CHAPTER 3 Embriodiagnóstico Introdução As condições de eclobilidade influenciam a produção de pintos de um dia porque durante o processo de incubação podemos submeter esses ovos a situações que podem produzir pintos com baixa qualidade, desidratados, com baixo peso corporal. Isto leva à problemas com a mortalidade das aves no primeiro dia de campo, ou com um desempenho subótimo. Um pintinho de baixa qualidade para reflete diretamente na produção final. O animal sempre terá dificuldade em ganhar peso e será sempre um refugo na granja. O objetivo do sistema de produção é de colocar um pintinho no campo que tenha uma perda ideal de umidade, com cicatrização umbilical bem realizada e que seja ativo durante o processo de engorda. Para atingir tais objetivos todos os procedimentos têm que ser bem controlados, pois através de um sistema de controle de cada fator isoladamente é possível identificar com maior precisão quais destes seriam vetores de possíveis problemas. Na granja e em todo o manejo do incubatório, é preciso prevenir as contaminações de ovos, principalmente durante o processo de limpeza de máquinas, fazendo com que isso seja uma constante do dia-a-dia. As contaminações baixam a qualidade dos pintos. A temperatura e a umidade das máquinas também precisam ser controladas diariamente, para não haver interferência na qualidade. Outra questão a se preocupar é a procedência dos ovos incubados. É necessário um trabalho intensivo de coleta de ovos na granja, deixando-os menos tempo no ninho. É preciso desinfetar e acondicionar os ovos assim que coletados e desinfetar a cama dos ninhos. A maioria da contaminação dos ovos acontece à nível de campo, antes da chegada dos mesmos ao incubatório. Um problema muito comum é a condensação de vapor de água sob a superfície do ovo na sala de estocagem, antes de ir para o incubatório. As bactérias que estão na casca conseguem entrar no ovo quando ele sua. Na granja também é preciso fazer a desinfecção. As galinhas pisam nas fezes e sujam os ovos, que acabam indo assim mesmo para o incubatório. Outro problema são os ovos postos na cama, que na maioria das vezes não são descatados pelo granejeiro.
30 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino Um ponto de identificação de possíveis problemas é a análise bacteriológica. Geralmente as análises de contaminações ambientais são feitas semanalmente. Os pintinhos que nascem são submetidos a teste de análise bacteriológica. Os funcionários precisam se monitorar, e evitar serem fontes de contaminação. Para isto um bom sistema de treinamento é essencial. A realização do teste de mecônio, para verificar a presença de salmonela, de bactérias, entre outros germes é uma das ferramentas mais utilizadas. Para que se possa identificar qual ponto é responsável pelo abalo do sistema como um todo, cada ponto em específico deve ser monitorado. Apenas com a maioria os processos sob controle é possível realizar-se a identificação de fatores específicos de interferimento. Os processos devem estar sob o controle do técnico para que se possar tomar as decisões cabíveis em momentos de crise. 1. Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) Existem várias ferramentas técnicas com a finalidade de identificar os perigos e prevenir possíveis falhas nos sistemas de produção. Uma ferramenta que tem potencial utilização no sistema produtivo de um incubatório, no entanto pouco explorada, é a Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle. O sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) nasceu nos EUA no final dos anos 60 e de acordo com Quittet & Nelis (2000), tinha como ponto principal a fabricação de alimentos destinados à nutrição dos astronautas, a fim de prevenir toxinfecções alimentares. Em inglês este conceito significa Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP). Trata-se de um sistema com fundamentos científicos e caráter sistêmico, o qual permite identificar perigos específicos e medidas para seu controle com a finalidade de garantir a inocuidade do processo produtivo, e pode ser aplicado desde o produtor até o consumidor final (CODEX ALIMENTARIUS, 1997). Nos anos 80 este sistema foi recomendado pela National Academy of Science dos EUA e, em 1993, a Comissão do Codex Alimentarius recomendou sua aplicação nas indústrias de alimentos (SEBRAE, 2000). Segundo Valois (2002), os pré - requisitos para implantação do APPCC no Brasil derivou de algumas demandas, tais como: dos mercados nacional e internacional, que estão exigindo a implantação das ferramentas por seus fornecedores; de legislações internacionais e nacionais que já obrigam as
Embriodiagnóstico 31 empresas de alimentos a adotarem o sistema APPCC e seus pré-requisitos em suas linhas de produção; do consumidor, que cada vez mais consciente e mais exigente, está a procura e querendo alimentos mais sadios e seguros. Segundo Hobbs & Roberts (1999), a abordagem de APPCC avalia os riscos potenciais da operação com alimentos e decide que áreas que são críticas para a segurança do consumidor. Para Valois (2002), o projeto APPCC tem abrangência do campo, passando pelos processos industriais, à mesa. Desta maneira é possível controlar os perigos ao longo de toda a cadeia produtiva. De acordo com Quittet & Nelis (2000), a primeira etapa do sistema é constituir a equipe HACCP, a qual deve obter o engajamento por parte da direção, sendo uma condição sine qua non para o resultado do estudo. A equipe é constituída de pessoas da empresa que possuem conhecimentos específicos e experiência apropriada a respeito do produto isto é, os empregos da produção, das onde os objetivos sejam a produção de maior porcentagem possível de nascimentos de pintos de um dia de primeira qualidade. Em grandes empresas poderá haver pessoas de fora, como consultores. Finalmente recomenda-se que a estrutura da equipe deve ser funcional e não hierárquica. A equipe deve compreender um coordenador e um secretário técnico. As informações que serão utilizadas para implementar o programa devem ser confiáveis, utilizando-se bibliografia científica e técnica, centros de pesquisa, bases de dados, os serviços oficiais, a regulamentação, os guias de boas práticas de fabricação. É necessário ter acesso, na fase de iniciação, a dados epidemiológicos, comerciais, problemas econômicos, logísticos e administrativos dentro do processo produtivo do incubatório. A segunda etapa, conforme o Codex Alimentarius (1997) consiste na descrição completa do produto, no caso pintos de um dia, sexo, identificação do lote, e quais vacinações realizadas, e tratamentos para destruição de microorganismos realizados (qual sanitizante) da recepção dos ovos à expedição dos pintainhos, e sistema de distribuição A construção de um diagrama de fabricação constitui a terceira etapa do processo, e conforme Quittet & Nelis (2000), é necessário decompor o processo de fabricação em etapas para construir o diagrama, descrevendo o processo desde a entrada da matéria-prima (ovos incubáveis), à venda e a entrega ao cliente dos pintainhos, etapa por etapa. O passo seguinte é a confirmação in situ do diagrama de fluxo, na qual a equipe confronta as informações que ela dispõe com a realidade; a verificação tem que ser efetuada sobre a totalidade das etapas de fabricação, desde a recepção dos ovos até a etapa de distribuição dos pintainhos. Feito isto, os erros devem ser mencionados a fim de haver possibilidade de correção. Enumerar todos os possíveis perigos relacionados com cada fase,
32 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino executar uma análise de riscos e estudar as medidas para controlar os perigos identificados é a quinta etapa. Para realizar uma análise de perigos é necessário incluir: a probabilidade de que surjam perigos e a gravidade de seus efeitos prejudiciais ao funcionamento correto do sistema de produção; avaliar quantitativamente e qualitativamente a presença destes perigos; levar em consideração a sobrevivência ou proliferação dos microorganismos, a presença de fatores microclimáticos que possam influenciar na temperatura ou na umidade relativa do ar no interior das incubadoras, ocorra a contaminação dos ovos incubáveis, e ainda possibilitem a identificação de problemas ocorridos antes da chegada dos ovos à planta do incubatório (irregularidades no matrizeiro). Após esta avaliação, a equipe determina as medidas de controle para cada perigo, sendo possível haver mais de uma medida de controle (CODEX ALIMENTARIUS, 1997). Segundo Quittet & Nelis (2000), a próxima etapa é a determinação dos pontos críticos de controle (PCC), que podem ser uma etapa, um ponto, um procedimento ou um risco inaceitável que pode ser eliminado ou reduzido. Para cada processo de produção é necessário determinar se ele é um PCC ou não. A identificação dos pontos críticos tem como objetivo principal conduzir os operadores a desenvolver e formalizar as medidas preventivas, que é a oitava etapa. Conforme o Livro Branco de Segurança Alimentar (COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS, 2000), a análise de riscos compreende três elementos: determinação do risco (assessoramento cientifico e análise de dados), gestão do risco (regulamentação e controle) e processo de comunicação sobre o risco. O diagrama 1 mostra as perguntas que devem ser feitas para se determinar se um perigo deve ou não ser considerado um ponto crítico de controle. Depois da identificação dos PCC, se estabelecem limites críticos para cada ponto crítico, isto é, atribui-se um valor que separa o aceitável do inaceitável, corresponde aos valores extremos aceitáveis para garantir a qualidade do produto. Consideram-se as medidas de temperatura e nível de umidade relativa das incubadoras e nascedouros, dados sob o consumo de energia, quais linhagens provenientes os ovos incubáveis, e nível de contaminação dos ambientes do incubatório. Um potencial ponto crítico que vem onerando cada vez mais o sistema de produção de pintos de um dia, é a questão da destinação dos resíduos do incubatório. Na maioria das vezes é realizado em lagoas de estabilização ou na incineração, incorrendo em grande custo. Portanto a minimização do volume deste tipo de resíduos deve ser considerada como objetivo dentro da organização do sistema de produção.
Embriodiagnóstico 33 Figura 1. Exemplo de uma sequência de decisões para identificar os PCC (CODEX ALIMENTARIUS, 1997); (P.=passos; 1,2 e 3). Segundo Kobashigawa et al. (2007) podemos ter uma excelente noção do volume de resíduos que os diferentes tipos de incubatórios produzem. O primeiro exemplo é com o resíduo de incubatório de matrizes de corte e, o segundo exemplo é com resíduos produzidos por incubatórios de poedeiras comerciais no estado de São Paulo: Cálculos da produção por matrizes: 1. Resíduos de 100 ovos de matrizes de corte (60 g de peso) 85 % de eclosão (5 g de casca)...425 g 10% de ovos não eclodidos e refugos (43 g)...430 g 5% de ovos inférteis (54 g)...270 g
34 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino TOTAL...1125 g Considerando um incubatório de 300.000 pintos/dia = 3,375 ton. /dia 2. Resíduos de 100 ovos de matrizes de poedeira comercial (60 g de peso) 90% de eclosão (5 g de casca)...450 g 7% de ovos não eclodidos e refugos (43 g)...301 g 3% de ovos inférteis (54 g)...162 g Subtotal...913 g 45% de machos (37 g)...1665 g TOTAL...2578 g Considerando um incubatório de 300.000 pintos/sem = 7,734 ton. /sem A décima etapa estabelece um sistema de vigilância para cada PCC, na qual a equipe descreve os métodos de mensuração que permitem assegurar-se que os limites críticos não serão ultrapassados. Com esta vigilância pode-se detectar a perda de controle de um PCC, sendo o ideal proporcionar esta informação a tempo, para fazer correções que permitam assegurar o controle do processo (CODEX ALIMENTARIUS, 1997). O estabelecimento de um plano de ações corretivas também é uma etapa importante, à medida que se formulam medidas especificas para cada PCC do sistema, em caso de ultrapassagem dos limites críticos. Para Quittet & Nelis (2000), a descrição das ações corretivas devem compreender: a natureza do desvio, a causa dos desvios, os métodos e técnicas para estabelecer a ação corretiva, os modos operacionais, o tipo de tratamento a ser utilizado e o registro dos resultados. Conforme o Codex Alimentarius (1997), a penúltima etapa aborda a questão do estabelecimento de procedimentos de comprovação; para determinar se o sistema de APPCC funciona de maneira eficaz, pode-se utilizar métodos, procedimentos e ensaios de comprovação e verificação. Por último deve-se estabelecer um sistema de documentação e registro eficaz e preciso. As documentações compreendem as análises de riscos, a determinação dos PCC e dos limites críticos; como registros têm-se, as atividades de vigilância dos PCC, os desvios e as medidas corretivas correspondentes e as modificações introduzidas no sistema. Quittet & Nelis (2000), apontam a importância de esta documentação estar disponível e acessível, e ser classificada de maneira simples e coerente. Dentre as ferramentas disponíveis num incubatório a que mais tem capacidade de revelar pontos críticos é o embriodiagnóstico. Utilizando esta ferramenta pode-se, através de seu diagnóstico, tomar decisões durante as rotinas do incubatório, ou até mesmo identificar problemas anteriores à entrada dos ovos nas dependências do incubatório.
Embriodiagnóstico 35 2. Desenvolvimento embrionário no período de incubação Bronner-Fraser (1996) descreveu detalhadamente cada etapa do desenvolvimento embrionário em aves. Quando o ovo é colocado em condições de incubação, isto é, temperatura de 37,5 C, umidade relativa de 60%, oxigenação e viragem (uma a cada hora) adequadas, o desenvolvimento embrionário é retomado e o embrião se desenvolverá completamente em + ou 21 dias (504 horas). Etapas do desenvolvimento: Gastrulação: durante a gastrulação, em uma das bordas do blastoderma, na zona de junção, as células marginais tendem a empurrar outras células por meio de rápidas mitoses. As células se deslocam por meio da linha mediana vindas de ambos os lados do blastoderma. Por um curto período, surge uma crista longitudinal levemente elevada que se transforma imediatamente em uma depressão mediana, a qual se desenvolve rapidamente em um sulco que se estende desde a margem da área opaca ate alem do centro da área pelúcida. Esse sulco, limitado por duas linhas paralelas chamadas bordas primitivas, constitui a linha primitiva nessa etapa, células migram da face ventral do blastoderma, anteriormente e anterolateralmente por um processo conhecido como delaminação constituindo o endoderme. O processo de gastrulação consiste na transferência de material do lado externo para dentro através de um canal. Durante o processo não se pode falar ainda em ectoderme, mesoderme e endoderme, uma vez que esses tecidos embrionários estão em formação. A gastrulação é um processo cinético e não pode ser considerada como um simples termo morfológico. Por isso, os pesquisadores têm usado os termos epiblasto e hipoblasto para designar essas camadas indiferenciadas até o momento da definitiva separação do mesoderme. Parece que o arquênteron (cavidade gastrocefalica) no embrião de pintainhos é formado de um modo diferente daquele no anfioxo ou no sapo. Não há substituição da blastocele pela gastrocele. A blastocele original é diretamente transformada em gastrocele original é diretamente transformada em gastrocele pelo aparecimento das células endodérmicas abaixo do blastoderma original. O surgimento da linha primitiva no embrião representa a definição do eixo ântero-posterior do futuro individuo, sendo que o embrião propriamente dito se desenvolverá anteriormente a ela. A região da linha primitiva é uma região de rápido crescimento e proliferação celular. O sulco que nela se forma é denominado sulco primitivo e é ladeado pelas bordas primitivas. A sua extremidade posterior é chamada de placa primitiva e a extremidade anterior, nó primitivo ou nó de Hensen que tem caráter transitório. Quando a linha primitiva esta totalmente desenvolvida, o blastoderma muda a sua forma de contorno circular para uma ligeiramente oval ou piriforme. Essa
36 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino mudança se deve ao rápido crescimento em direção anterior. A medida que cresce, ela da origem ao mesoderme entre o hipoblasto e o epiblasto. As células mesodermicas migram da linha primitiva passando para a direita e para a esquerda do sulco distribuindo-se por toda a área pelúcida, ate a margens do blastoderma, assim, os folhetos formados se tornam gradualmente aparentes e podem ser denominados agora de ectoderme, mesoderme e endoderme. A partir do nó de Hensen, as células se dirigem adiante e forma então a notocorda. À medida que ela se desenvolve, a linha primitiva diminui. Quando a gastrulação termina o blastoderma é quase circular. Ligeiramente alongado no seu eixo longitudinal, paralelo à linha primitiva. A gastrulação é completada com a origem da terceira camada germinativa, o cordomesoderme, ou seja, a notocorda definindo o eixo mediano do futuro individuo e o mesoderme, um tecido que se distribui por toda a área discoidal embrionária. As três camadas germinativas de células originam os vários órgãos ou sistemas do embrião: Ectoderme: epiderme, penas, bico, unhas, sistema nervoso, lente, retina e íris dos olhos, mucosa da boca e cloaca, entre outras estruturas; Endoderme: mucosa dos tratos digestório e respiratório; Mesoderme: ossos, músculos, órgãos reprodutores, excretores, cardiocirculatório (coração e vasos sanguíneos), derme e hipoderme; A formação da área embrionária é indicada por um espessamento no ectoderme, adiante do nó de Hensen, no seu eixo mediano, o qual constitui a placa neural. Figura 1. Área pelúcida, no início da gastrulação de aves, mostrando o deslocamento do hipoblasto, acompanhado da expansão da endoderme. O epiblasto é mostrado somente do lado esquerdo de cada esquema. 1. Hipoblasto; 2. Endoderma presumível; 3. Endoderme; 4. Linha primitiva; 5. Processo cefálico; 6. Crescente de células germinativas (hipoblasto). (Gonzales & Café, 2003).
Embriodiagnóstico 37 Figura 2. Mapa dos territórios presumíveis sobre o epiblasto do embrião de galinha, no momento da postura do ovo. Em A, vista lateral, em corte. Em B, vista polar do epiblasto. 1. Ectoderme presumível; 2. Placa neural presumível; 3. Mesênquima presumível da cabeça e notocorda; 4. Mesoderme paraxial presumível; 5. Mesoderme do coração presumível; 6. Mesoderme lateral presumível; 7. Endoderme presumível; 8. Mesoderme extra-embrionária presumível; 9. Hipoblasto secundário; 10. Cavidade subgerminativa. (Gonzales & Café, 2003). 3. Anexos embrionários As membranas embrionárias ou fetais das aves representam adaptações especiais ao ambiente pelas funções que desempenham o embrião das aves tem quatro diferentes membranas o saco vitelino (ou membrana vitelina), o alantóide, o âmnio e o córion ou serosa (Decuypere et al., 2003). No momento da eclosão não são encontrados vestígios das três ultimas membranas. O âmnio e a serosa são completamente eliminados e o alantóide é descartado na sua grande parte, enquanto que o saco vitelino é incorporado no intestino delgado. O endoderme, combinado com o mesoderme esplâncnico (esplancnopleura) estende-se perifericamente do embrião para área extraembrionária, circundando o material vitelino sobre o qual o blastodisco esta repousando. Juntos, esses tecidos formam o saco vitelino o qual encerra o vitelo que vai alimentar o embrião. O material nutritivo é degredado em substâncias digeridas pelas enzimas presentes no endoderme do saco vitelino, as quais são absorvidas pelos capilares da área vasculosa, transportadas pelas veias onfalomesentéricas e distribuídas para todas as partes do embrião e tecidos extra embrionários, depois de passar pelo fígado e coração. A medida que o embrião cresce, o saco vitelino regride no tamanho e vai sendo interiorizado na linha do intestino médio embrionário, até que enfim, finalmente à eclosão, é incorporado ao pequeno intestino do pintainho onde
38 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino estará presente, ainda, por vários dias após a eclosão (Gonzales & Café, 2003). O alantóide está presente no embrião de 72 horas de incubação e se apresenta como um divertículo do saco vitelino na porção posterior do intestino primitivo, onde cresce rapidamente, invadindo toda a cavidade extra-embrionária no 4 dia de incubação. Sua cavidade é preenchida por uma solução salina. O alantóide tem a função de estocar as substâncias excretadas durante o desenvolvimento embrionário, através de uma formação, a vesícula alantóidea. O mesoderme esplâncnico que o reveste forma, juntamente os aço vitelino, um sistema complexo de capilares sanguíneos que se conecta coma circulação intra-embrionária por meio das arterias e veias alantoideas. Posteriormente, coma fusão com o córion nos poros da membrana da casca, funciona como órgão de respiração e, nos estágios posteriores do desenvolvimento, a circulação alantoídea também absorve o cálcio da casca o qual será usado para a formação do esqueleto embrionário. Ao mesmo tempo, torna a casca frágil e fina, facilitando sua ruptura no momento da eclosão. Alem disso funciona como um órgão de absorção dos componentes do albúme. O âmnio surge com 33 horas de incubação, na região cefálica, por uma dobra que se eleva a partir do blastodisco. Essa prega (prega amniótica cefálica) se desenvolve em direção à região posterior do embrião (prega amniótica caudal). A fusão dessas duas pregas amnióticas delimita a bolsa amniótica. As pregas amnióticas são formadas pelo somatopleura, o qual é uma bolsa que envolve o embrião, protegendo-o do contato com o meio ambiente. Entre o embrião e o âmnio existe um espaço (cavidade amniótica)que contém um líquido salino (fluido amniótico). O âmnio e o líquido amniótico fora desenvolvidos nas aves com a função de manter a umidade do embrião, protegê-lo da desidratação, prevenir a aderência favorecendo os seus movimentos. A metade externa das dobras amnióticas forma a serosa ou córion que também é composta de ectoderme e mesoderme somático. A serosa se desenvolve externamente ao saco vitelino e alantóide, envolvendo-os completamente ao final da segunda semana. Ela se expande e se adere à parte calcárea da casca, dentro da membrana interna. Esta intimamente ligada ao alantóide, formando, depois de alguns dias de incubação, uma membrana denominada cório-alantóide, infiltrada nos poros da membrana da casca. O desenvolvimento do embrião no período que se segue à colocação do ovo embrionado em condições de incubação é muito rápido, ocorrendo alterações a cada hora, visualizadas mascroscopicamente conforme a descrição apresentada a seguir e nos esquema das figuras.
Embriodiagnóstico 39 Figura 3. Esquema do desenvolvimento do embrião de galinha do primeiro ao décimo segundo dia. Figura 4. Esquema do desenvolvimento do embrião de galinha do décimo segundo dia ao vigésimo primeiro dia. Segundo Gonzales & Café (2003), o desenviolvimento embrionário se procede dando sequência os seguintes eventos: Primeiras 24 horas 18 h: início da formação do trato alimentar 19 h: início da formação da prega neural
40 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino 20 h: início de formação do cérebro e sistema nervoso 21 h: início da formação da cabeça 23 h: aparecimento das ilhotas de sangue 24 h: início da formação dos olhos Até 48 horas O embrião começa a se colocar no seu lado esquerdo Formação dos vasos sangüíneos e do coração que começa a bater Fechamento do canal neural para formar o tubo neural Início da formação da vesícula auditiva Término de formação das três regiões do cérebro Aparecimento dos primeiros sinais de âmnio Até 72 horas Aparece o vestígio da cauda Formação dos botões dos membros inferiores e superiores Presença do âmnio e do córion Início da formação das narinas Aparecimento das lentes oculares Até 96 horas Completa-se a formação das membranas extra-embrionárias (âmnio, córion e alantóide O corpo do embrião posiciona-se sobre o seu lado esquerdo. A gema, no ponto de implantação, torna-se mais alongada. O embrião se apresenta numa forma de C Início da formação da boca e língua Começa o aparecimento das fossas nasais A alantóide se infiltra entre o âmnio e o córion Aos 5 dias Aumento do tamanho do embrião, do saco vitelino e do alantóide Maior diferenciação das partes da boca Distingue-se a estrutura externa dos olhos ("olho preto grande") Formação do proventrículo e moela Os botões locomotores são mais salientes Aos 6 dias Início da formação do bico O saco vitelino apresenta um número maior de pregas neurais O coração está bem grande e fora do corpo Os apêndices locomotores começam a adquirir a forma da ave Aos 7 dias Já se tornam proeminentes os ossos digitais da asa e pernas O abdômen se torna saliente devido ao desenvolvimento das vísceras
Embriodiagnóstico 41 O coração está dentro da cavidade torácica O ouvido e seus condutos estão completamente visíveis A alantóide cobre completamente a gema Aos 8 dias Início da formação das penas As asas e pernas estão completamente diferenciadas Aos 9 dias O embrião começa a ter aparência própria da espécie O bico, apêndices superiores e inferiores e pigóstilo estão bastante diferenciados Aos 10 dias Ocorre endurecimento do bico Os poros da pele estão visíveis a olho nu Aos 11 dias O corpo e pescoço assumem a forma característica das aves A cabeça é mais proporcional ao tamanho do corpo O embrião está coberto por uma penugem fina Aos 12 dias Os dedos estão completamente formados As unhas dos pés começam a se formar Completa-se o empenamento Está terminando a utilização do albúmen Aos 13 dias Aparecem as escamas e unhas Aparecimento da protuberância calcítica ("dente", diamante) sobre o bico A cabeça move-se para a direita do corpo Aos 14 dias O embrião dirige a cabeça em direção à câmara de ar Aos 15 dias O corpo e a cabeça são mais proporcionais em tamanho Ocorre a penetração do intestino para o interior da cavidade abdominal Aos 16 dias Escamas, bicos e unhas estão firmes e cornificadas O embrião está bem emplumado Desaparecimento quase total do albúmen Aos 17 dias O bico está voltado para a câmara de ar Há uma diminuição do líquido amniótico Aos 18 dias A crista está visível
42 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino O embrião está quase do tamanho normal A cabeça está sob a asa direita Aos 19 dias Começa a penetração do saco vitelino na cavidade abdominal O embrião ocupa totalmente o ovo, exceto a câmara de ar Aos 20 dias O saco vitelino está totalmente na cavidade abdominal. O umbigo está aberto A alantóide pára de funcionar e começa a secar O embrião rompe a âmnio e começa a respirar através da câmara de ar O embrião atinge o tamanho normal Aos 21 dias O pinto bica a casca O pinto emerge da casca (eclosão) Seca as penas, cicatriza o umbigo. Pelo menos seis períodos são considerados críticos no crescimento do embrião: entre o 2º e 4, 9, 14, 16, 19 e 20 dias. Esses períodos estão relacionados ou com fases de retardamento do crescimento embrionário (9, 16 e 20 dias) ou com ocorrência de maior mortalidade embrionária devido às influências físicas da incubação (temperatura, umidade, oxigenação, ventilação, viragem dos ovos) e até mesmo às deficiências nutricionais das matrizes (entre 2 e 4, e 14. dias). 4. Embriodiagnóstico A ferramenta mais importante em um incubatório é aquela capaz de diagnosticar problemas de eclosão. Essa ferramenta é denominada embriodiagnóstico ou "Solução de Problemas de Eclosão". Para que se possa fazer uma identificação eficiente desses problemas, é necessário que se faça a quebragem dos ovos. As empresas diferem entre si no mundo todo, porém os mesmos dados podem ser coletados independentemente da estrutura da operação. Existem diferentes níveis de coleta de dados no setor, que vão desde empresas que colhem todo tipo possível de dados a empresas que não colhem dados nenhum. A chave é a coleta adequada dos dados e sua posterior utilização. O embriodiagnóstico tem como foco principal identificar problemas, e o processo de quebragem é útil, pois permite identificá-los. Realizar esse tipo de análise não é um processo complicado. Existe um ponto chave que deve ser lembrado: simplificar ao máximo. Muitas vezes descobrimos problemas
Embriodiagnóstico 43 de eclosão, sem, porém, considerar sua fonte. A primeira questão em que devemos nos concentrar é o potencial de eclosão do lote. Para isso, é preciso determinar a fertilidade do lote. Uma vez determinada à fertilidade, pode-se obter o potencial de eclosão através do cálculo da Porcentagem de Eclosão dos Ovos Férteis. Exemplo: (86,4% Eclosão / 96,0% Fertilidade) x 100 = 90,0% Eclosão dos Ovos Férteis O cálculo da Porcentagem de Eclosão dos Ovos Férteis nos permite identificar, de forma rápida, se a fonte do problema está relacionada à fertilidade ou à incubação. Os incubatórios com os melhores resultados apresentam boa taxa de fertilidade e um bom programa de manejo de incubação. Esses são os elementos-chave para se alcançar o objetivo principal: um bom custo final por ave. A idade do lote de ovos pode influenciar, negativa ou positivamente, a eclodibilidade. Deve-se considerar a idade do lote, uma vez que os padrões de eclodibilidade e de fertilidade se modificam à medida que o lote envelhece. A idade dos ovos é também importante, pois quanto mais prolongado é o tempo de estocagem dos ovos, menor é taxa de eclosão. É preciso ter cuidado para não confundir morte embrionária precoce com ovo infértil; esse é um erro comum. Como um primeiro passo, deve-se realizar a ovoscopia, em incubatórios em que a mesma seja possível, entre 10º e o 12º dias de incubação. Primeiro deve-se selecionar o lote fonte a ser examinado. Selecionar pelo menos quatro bandejas de diferentes locais no interior da incubadora. Existem duas razões para isso: a amostra da incubadora será melhor - parte superior, média e inferior - e será mais representativa da postura. Nunca se devem selecionar bandejas em seqüência. É muito importante, também, identificar as bandejas em que a ovoscopia tenha sido realizada. Desta forma, a equipe que realizará a transferência saberá que os ovos foram submetidos à ovoscopia e que deverão ser marcados nas bandejas do nascedouro para que os resíduos possam ser examinados na quebragem realizada no 21º dia. 4.1. Miragem dos ovos (ovoscopia) Durante o decorrer da incubação convém fazer a miragem dos ovos com um ovoscópio (ou uma lâmpada com a luz direta sobre o ovo), não só para retirar os ovos inférteis como aqueles em que o embrião tenha morrido. Geralmente fazem-se duas miragens ao 7º dia e ao 14º dia. Na primeira
44 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino retiram-se os inférteis e os mortos se não tiver dúvidas, na segunda as duvidas já estarão esclarecidas e, se estiverem mortos os embriões, retiram-se os ovos. A segunda miragem também serve para observar se as câmaras de ar estão se desenvolvendo conforme o desejado. A manipulação dos ovos deve ser realizada com luvas limpas e higienizadas. OVOSCÓPIO: É um instrumento que utiliza um feixe de luz que passa através do ovo sem quebrá-lo, sendo capaz de observar o que acontece lá dentro. Destacando as seguintes categorias: Ovos que não estão embrionados Mortos no princípio de incubação Mortos no final da incubação Ovos viáveis Essas categorias são necessárias a fim de construir os índices que indicam se foi bem sucedida ou não a incubação e, eventualmente, determinar as possíveis causas das mortes. Qualquer investigação sobre o baixo nascimento inclue o exame embrionário. Alguns pontos principais a serem observados: 1. Tamanho do ovo e qualidade da casca 2. Câmara de ar 3. Posição do embrião no ovo 4. Anormalidades anatômicas 5. Anormalidades nutricionais 6. Albúmen não incorporado 7. Idade do embrião Tabela 1. Diferentes idades embrionárias e mortalidades em lotes normais. Fonte: COBB (2008)
Embriodiagnóstico 45 Figura 5. Ovoscopia realizada dentro da própria máquina incubadora. O manual da COBB (2008) para incubatórios também lista as principais causas de falhas dos nascimentos: Armazenamento do ovo Nutrição das matrizes Infertilidade verdadeira (idade da matriz) Doenças Contaminação por bactéria ou fungo Genética Deformação da casca e casca trincada Erros de incubação 4.2. Análise embrionária A técnica de embriodiagnóstico consiste em uma ferramenta de grande utilidade em empresas avícolas, pois permite diagnosticar as possíveis causas de baixa produtividade nos incubatórios, seja por deficiências nos matrizeiros fornecedores de ovos férteis, ou pelo próprio manejo inadequado nos setores do incubatório. Sua aplicação, como parte de um programa de qualidade é refletido na economia do sistema de produção avícola, obtendo um maior número de pintos nascidos. Vários estudos realizados em outros países, como Suarez (1996), Brake (1999), Wilson (2003) e Bourassa et al. (2003) avaliaram os fatores que influenciam o sucesso ou o fracasso do processo de incubação para lidar com questões relacionadas com a eclosão dos ovos. O embriodiagnóstico tem sido usado em incubatórios industriais estrategicamente para identificar os erros e também tem sido aplicado ao trabalho feito por alguns pesquisadores como: Sisti et al. (1993), Romero (1997), Plano (2001), Plano & Di Matteo (2003), e Sandoval et al (2005). Aplicando embriodiagnóstico é possível identificar três períodos de
46 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino mortalidade embrionária: precoce (desde o início até o quarto dia de incubação), médio (a partir do quinto para o décimo sétimo dia de incubação) e tardia (a partir do décimo oitavo ao portal). Entre outras coisas, esta metodologia permite a diferenciação infertilidade de mortalidade precoce embrionária. Ações para corrigir estes dois tipos de erros são diferentes: o nível de infertilidade à nível de reprodutores e mortalidade embrionária precoce, devido ao transporte e ao manejo do ovo no incubatório. A técnica consiste no exame interno dos ovos não eclodidos, determinando as causas do não nascimento, ou seja, se houve infertilidade ou mortalidade e em alguma etapa do processo de incubação. Uma vez detectadas as causas da não eclosão, o responsável técnico poderá aplicar as medidas corretivas diretamente no setor relacionado como: na granja fornecedora de ovos férteis, no transporte destes ovos até o incubatório, as unidades que constituem o incubatório ou até mesmo, na fábrica de ração responsável pela elaboração das dietas das aves reprodutoras. A ovoscopia é uma técnica indispénsável, entretanto, para verificar com precisão qual seria a etmologia dos problemas associados à ineficiência de incubação é preciso realizar a quebragem dos ovos. A quebragem é uma ferramenta útil, pois fornece dados precisos sobre a fertilidade. Para que se obtenha boa taxa de eclosão, é preciso boa fertilidade. A quebragem, realizada no momento certo e de forma correta, fornecerá a informação sobre a fertilidade. Mesmo no caso de incubadoras em que seja difícil realizar a quebragem na ovoscopia, pode-se ainda realizar a análise dos resíduos pode ser bastante precisa, porém é preciso bastante treino para evitar erros. É importante que o encarregado da quebragem e análise seja bem treinado. Essa pessoa deve ser responsável por todas as quebragens, garantindo dessa forma a uniformidade do processo. Se houver mais de um incubatório na granja, os responsáveis pela quebragem devem reunir-se regularmente para garantir a padronização dos procedimentos de quebragem. Deve-se utilizar a planilha de embriodiagnóstico sempre que a quebragem for realizada. As informações devem ser anotadas de forma precisa e detalhadas. A eclosão, a fertilidade e a eclosão dos ovos férteis devem sempre ser calculadas. A eclosão dos ovos férteis deve ser utilizada, pois o incubatório não tem nenhum controle sobre a fertilidade dos ovos que chegam para serem incubados, mas tem controle sobre a eclosão dos ovos férteis recebidos. Antes de iniciar o embriodiagnóstico, deve-se escolher uma área bem iluminada para realizar quebragem. Devem estar à mão a planilha de embriodiagnóstico, luvas de borracha, o instrumento para remover a parte superior dos ovos, uma fonte de luz para a ovoscopia e um balde para os resíduos.
Embriodiagnóstico 47 Durante a quebragem, é importante determinar quando ocorreu a morte embrionária. Cada ovo quebrado deve encaixar-se em uma das seguintes categorias: infértil; morte embrionária precoce, entre 1º e o 7º dia; morte embrionária intermediária, 8º ao 14º; ou morte embrionária tardia, entre o 15º e o 21º dia. Todos os ovos ou pintos deixados nas bandejas não entram na contagem como eclodidos e, portanto, deverão ser computados. Saber o que ocorre durante os diferentes estágios do desenvolvimento embrionário facilita a determinação da morte embrionária. Após 24 horas de desenvolvimento, o bastoderma terá cerca de 1,2 centímetro de diâmetro e, passadas 48 horas, terá de 2 a 2,5 centímetro. Entre 48 e 72 horas, o anel sanguíneo já estará visível. No 7º dia, que é o último dia para que se diagnostique a morte embrionária precoce, o "dente" que aparece na extremidade do bico. O quadro de referência ajuda a identificar corretamente o dia em que acorreu a morte embrionária. Em plantéis normais, não deve ocorrer morte embrionária entre 8 e 14 dias. No primeiro dia da fase tardia, o 15º dia, os intestinos migram para dentro da cavidade corporal. No 17º dia, a cabeça do embrião ainda se encontra entre as pernas, não devendo ser confundido com um embrião mal posicionado. No 18º dia, o saco vitelino ainda está fora do corpo do embrião, migrando para o seu interior no 19º dia. Há, também, alguns elementos óbvios que devem ser observados durante a quebragem. O mofo, por exemplo, geralmente indica problemas no fluxo de ar. Um dos fatores-chave para o diagnóstico é procurar indicadores padronizados e não se deixar confundir por incidentes isolados. É preciso certificar-se de que um diagnóstico completo e detalhado foi realizado antes de tirar conclusões definitivas. Como foi mencionado anteriormente, o embriodiagnóstico pode ser a ferramenta mais útil dentro de um incubatório. Os encarregados devem aprender a utilizar as quebragens para elaborar planos de ação a fim de melhorar a eclosão, sabendo, entretanto, que não se deve parar por aí. Os resultados do plano de ação devem então ser monitorados. É importante que a padronização faça sempre parte do plano de ação. Se as porcentagens relativas a qualquer uma das categorias ficarem acima dos padrões, o lote e o equipamento devem ser examinados. Fazer a rechecagem do lote com outro equipamento, e do mesmo equipamento com um lote diferente, a fim de identificar o problema real. Nunca se deve tomar decisões baseadas em única quebragem. Toda informação registrada durante a quebragem deve ser utilizada para compor o histórico do lote e do equipamento. Mantendo-se o histórico do lote e do equipamento, será possível estabelecer tendências e prever os níveis de eclodibilidade.
48 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino Tabela 2. Principais problemas apresentados durante as diferentes fases do desenvolvimento embrionário.
Embriodiagnóstico 49 Continuação tabela 2.
50 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino Continuação tabela 2. Fonte: COBB (2008)
Embriodiagnóstico 51 Os encarregados da incubação e da recria devem sempre ter em mãos os resultados o mais rápido possível, para que possam então fazer o monitoramento desses resultados e ter mais segurança em relação à exatidão dos mesmos. É preciso lembrar que se as informações não forem aplicadas para melhorar o manejo, não há porque obtê-las. O manual da COBB (2008) lista os principais problemas apresentados durante o desenvolvimento embrionário (tabela 2). As informações oferecidas pelo manual da COBB (2008) são úteis, porém carecem de coerência, estando pontos críticos e o controle qualificado dentro da mesma categoria problemas. Galindo (2005) descreveu minuciosamente sobre os fatores interferidores nos processos de incubação, e seus prováveis agentes etiológicos (tabelas de 3 a 6), contribuindo com um grande volume de informação na deteção de pontos críticos (problemas), sua origem (etimologia) e como controlá-los (soluções). Tabela 3. Problemas, etimologia e soluções para infertilidade dos ovos. Problemas Etimologia Soluções Ovos inférteis Fêmeas sem inseminar, má relação machos/fêmeas; Preferências de monta em algumas divisões do galpão Machos estéreis Machos que não montam Machos muito velhos Usar mais machos/100 fêmeas Mude as fêmeas de divisões para que possam ser montadas por outros galos Substitua os machos Veja se há enfermidade, problemas de nutrição, problemas de patas ou se existe uma dominação social por parte das fêmeas Use machos jovens; ou reforce a monta natural pela inseminação artificial Fonte: Galindo (2005) Butcher & Nilipour (2005) reportaram que o embriodiagnóstico envolveria duas etapas, a ovoscopia, e depois a análise (quebra) dos ovos refugados, a fim de verificar a etimologia do fenômeno. 1- Avaliar três bandejas por fornecedor, um vez por semana 2- Identificar cada lote: identificação do criador, idade do lote de matrizes, linhagem, status de saúde, tipo de máquina, a duração do armazenamento, e localização de bandeja na incubadora 3- Quantificar: -% de não desenvolvidos
52 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino - % de nascimentos de pintainhos de primeira qualidade; - % de nascimentos de pintainhos de segunda qualidade; - % de ovos que explodiram ; - % de pintainhos mortos; destes: os com má formação, e qual a causa da morte; - % bicados, mas não nascidos. Tabela 4. Problemas, etimologia e soluções para mortalidade superior a 3% nos 3 primeiros dias de incubação. Problemas Etimologia Soluções Preovoposicionado cruzamento consangüíneo Variedades de raças com morto Paternogênese em galo Fértil sem Ovos armazenados a desenvolvimento temperaturas baixas Período de armazenamento dos ovos muito grande Ovos lavados em água muito quente Desenvolvimento Horário de recolhimento mal positivo (DP) programado nas épocas de frio e calor Blastodermo sem Temperatura inadequada no embrião (BSE) armazenamento dos ovos Embrião cístico Período de armazenamento dos ovos muito grande Procedimentos no transporte ou no manejo dos ovos Enfermidades (micoplasmas, Enfermidade de Newcastle) Esperma velho ou anormal Ovos de lotes com reprodutores de cruzamentos consangüíneos Armazenamento dos ovos em temperatura inadequada ou incubado em temperatura inadequada Ovos provenientes de galpões situados a mais de 1500 m de Fonte: Galindo (2005) Evitar a consangüinidade excessiva, usar machos jovens Não usar reprodutores com alta incidência de paternogênese Armazenamento dos ovos em temperatura adequada (13 e 20º C) O armazenamento de ovos férteis de galinhas,faisões, patas, gansos e codornas é por um tempo máximo de uma semana; os ovos de galinhas e perdizes podem ser armazenados no máximo por duas semanas, com perda na qualidade Limpe os ovos a seco; descarte os ovos sujos, ou abaixa a temperatura da lavadora; sempre tente obter ovos limpos provenientes da granja Quando a temperatura dos galpões e/ou dos ninhos excederem 20º C recolha os ovos o maior número de vezes possível durante o dia Armazenamento dos ovos em temperatura adequada (13 e 20º C) O armazenamento de ovos férteis de galinhas, faisões, patas, gansos e codornas é por um tempo máximo de uma semana; os ovos de galinhas e perdizes podem ser armazenados no máximo por duas semanas, com perda na qualidade Maior cuidado no manejo dos ovos desde o recolhimento até a eclosão Inspecionar o lote de reprodutores a respeito de doenças específicas Revise as Técnicas de Inseminação; use machos mais jovens Mudança de dos machos introduzindo uma nova genética Não permita a pré-incubação dos ovos a serem inseridos na incubadora; Revise a temperatura no local de armazenamento dos ovos; assegure-se qde que a temperatura seja de 37,5 C Evite alojar aves reprodutoras a estas altitudes
Embriodiagnóstico 53 Tabela 5. Problemas, etimologia e soluções para mortalidade superior à 0,5% nos 4 dias antes de efetuar a mudança para o nascedouro. Problemas Etimologia Soluções Muitos embriões mortos Temperatura inapropiada Apagão de energia sem causa conhecida Viragem inadequada dos ovos Ovos de lotes de reprodutores com cruzamentos consangüíneos Má ventilação na sala de incubação ou dentro das incubadoras Enfermidades ou ovos infectados Revise a precisão dos termômetros Se a energia falhar abra as incubadoras até o retorno Os ovos devem ser virados pelo 3 vezes ao dia Mudança de dos machos introduzindo uma nova genética Prover ventilação adequada para troca de ar Use ovos provenientes de lotes de reprodutores sadios, evite a lavagem dos ovos em água fria Fonte: Galindo (2005) Nääs et al. (2008) proporam o seguinte esquema: 96h e 438h de incubação, cada ovo é examinado ao ovoscópio. Os ovos que não apresentaram embriões viáveis serão retirados do processo e analisados quanto ao período de mortalidade embrionária. Aos 19 dias de incubação, os ovos são colocados em embalagens individuais com o objetivo de obter o peso de cada pinto em relação ao ovo. Para o embriodiagnóstico, as cascas são quebradas, e os conteúdos vertidos em uma placa de Petri e analisados. São classificados como inférteis os ovos com pontos brancos; os férteis com mortalidade precoce - mortos até quatro dias; os férteis com mortalidade intermediária mortos de cinco até 18 dias; e os férteis com mortalidade tardia - mortos de 19 a 22 dias de incubação. Ao final do período de incubação, avaliara-se a eclodibilidade de ovos férteis (%), a eclodibilidade total (%) e a fertilidade (%). É possível, utilizando a ferramenta do embriodiagnóstico, identificar possíveis agentes etiológicos para alguns pontos críticos dentro da planta do incubatório, auxiliando as ações de controle. Outra vantagem é a identificação de problemas de origem extra-incubatório, antes da chegada do ovo às instalações.
54 Wagner Azis Garcia de Araújo & Luis Fernando Teixeira Albino Tabela 6. Problemas, etimologia e soluções para mortalidade superior à 8% depois de efetuar a mudança para o nascedouro. Problemas Etimologia Soluções Os embriões morrem antes de começar a romper a casca Embriões débeis que no são capazes de romper a casca ou não o fazem com muito esforço Pintainhos recém nascidos aderidos à casca Pintainhos recém nascidos, mas mortos Mal posicionados Fonte: Galindo (2005) Temperaturas baixas durante a incubação; Humidade muito alta Ovos infectados Má nutrição dos lotes reprodutores Certos fatores genéticos letais Deficiência de Vitamina E Umidade muito baixa na nascedora Excessivos resíduos de albúmen causados por uma alta umidade e/ou baixa temperatura durante a incubação Enfermidades, Sobreaquecimento ou umidade baixa no nascedouro Deficiências nutricionais Ovos colocados com a parte mais delgada para cima Mantenha uma temperatura de 37.5 C no termômetro de bulbo seco e uma temperatura de 30 C no termômetro de bulbo húmido nas incubadoras com ventilação forçada. Evitar a lavagem dos ovos em água fria; incube somente os ovos limpos desde o ninho Revisar as fórmulas da ração dos reprodutores, quase todas as vitaminas e minerais conhecidos, em deficiência, podem causar mortalidade e má qualidade dos pintainhos, Usar raças vigorosas Usar sempre alimentos frescos ou suplementar a água de beber com vitamina E Manter uma temperatura de 32,5 C no termômetro de bulbo úmido, até o nascimento Revise a precisão dos termômetros e dos termostatos, vigiar a temperatura e a umidade Use ovos de lotes de aves sadias Revise a temperatura e a umidade do nascedouro Use ração balanceada Coloque os ovos na posição adequada nas bandejas (com a parte mais delgada para baixo) A malformação na fase embrionária pode estar associada a diferentes causas etiológicas, entretanto, a associação a defeitos genéticos são as mais consideradas no momento da avaliação. Contudo, o descarte no incubatório dos pintinhos malformados é inevitável, considerando que essas aves não sejam viáveis para a produção de frangos de corte. A técnica consiste na quebra individual dos ovos e avaliação do aspecto do embrião quando o
Embriodiagnóstico 55 mesmo estivesse presente. As características observadas e consideradas como malformação foram pintos com quatro membros pélvicos, duplicação do bico, ausência do bico, bico cruzado, ausência da caixa craniana, presença de duas cabeças, monoculares, ausência de globo ocular. Segundo Butcher & Nilipour (2005) o número de embriões que desenvolvem deformidades varia de 0,22 a 0,33% e não deveria exceder 0,33%.Ainda segundo Butcher & Nilipour (2005) o número de embriões inviáveis para incubação devido à mau posicionamento usualmente varia de 1,2 a 1,8% e não deveria exceder 2%. Tabela 7. Principais maus posicionamentos em embriões de aves. Descrição Incidência (%) Cabeça entre as coxas 12,5 Cabeça na parte delgada do ovo 7,5 Cabeça sob a asa esquerda 7,5 Cabeça não direcionada à câmara de ar 4,5 Pé sobre a cabeça 20,0 Bico sobre a asa direita 48,0 Fonte: Butcher & Nilipour (2005) Sandoval et al. (2005) observaram os ovos nos dias 12, 18 e 21 de incubação. Para o dia 12, a observação foi realizada no interior da incubadora, as bandejas foram retiradas e miragem de luz foi levado com uma lanterna iluminando o pólo superior dos ovos. Foram resgistrados o número de ovos nas categorias: inférteis (I), invertido (IN), contaminado (C), rachado precoce (FT) e mortalidade embrionária precoce (MET) (dias 1 a 4 de incubação). A MET foi classificada de acordo com o tempo de desenvolvimento embrionário em 18, 24, 48, 72 e 96 h de incubação. Os IN foram marcados com um marcador sem removê-los das bandejas. No dia 18 em ocorreu a transferência das incubadoras para as naceroas e se registrou o número de ovos quebrados na transferência (FET). No dia 21 o número de pintainhos de descarte (PDD), mortos (PM), malformados (M), ovso bicados não nascidos (PNN) e contaminados (C). Os ovos não eclodidos foram abertos pelo polo mais largo com uma colher no nível da câmara de ar, removendo a membrana testácea interna, sendo colocados sobre um prato e classificados como de mortalidade embrionária intermediária (MEI) (dias 5 a 17 de incubação) ou tardia (META) (dias 18 a 21 de incubação). Além disso, os IN não eclodidos foram quantificados para calcular o número de pintos nascidos de ovos invertidos (NIN).