sódico para injeção intravenosa. É pouco absorvida pelo trato gastrintestinal por isso administrada por via oral só é eficaz contra fungos

19 existentes na luz do trato gastrintestinal, para doenças sistêmicas deve ser administrada na forma de injeção intravenosa (SHEPPARD; LAMPIRIS, 2003). Distribui-se amplamente a todos os tecidos, tendo, porém, fraca penetração no sistema nervoso central (SNC). Liga-se às proteínas plasmáticas na faixa de 91 a 95%. É excretada lentamente pelos rins, pela bile e outras vias, com uma meia-vida terminal de 15 dias (SILVA, 2002). A anfotericina B liga-se ao ergosterol presente na membrana celular dos fungos e altera a permeabilidade da célula ao formar poros na membrana celular. O poro permite o extravasamento de íons, principalmente o potássio e de macromoléculas intercelulares, levando à morte celular. Ocorre alguma ligação das membranas humanas aos esteróides, explicando provavelmente a toxicidade proeminente do fármaco (SHEPPARD; LAMPIRIS, 2003). Ocorre resistência à anfotericina B se houver comprometimento na ligação ao ergosterol, seja pela diminuição da concentração de ergosterol da membrana ou modificação da molécula alvo de esterol de modo a reduzir a sua afinidade pelo fármaco (SHEPPARD; LAMPIRIS, 2003). 2.4.2 Fluconazol O fluconazol é um derivado imidazólico triazólico. É primariamente fungistático. Atua inibindo a biossíntese do ergosterol ao se ligar ao citocromo P- 450, pois essa ligação inibe a ação das enzimas do citocromo P-450 na desmetilação do 14-α-metilesterol para produzir o ergosterol, que é um componente da membrana fúngica (SILVA, 2002). Por via oral o fluconazol é bem absorvido, apresentando biodisponibilidade de mais de 90%. Liga-se às proteínas plasmáticas na taxa de 12% e distribui-se amplamente a todos os tecidos do corpo. É pouco metabolizado, sendo excretado pela urina na forma inalterada na taxa de 80%. A meia-vida plasmática de eliminação é de 30 horas (SILVA, 2002). O fluconazol pode ser administrado por via oral ou por via intravenosa. Atinge concentrações elevadas no líquido cefalorraquidiano e líquidos oculares e pode constituir-se o fármaco de primeira escolha na maioria das meningites fúngicas. São

20 também alcançadas concentrações fungicidas no tecido vaginal, na saliva, na pele e nas unhas (RANG et al., 2004). 2.4.3 Miconazol É um derivado imidazólico. Atua interferindo na biossíntese do ergosterol, provocando desorganização da membrana plasmática dos fungos (SILVA, 2002). É administrado por via oral no tratamento de infecções do trato gastrintestinal. Possui meia-vida curta por isso deve ser administrado a cada 8 horas. Atinge concentrações terapêuticas no osso, nas articulações e no tecido pulmonar, mas não no SNC, sendo inativado no fígado. Pode também ser administrado topicamente (SILVA, 2002). 2.5 Resistência Antifúngica O termo resistência de microorganismos é descrito como a persistência ou progressão de uma infecção no hospedeiro, mesmo que a concentração da droga no sítio da infecção seja máxima. Sendo assim a resistência a drogas antifúngicas constitui um sério problema na terapêutica das infecções fúngicas, principalmente as causadas por leveduras, especialmente Candida (LEÃO RIBEIRO et al., 2004). A resposta in vitro em leveduras é primária, quando uma cepa é resistente antes de ser exposta ao fármaco. Resistência intrínseca ocorre quando todos os membros da espécie são resistentes a certa droga ou classe de agente antifúngico, e resistência secundária ou adquirida se desenvolve em resposta à previa exposição a uma droga (LEÃO RIBEIRO et al., 2004). A resistência secundária dos microorganismos a drogas poliênicas como a Anfotericina B envolve mecanismos como a diminuição ou ausência de esteróis de membrana ou formação de ergosterol e o aumento da atividade da enzima catalase no interior da célula fúngica, impedindo a formação de radicais livres responsáveis pela formação de poros na membrana fúngica (CARDOSO, 2004). A resistência aos azólicos pode ocorrer principalmente pela modificação da quantidade ou qualidade da enzima alvo, lanosterol 14 α-demetilase, reduzida

21 acumulação intracelular da droga ou pela combinação de ambos os mecanismos. O mecanismo de resistência atribuído à enzima lanosterol 14 α-demetilase pode ser devido à super-expressão do gene ERG 11 (ZARDO; MEZZARI, 2004).

22 3 MÉTODOS 3.1 Amostra As leveduras analisadas neste estudo foram isolados clínicos de candidíase oral e vulvovaginal disponíveis no Laboratório de Micologia Clínica da Unochapecó, oriundas de estudos onde se avaliou a incidência do fungo. Foram avaliadas 60 amostras no total, sendo 30 amostras procedentes de candidíase oral as quais já estavam armazenadas sob refrigeração num período anterior de cerca de 6 meses, e 30 amostras de candidíase vaginal que foram coletadas no mesmo período em que se realizava o presente estudo. 3.2 Procedimento O estudo foi realizado no período de junho a dezembro de 2009. As determinações da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Fungicida Mínima (CFM) foram realizadas baseadas no método de diluição em caldo, de acordo com o protocolo M27-A2 estabelecido pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (CLSI), e foram realizados em triplicata (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE, 2002). Para os testes de susceptibilidade foram utilizados os antifúngicos anfotericina B, miconazol e fluconazol. 3.3 Antifungigrama Para realização dos testes de susceptibilidade foram utilizados os seguintes materiais: - Suspensões prontas de Candida spp.; - Soluções estoques de antifúngicos; - Tubos com 4,5 ml de caldo Sabouraud + extrato de levedura 0,2%; - Tubos com 3,6 ml de caldo Sabouraud + extrato de levedura 0,2%;

23 - Tubos com 3 ml de caldo Sabouraud + extrato de levedura 0,2%; - Placas de petri contendo Ágar Sabouraud dextrose + glicose 2%. a) Preparo das soluções-estoque dos antifúngicos O preparo das soluções estoque dos antifúngicos foi realizado como descrito a seguir e conforme mostra a figura 1. - Imidazólicos: 50 mg do fármaco (pó) dissolvida em 5,0 ml de dimetilsulfóxido, concentração final 10.000 µg/ml. - Anfotericina B: 50 mg do fármaco (pó para injeção) dissolvida em 5,0 ml de dimetilsulfóxido, concentração final 10.000 µg/ml. A solução ficou em repouso por 30 minutos e foi armazenada em geladeira por um período máximo de 30 dias e retirada da geladeira apenas no momento do uso. b) Solução de antifúngico para provas de sensibilidade Foi transferido 0,5 ml da solução estoque para tubo de ensaio com 4,5 ml de caldo Sabouraud + extrato de levedura 0,2%, (concentração da droga 1000 µg/ml) (figura 1.). c) Preparo das diluições seriadas Em série de 7 tubos com meio de cultura líquido + extrato de levedura 0,2% (1º tubo e tubo para controle negativo 3,6 ml e os demais 3 ml) foi transferido para o 1º tubo e no tubo controle negativo 0,4 ml da solução de antifúngico do item anterior na concentração de 1000 µg/ml. A seguir foi transferido 1 ml do tubo 1 para o tubo 2 e assim por diante, e no último tubo 1 ml foi desprezado. As concentrações finais foram 100-25 - 6,25-1,56-0,39 e 0,097 µg/ml, conforme mostra a figura 1. (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE, 2002).

24 50 mg do antifúngico + 5 ml de dimetilsulfóxido. = Antifúngico 10.000 µ g/ml. 0,5 ml 4,5 ml de Caldo Saboraund + extrato de levedura (0,2%.) Antifúngico 1000 µg/ml. 0,4 ml Controle negativo 1 2 3 4 5 6 3,6 ml 3,6 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml Desprezar 100 µg/ml 100 µg/ml 25 µg/ml 6,25 µg/ml 1,56 µg/ml 0,39 µg/ml 0,097 µg/ml Tubos contendo caldo Sabouraud + extrato de levedura 0,2% Figura 1. Diagrama para o preparo das diluições dos antifúngicos. O tubo controle permaneceu com a maior concentração do antifúngico (100 µg/ml), no qual não foi inoculada a levedura, ou seja, foi mantido como controle negativo, apenas para monitorar possível crescimento de contaminantes. d) Preparo do inóculo A partir de cultivo recente de Candida 8 a 15 dias em meio para esporulação (Ágar Sabouraud), foi preparada uma suspensão em solução salina estéril 0,85% (figura 2). A suspensão foi agitada em Vortex e determinada na escala de Wickerham (primeira linha) a quantidade de leveduras de 1.000.000 UFC/mL. Cultura de leveduras Solução salina 0,85% estéril Agitar em vortex Determinar na escala de Wickerham a quantidade de 1.000.000 UFC/mL. Figura 2. Diagrama para o preparo do inóculo.

25 e) Semeadura do inóculo Com auxílio de uma pipeta automática foi inoculado 0,1 ml da suspensão nos tubos com as diluições seriadas dos antifúngicos. Para controle de crescimento da amostra foi inoculado 0,1 ml da mesma suspensão de inóculo em um tubo contendo 3 ml de caldo Sabouraud + extrato de levedura a 0,2% sem o antifúngico. Os tubos foram incubados a 30º C e a leitura foi feita entre 5 e 10 dias (figura 3). Após a incubação foi determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM) observando se houve ou não crescimento das leveduras nos tubos com as diferentes concentrações dos antifúngicos. Já a Concentração Fungicida Mínima foi obtida pela transferência de 10 µl de cada concentração que inibiu o crescimento fúngico, para superfície de Ágar Saboraund dextrose + glicose 2% através de semeadura por esgotamento, a qual era incubada a 30º C e a leitura realizada após 48h.

26 Suspensão preparada contendo 1.000.000 UFC/mL. 0,1 ml Com auxílio de uma pipeta inocular 0,1 ml da suspensão nos tubos com as diluições seriadas. 1 2 3 4 5 6 100 µg/ml 25 µg/ml 6,25 µg/ml 1,56 µg/ml 0,39 µg/ml 0,097 µg/ml Controle de crescimento Incubar a 30º C e fazer a leitura entre 5 e 10 dias. Concentração Inibitória Mínima: O tubo com a menor concentração do antifúngico que não apresentar crescimento visual da levedura será considerado a CIM. Concentração Fungicida Mínima: Dos demais tubos que não apresentarem crescimento da levedura serão transferidos 10 µl de cada concentração para superfície de Agar Sabouraud dextrose. Incubar a 30º C e fazer a leitura após 48 horas. 10 µl A placa com o inóculo oriundo do tubo com a menor concentração do antifúngico e que não apresentar crescimento da levedura será considerada a CFM. Figura 3. Diagrama para semeadura do inóculo no teste de CIM e CFM.

27 3.4 Análise e Interpretação dos Resultados A análise e interpretação dos dados foram feitas pela observação da concentração inibitória mínima (figura 4) e concentração fungicida mínima (figura 5). As informações obtidas durante a pesquisa foram registradas em um quadro exposto no apêndice 1 e individualmente para cada amostra para facilitar a avaliação. A análise estatística dos dados foi baseada no teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. A B C Figura 4. Resultado dos testes para CIM. A- amostra teste com ausência de crescimento fúngico, nessa concentração é considerada CIM. B- amostra com crescimento fúngico com aspecto turvo. C- amostra com crescimento fúngico com deposição de material no fundo do tubo. A B Figura 5. Reultados dos testes para CFM. A- ausência de crescimento fúngico, nessa concentração é considerado CFM. B presença de crescimento visível.

28 4 RESULTADOS A interpretação dos resultados das CIMs para Anfotericina B e Fluconazol foi efetuada de acordo com o documento M27-A2 do CLSI (tabela 1), que considera sensível a anfotericina B CIM 1,0 µg/ml e resistente > 1,00 µg/ml. Para o fluconazol é considerada sensível CIM 8,0 µg/ml, sensível dose-dependente entre 16,0 32,0 µg/ml e resistente 64,0 µg/ml. (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE, 2002). Como o miconazol não está apresentado na tabela do CLSI, ele foi comparado aos valores considerados em outros estudos, onde segundo Ito et al. (2004) é considerado sensível o teste com CIM < 8,0 µg/ml, e sensível dose-dependente entre 8,0 16,0 µg/ml e resistente 16,0 µg/ml. Tabela 1. Interpretação do teste de susceptiblidade in vitro de espécies de Candida spp. de acordo com o CLSI. Sensível Sensível Dose- Resistente Antifúngicos CIM (µg/ml) dependente CIM (µg/ml) CIM (µg/ml) Anfotericina B 1,0 > 1,0 Fluconazol 8,0 16,0 32,0 64,0 Fonte: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2002. Na análise com cepas de Candida spp. oriundas de candidíases orais (Tabela 2), as cepas de C. albicans apresentaram CIMs entre 1,56 a 100 µg/ml para anfotericina B, sendo que as CFMs corresponderam a mesma variação. Na susceptibilidade para o fluconazol, as CIMs foram de 25 a 100 µg/ml, tendo também a mesma variação das CFMs. Já as CIMs do miconazol variaram entre 1,56 a 100 µg/ml e as CFMs variaram entre 6,25 a 100 µg/ml. Da mesma forma, as cepas de C. tropicalis tiveram para anfotericina B CIMs entre 1,56 a 100 µg/ml sendo que as CFMs tiveram a mesma variação, entretanto para o fluconazol não houve CIMs e consequente CFMs. O miconazol apresentou CIMs entre 25 a 100 µg/ml, sendo que as CFMs tiveram a mesma variação. Para as cepas de C. krusei as CIMs de anfotericina B variaram entre 1,56 a 100 µg/ml, correspondendo a mesma faixa para as CFMs. A susceptibilidade frente ao fluconazol teve CIMs de 100 a 100 µg/ml, correspondendo a mesma faixa para as CFMs. Já as CIMs do miconazol variaram entre 25 a 100 µg/ml, também com mesma susceptibilidade para a CFMs. A única cepa de C. glabrata estudada apresentou CIMs e CFMs de 0,097 µg/ml para os três antifúngicos.

29 Segundo a CLSI considera-se sensível à anfotericina B a cepa de Candida que apresentar CIM 1,0 µg/ml, em nosso estudo com cepas de Candida spp. de origem oral (tabela 3), apenas uma cepa de C. glabrata (3,4%) apresentou sensiblidade a esse antifúngico, as demais cepas de outras espécies (96,6%) foram resistentes. Para o fluconazol é considerada sensível a cepa que apresentar CIM 8 µg/ml, sensível dose-dependente entre 16,0 32,0 µg/ml e resistente 64,0. Sendo assim novamente a cepa de C. glabrata (3,4%) foi sensível, e também 3,4% do total das cepas, e dessa vez sendo da espécie de C. albicans, foi sensível dose dependente para esse antifúngico, e as demais cepas 93,3% apresentaram resistência. Para o miconazol, cerca de 27% das cepas foram sensíveis ao antifúngico, sendo 23,3 % pertencentes à C. albicans, 3,4% à C. glabrata, ao passo que 73,3% das cepas restantes foram resistentes. Para as amostras isoladas de secreções vulvovaginais (tabela 4), as CIMs de anfotericina B para as cepas de C. albicans variaram entre 1,56 µg/ml a 100 µg/ml, sendo que as CFMs variaram de 1,56 µg/ml a 100 µg/ml, as CIMs do miconazol variaram entre 25 µg/ml a 100 µg/ml e as CFMs apresentaram a mesma variação. O fluconazol não apresentou CIM para nenhuma cepa das espécies estudadas o que não tornou possível a determinação das CFMs também. As cepas de C. tropicalis apresentaram para anfotericina B CIMs entre 6,25 µg/ml a 100 µg/ml sendo que as CFMs tiveram a mesma variação. O miconazol apresentou CIMs entre 25 µg/ml a 100 µg/ml e as CFMs foram de 100 µg/ml. Para as cepas de C. krusei as CIMs de anfotericina B variaram entre 6,25 µg/ml a 100 µg/ml, sendo que as CFMs apresentaram a mesma variação, já as CIMs do miconazol variaram entre 25 µg/ml a 100 µg/ml e as CFMs também apresentaram essa variação. As cepas de C. glabrata apresentaram CIMs e CFMs entre 1,56 µg/ml a 100 µg/ml para anfotericina B, para o miconazol as CIMs e CFMs variaram entre 6,25 a 100 µg/ml. Como citado anteriormente, segundo a CLSI considera-se sensível à anfotericina B a cepa de Candida que apresentar CIM 1,0 µg/ml. Em nosso estudo com cepas de Candida spp. de origem vaginal (tabela 5) a resistência para a anfotericina B e para o fluconazol foi de 100%. Para o miconazol apenas um percentual de 6,8 %, foi sensível ao antifúngico, sendo 3,4% de cepas de C. krusei e

30 3,4% de C. glabrata e 93,2% foram resistentes ao antifúngico. A análise estatística dos dados foi baseada no teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis, indicando que não houve diferenças significativas nas medidas de CIMs e CFMs dos antibióticos entre os isolados da mesma espécie (apêndice 2).

31 Tabela 2. Variação das CIMs (µg/ml) e CFMs (µg/ml) em amostras obtidas de candidíase oral. Anfotericina B Fluconazol Miconazol Leveduras (n) CIM CFM CIM CFM CIM CFM C. albicans (14) 1,56-100 1,56-100 25-100 25-100 1,56-100 6,25-100 C. tropicalis (9) 1,56-100 1,56-100 não houve CIM 25-100 25-100 C. krusei (6) 1,56-100 1,56-100 100-100 100 100 25-100 25-100 C. glabrata (1)* 0,097 0,097 0,097 0,097 0,097 0,097 CIM = Concentração Inibitória Mínima; CFM = Concentração Fungicida Mínima; n = Número de amostras por espécie. Os valores correspondem respectivamente à menor e maior CIM de cada fármaco. *Não há variação da CIM porque existe somente uma amostra dessa espécie. Tabela 3. Distribuição do perfil de susceptibilidade aos diferentes antifúngicos de amostras de candidiase oral. Anfotericina B Fluconazol Miconazol Leveduras (n) S (%) R (%) S (%) S-DD (%) R (%) S (%) S-DD (%) R (%) C. albicans (14) 0 (0) 14 (46, 6) 0 (0) 1 (3,4) 13 (43,3) 7 (23,3) 0 (0) 7 (23,3) C. tropicalis (9) 0 (0) 9 (30,0) 0 (0) 0 (0) 9 (30,0) 0 (0) 0 (0) 9 (30,0) C. krusei (6) 0 (0) 6 (20,0) 0 (0) 0 (0) 6 (20,0) 0 (0) 0 (0) 6 (20,0) C. glabrata (1) 1 (3,4) 0 (0) 1 (3,4) 0 (0) 0 (0) 1 (3,4) 0 (0) 0 (0) Total (30) 1 (3,4) 29 (96,6) 1 (3,4) 1 (3,4) 28 (93,3) 8 (26,7) 0 (0) 22 (73,3) S = Sensível. S-DD= Sensível dose-dependente. R= Resistente. n= 30.

32 Tabela 4. Variação das CIMs (µg/ml) e CFMs (µg/ml) em amostras obtidas de candidíase vaginal. Anfotericina B Fluconazol Miconazol Leveduras (n) CIM CFM CIM CFM CIM CFM C. albicans (17) 1,56-100 1,56-100 não houve CIM 25-100 25-100 C. tropicalis (4) 6,25-100 6,25-100 não houve CIM 25-100 100 C. krusei (6) 6,25-100 6,25-100 não houve CIM 6,25-100 100-100 C. glabrata (3) 1,56-100 1,56-100 não houve CIM 6,25-100 6,25-100 CIM = Concentração Inibitória Mínima; CFM = Concentração Fungicida Mínima; n = Número de amostras por espécie Os valores correspondem respectivamente à menor e maior CIM de cada droga. Tabela 5. Distribuição do perfil de susceptibilidade aos diferentes antifúngicos de amostras de candidíase vaginal. Anfotericina B Fluconazol Miconazol Leveduras (n) S (%) R (%) S (%) S-DD (%) R (%) S (%) S-DD (%) R (%) C. albicans (17) 0 (0) 17 (56,7) 0 (0) 0 (0) 17 (56,7) 0 (0) 0 (0) 17 (56,7) C. tropicalis (4) 0 (0) 4 (13,3) 0 (0) 0 (0) 4 (13,3) 0 (0) 0 (0) 4 (13,3) C. krusei (6) 0 (0) 6 (20,0) 0 (0) 0 (0) 6 (20,0) 1 (3,4) 0 (0) 5 (16,6) C. glabrata (3) 0 (0) 3 (10,0) 0 (0) 0 (0) 3 (10,0) 1 (3,4) 0 (0) 2 (6,6) Total (30) 0 (0) 30 (100,0) 0 (0) 0 (0) 30 (100,0) 2 (6,8) 0 (0) 28 (93,2) S = Sensível. S-DD= Sensível dose-dependente. R= Resistente

5 DISCUSSÃO A resistência aos antifúngicos em leveduras pode ser qualificada como intrínseca, natural ou adquirida. A resistência intrínseca caracteriza-se quando todos os membros da espécie são resistentes a certa droga ou classe de agente antifúngico antes de ser exposta ao fármaco, devido à expressão genética dessa condição. A resistência natural, por sua vez, caracteriza-se quando algumas cepas de determinada espécie apresentam resistência. Já a resistência secundária ou adquirida se desenvolve em resposta a exposição a uma droga (LEÃO RIBEIRO et al., 2004). A resistência intrínseca esperada para as cepas identificadas como C. krusei no estudo foi confirmada, embora percebe-se uma diferença no grau de resistência entre os isolados. Estudos de isolados de C. albicans, provenientes de pacientes com infecções recorrentes, tem mostrado que a resistência ao fluconazol ocorre nas mesmas cepas que anteriormente eram suscetíveis. Isso sugere que as cepas são modificadas ao longo da exposição do paciente a droga, caracterizando a resistência adquirida (ZARDO; MEZZARI, 2004). No presente estudo, nas cepas de Candida spp. de origem oral o perfil de resistência obtido foi cerca de 97% para a anfotericina B, 93% para o fluconazol e 73% para o miconazol. Já no estudo realizado com cepas de origem vaginal a resistência foi de 100% para anfotericina B e para o fluconazol, e cerca de 93% para o miconazol. Santos et al. (2009) evidenciou em seu estudo de isolados de candidúria um percentual de 92% de resistência ao fluconazol e 8 % de resistência a Anfotericina B para as amostras, corroborando com o nosso elevado percentual de resistência encontrado. Entretanto Rodrigues et al. (2007), num estudo de colonização por Candida sp. na cavidade oral de indivíduos soropositivos e soronegativos para HIV-1 no noroeste do estado de São Paulo, utilizando a metodologia de disco difusão em análise somente de cepas de Candida nãoalbicans, demonstrou que 50% das amostras tiveram sensibilidade dose-dependente aos derivados azólicos, enquanto apenas 25% apresentaram resistência. Em nosso estudo, o percentual de resistência de não-albicans foi três vezes maior do que o encontrado por Rodrigues et al. (2007), corroborando apenas com o quadro de recidiva da patologia nos pacientes amostrados. Da mesma forma, em estudo com isolados obtidos da mucosa oral de pacientes HIV positivos realizado por Wingeter

34 et al (2007), 14% das amostras foram resistentes ou sensível dose-dependente para o fluconazol, e apenas 4% foi resistente a Anfotericina B. Em geral, para todas as espécies de Candida avaliadas no presente estudo, o índice de resistência encontrado foi superior ao encontrado nas pesquisas de outros autores. Este fato chama a atenção para a importância da monitoração de possíveis mudanças na distribuição das espécies envolvidas nos processos infecciosos, assim como alterações dos padrões de sensibilidade, justificando a realização dos testes de suscetibilidade.

35 6 CONCLUSÃO Diante do exposto, o presente estudo permite concluir que, nas análises com amostras de candidíases de origem oral, a espécie de C. albicans foi a que apresentou maior sensibilidade, seguida de C. glabrata, e o antifúngico com maior espectro de ação foi o miconazol, seguido pelo fluconazol e anfotericina B. Já nas análises com amostras de candidíases de origem vaginal as espécies de C. krusei e C. glabrata apresentaram o mesmo perfil de sensibilidade, novamente o miconazol foi o antifúngico com maior espectro de ação, sendo que para o fluconazol e a anfotericina B a resistência foi total para todas as espécies. Sendo assim, apesar dos testes de susceptibilidade terem demonstrado alto índice de resistência aos derivados azólicos, pode-se concluir que o tratamento com miconazol apresentaria maior efeito sobre as cepas de Candida, e que as candidíases orais seriam mais facilmente tratadas do que as vulvovaginais. É importante ressaltar que a combinação de conhecimentos farmacológicos de cada antifúngico associada à resposta terapêutica em cada paciente com a prévia avaliação de testes de susceptibilidade in vitro devem nortear a conduta de um tratamento antifúngico mais eficaz para a candidíase nos pacientes, ou seja, para se evitar casos de recidivas, e assim diminuir custos com tratamentos e contribuir para a melhoria da qualidade de vida da população.