COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test, version 2.0

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test, version 2.0 PARA UTILIZAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VITRO. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test, v2.0 HI2QCAP 48 Tests P/N: 06693083 190 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent PG WR 5.1 Liters P/N: 03587797 190 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Specimen Pre-Extraction Reagent SPEX 5 x 78 ml P/N: 06989861 190 UTILIZAÇÃO PRETENDIDA O Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, versão 2.0 é um teste de diagnóstico in vitro de amplificação total de ácidos nucleicos, que se destina à detecção qualitativa do ADN e ARN do Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1) (ou ácido nucleico total, ANT) no plasma humano ou em gotas secas de sangue (DBS), utilizando o equipamento COBAS AmpliPrep para o processamento automatizado de amostras e o analisador COBAS TaqMan ou analisador COBAS TaqMan 48 para a amplificação e detecção automatizadas. O teste é um teste de diagnóstico, indicado para indivíduos dos quais se suspeita que estejam activamente infectados com o HIV-1. A detecção de ANT de HIV-1 é indicativa de infecção activa pelo HIV. Os recém-nascidos de mães infectadas com o HIV-1 poderão ter anticorpos maternos do HIV-1, e a presença de ácido nucleico do HIV-1 no bebé indica infecção activa pelo HIV-1. Em adultos, o teste poderá ser utilizado para ajudar no diagnóstico para verificar a existência de infecção por HIV-1. RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico do Síndroma de Imunodeficiência Adquirida (SIDA) 1-3. A infecção por HIV pode ser transmitida por contacto sexual, por exposição a sangue infectado ou a produtos derivados do sangue infectado ou de uma mãe infectada para o feto 4. No prazo de três a seis semanas após a exposição ao HIV, os indivíduos infectados desenvolvem geralmente um síndroma agudo e de curta duração, caracterizado por sintomas semelhantes aos da gripe e associado a elevados níveis de viremia 5-8. Na maioria dos indivíduos infectados, isto é seguido por uma resposta imunitária específica do HIV e por um declínio da viremia plasmática, geralmente quatro a seis semanas após o início dos sintomas 9,10. Após a seroconversão, os indivíduos infectados entram normalmente numa fase assintomática e clinicamente estável, que pode ter a duração de vários anos 11-13. O período assintomático caracteriza-se por níveis de viremia plasmática baixos e persistentes 14 e por uma depleção gradual dos linfócitos CD4 + T, o que acaba por originar uma imunodeficiência grave, várias infecções oportunistas, doenças malignas e a morte 15. Embora os níveis de vírus no sangue periférico sejam relativamente baixos durante a fase assintomática da infecção, a replicação e depuração virais são aparentemente processos dinâmicos, nos quais as taxas elevadas de produção de vírus e de infecção de células CD4 + são contrabalançadas por taxas igualmente elevadas de depuração de vírus, morte das células infectadas e reabastecimento das células CD4 +, traduzindo-se em níveis relativamente estáveis de viremia plasmática e de células CD4 + 16-18. Os testes de amplificação de ácidos nucleicos podem diagnosticar a infecção por HIV durante os primeiros 18 meses de vida, enquanto o sangue do bebé ainda contém anticorpos maternos que complicam a interpretação de testes serológicos. 42 A detecção do ARN do HIV-1 em plasma e em gotas secas de sangue poderá proporcionar evidência de infecção actual, utilizando tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos, tais como a Reacção de Polimerização em Cadeia (PCR - Polymerase Chain Reaction) 27-29. O Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 (Teste Qual. CAP/CTM HIV-1, v2), utiliza tecnologia PCR para conseguir a sensibilidade máxima para a detecção qualitativa do ARN do HIV-1 em plasma anti-coagulado com EDTA e gotas secas de sangue de sangue total. PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO O Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 é um teste de diagnóstico in vitro de amplificação total de ácidos nucleicos, que se destina à detecção qualitativa do ADN e ARN do HIV-1 no plasma EDTA humano ou em gotas secas de sangue (DBS) em combinação com o Reagente de Pré-Extracção de Amostras (SPEX) do COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan. O Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 baseia-se em três processos principais: (1) preparação da amostra para isolar os ácidos nucleicos do HIV-1; (2) transcrição reversa do ARN alvo para produzir ADN complementar (cadn); e (3) amplificação por PCR do ADN e cadn alvo e detecção simultânea de sondas de detecção oligonucleotídica duplamente marcadas e clivadas específicas do alvo e do Controlo Interno (IC). A configuração é automática utilizando o equipamento COBAS AmpliPrep com o analisador COBAS TaqMan ou o analisador COBAS TaqMan 48. Para amostras de DBS, é necessário um passo de pé-extracção manual. A secção "Informações de revisão do documento" encontra-se no final deste documento. 07002475001-01PT 1 Doc Rev. 1.0

Selecção do alvo A selecção da sequência de ARN alvo do HIV-1 depende da identificação de regiões dentro do genoma do HIV-1 que apresentam uma conservação máxima da sequência entre as amostras dos vários subtipos de HIV-1 do grupo M e amostras de HIV-1 do grupo O. De modo a considerar a alta variabilidade genética do vírus, são visadas simultaneamente duas regiões do genoma do HIV-1 para amplificação e detecção pelo Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0. Duas sondas oligonucleotídicas duplamente marcadas específicas do alvo e uma específica do IC permitem a identificação independente do amplicon do HIV-1 e do amplicon do IC do HIV-1. Por conseguinte, a selecção apropriada dos iniciadores e das sondas de detecção oligonucleotídicas duplamente marcadas é essencial para que o teste tenha capacidade para amplificar e detectar os subtipos do grupo M do HIV-1 e o grupo O do HIV-1. O Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 utiliza transcrição reversa e iniciadores de amplificação por PCR para definir sequências dentro das regiões altamente conservadas do gene gag do HIV-1 32 e da região LTR do HIV-1. Preparação de amostras Procedimento pré-analítico para gotas secas de sangue (DBS) As gotas secas de sangue (DBS) são preparadas gotejando 70 μl de sangue total humano num cartão de filtro de papel e deixando secar. Antes de preparar o material de ácido nucleico para amplificação e detecção, as amostras são extraídas do filtro de papel. Esta extracção é executada manualmente, recortando um círculo do cartão de papel de filtro com a gota de sangue seco para um tubo-s do COBAS AmpliPrep, adicionando Reagente de Pré-Extracção de Amostras (SPEX) do COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan e incubando a uma temperatura elevada com mistura. As amostras ficam então prontas para preparação automática de amostras no equipamento COBAS AmpliPrep. Para informações detalhadas da configuração, consulte as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO. Preparação automática de amostras O Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 utiliza a preparação automática de amostras no equipamento COBAS AmpliPrep através de uma técnica genérica de captura à base de sílica. As células e partículas virais são lisadas por incubação a temperatura elevada com um tampão caotrópico de lise/ligação, que liberta ácidos nucleicos e protege o ARN e ADN libertados das nucleases da amostra. Partículas magnéticas de vidro juntamente com o reagente de lise e uma quantidade conhecida de Controlo Interno de HIV-1 (IC, moléculas de Armored RNA) são introduzidos em cada tubo de amostra. Subsequentemente, a mistura é incubada e os ácidos nucleicos da amostra e o ARN do CI do HIV-1 ligam-se à superfície das partículas magnéticas de vidro. As substâncias não ligadas, tais como sais, proteínas e outras impurezas celulares, são removidas lavando as partículas magnéticas de vidro. Depois da separação das partículas magnéticas de vidro e a conclusão dos passos de lavagem, os ácidos nucleicos adsorvidos são eluídos a uma temperatura elevada com uma solução aquosa. A amostra processada (contendo as partículas magnéticas de vidro, assim como os ácidos nucleicos do HIV-1 libertados e o ARN do CI do HIV-1), é adicionada à mistura de amplificação pelo equipamento COBAS AmpliPrep e transferida para o analisador COBAS TaqMan ou o analisador COBAS TaqMan 48. Transcrição reversa e amplificação por PCR A reacção de transcrição reversa e amplificação por PCR é efectuada com a enzima termoestável recombinante Thermus specie Z05 de Polimerase do ADN (Z05). Na presença de manganês (Mn 2+ ) e sob condições de tamponamento apropriadas, a Z05 apresenta uma actividade simultaneamente de transcriptase reversa e de polimerase do ADN 30,31. Isto permite que a transcrição reversa e a amplificação por PCR ocorram em conjunto com a detecção em tempo real do amplicon. As amostras processadas são adicionadas à mistura de amplificação em tubos de amplificação (tubos-k) nos quais têm lugar a transcrição reversa e a amplificação por PCR. A mistura de reacção é aquecida para permitir que os iniciadores a jusante se liguem especificamente ao ARN alvo do HIV-1 e ao ARN do IC do HIV-1. Na presença de Mn 2+ e de trifosfatos de desoxinucleósidos em excesso (dntps), incluindo trifosfatos de desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxicitidina e desoxiuridina, a polimerase Z05 alonga os iniciadores ligados, dando origem a cadeias de ADN complementares do ARN alvo. Amplificação do Alvo As amostras processadas são adicionadas à mistura de amplificação em tubos de amplificação (tubos-k) nos quais ocorre a amplificação por PCR. Após a transcrição reversa do ARN alvo do HIV-1 e do ARN do IC do HIV-1, o termociclador do analisador COBAS TaqMan ou do analisador COBAS TaqMan 48 aquece a mistura de reacção para desnaturar os híbridos ARN:cADN e expor as sequências alvo específicas do iniciador. À medida que a mistura arrefece, os iniciadores ligam-se ao ADN alvo. Na presença de Mn 2+ e de trifosfatos de desoxinucleósidos em excesso (dntps), incluindo trifosfatos de desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxicitidina, desoxiuridina e desoxitimidina, a Z05 prolonga os iniciadores ligados ao longo do modelo alvo para produzir moléculas de ADN de dupla cadeia denominadas amplicons. O analisador COBAS TaqMan ou o analisador COBAS TaqMan 48 repete automaticamente este processo durante um determinado número de ciclos, cada um duplicando a quantidade de ADN amplicon. O número necessário de ciclos é pré-programado no analisador COBAS TaqMan ou no analisador COBAS TaqMan 48. A amplificação ocorre apenas nas duas regiões do genoma do HIV-1 que se encontram entre os iniciadores; não é amplificada a totalidade do genoma do HIV-1. 07002475001-01PT 2 Doc Rev. 1.0

Amplificação selectiva No Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, a amplificação selectiva do ácido nucleico alvo da amostra é conseguida com a utilização de uma enzima AmpErase (uracil-n-glycosylase) e de trifosfato de desoxiuridina (dutp). A enzima AmpErase reconhece e catalisa a destruição de cadeias de ADN que contêm desoxiuridina 33, mas não o ADN que contém desoxitimidina. A desoxiuridina não se encontra em ADN existente na natureza, mas está sempre presente no amplicon, devido ao uso de trifosfato de desoxiuridina como um dos dntps do reagente da Mistura Principal; por conseguinte, apenas o amplicon contém desoxiuridina. A deoxiuridina torna o amplicon contaminante susceptível à destruição pela enzima AmpErase antes da amplificação do ADN alvo. Igualmente, qualquer produto não específico formado após a activação inicial da Mistura Principal pelo manganês é destruído pela enzima AmpErase. A enzima AmpErase, que está incluída no reagente da Mistura Principal, catalisa a clivagem do ADN contendo desoxiuridina nos resíduos de desoxiuridina, abrindo a cadeia de desoxiribose na posição C1. Quando aquecida no primeiro passo do ciclo térmico, a cadeia de ADN do amplicon quebra-se na posição da desoxiuridina, tornando assim o ADN não amplificável. A enzima AmpErase permanece inactiva durante um longo período de tempo uma vez exposto a temperaturas acima dos 55 C, ou seja, durante os passos de ciclismo térmico, pelo que não destrói o amplicon alvo formado durante a amplificação. Detecção de produtos da PCR num Teste COBAS TaqMan O Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 utiliza tecnologia de PCR em tempo real 34,35. A utilização de sondas fluorescentes duplamente marcadas permite a detecção em tempo real da acumulação de produtos de PCR, ao monitorizar a intensidade de emissões de corantes sinalizadores fluorescentes libertados durante o processo de amplificação. As sondas consistem em sondas oligonucleotídicas específicas do HIV-1 e do IC do HIV-1 com um corante sinalizador e um corante supressor. No Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, as sondas do HIV-1 e do IC do HIV-1 estão marcadas com diferentes corantes sinalizadores fluorescentes. Quando estas sondas estão intactas, a fluorescência do corante sinalizador é suprimida pela proximidade do corante supressor devido aos efeitos de transferência de energia do tipo Förster. Durante a PCR, a sonda hibridiza-se a uma sequência alvo e é clivada pela actividade da nuclease 5' 3' da polimerase do ADN Z05 termoestável. Uma vez libertados e separados os corantes de sinalização e de supressão, a supressão deixa de ocorrer, e é aumentada a actividade fluorescente do corante sinalizador. A amplificação do ARN do HIV-1 e do ARN do IC do HIV-1 são medidas independentemente, a diferentes comprimentos de onda. Este processo é repetido durante um determinado número de ciclos, sendo a intensidade da emissão dos corantes sinalizadores individuais aumentada eficazmente com cada ciclo, permitindo a identificação independente do ARN do HIV-1 e do ARN do IC do HIV-1. O ciclo de PCR em que uma curva de crescimento inicia um crescimento exponencial relaciona-se com a quantidade de material iniciador no começo da PCR. REAGENTES COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test, v2.0 (P/N: 06693083 190) HIV-1 QL v2.0 CS1 (Cassete de Reagente de Partículas Magnéticas de Vidro do HIV-1) Partículas magnéticas de vidro 93% de isopropanol HI2QCAP 48 Tests 1 x 48 Testes 93% (p/p) de isopropanol H225, H319, H336 HIV-1 QL v2.0 CS2 (Cassete de Reagente de Lise do HIV-1) Citrato de sódio desidratado 42,5% de tiocianato de guanidina < 14% de polidocanol 0,9% de ditiotreitol 1 x 48 Testes 42,5% (p/p) de tiocianato de guanidina H302, H315, H318, H412 07002475001-01PT 3 Doc Rev. 1.0

HIV-1 QL v2.0 CS3 Cassete Multi-Reagente de HIV-1 contendo: Pase (Solução de proteinase) Tampão Tris < 0,05% de EDTA Cloreto de cálcio Acetato de cálcio < 7,8% de Proteinase Glicerol 1 x 48 Testes 1 x 3,8 ml < 7,8% (p/p) de Proteinase H318, H334 EB (Tampão de eluição) Tampão base Tris 0,2% de metilparabeno 1 x 7,0 ml HIV-1 QL v2.0 CS4 1 x 48 Testes Cassete de Reagente Específica de Teste HIV-1 contendo: HIV-1 IC 1 x 3,6 ml (Controlo interno do HIV-1) Tampão Tris-HCl EDTA < 0,005% Poli ra ARN (sintético) < 0,001% de estrutura de Armored RNA do HIV-1 contendo sequências de ligação do iniciador do HIV-1 e uma região única de ligação da sonda (ARN não infeccioso em bacteriófagos MS2) 0,05% de azida sódica HIV-1 MMX (Mistura Principal HIV-1) Tampão de tricina Acetato de potássio Hidróxido de potássio 20% de dimetilsulfóxido Glicerol < 0,04% de datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,003% de iniciadores a montante e a jusante para o gene gag e a região LTR do HIV-1 < 0,003% de aptâmero oligonucleotídico < 0,003% de sondas oligonucleotídicas de marcação fluorescente específicas para o HIV-1 e para o Controlo Interno do HIV-1 < 0,05% de polimerase do ADN Z05 (de origem microbiana) < 0,1% de enzima de AmpErase (uracil-n-glicosilase) (de origem microbiana) 0,09% de azida sódica CAP/CTM Mn 2+ (Solução de Manganês CAP/CTM) < 0,5% de acetato de manganês Ácido acético glacial 0,09% de azida sódica HIV-1 (+)C, v2.0 (Controlo Positivo do HIV-1, v2.0) < 0,001% de Armored RNA do HIV-1 contendo sequências de HIV-1 (ARN não infeccioso em bacteriófago MS2) Plasma humano negativo, não reactivo em testes para anticorpos contra HCV, anticorpos contra HIV-1/2, antigénio p24 do HIV e HBsAg; ARN do HIV-1, ARN do HCV e ADN do HBV não detectáveis por métodos de PCR 0,1% de conservante ProClin 300 1 x 2,5 ml 1 x 19,8 ml 4 x 1,0 ml (3:1) mistura de 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona e 2-metil-2H-isotiazol-3-ona 07002475001-01PT 4 Doc Rev. 1.0

CTM ( ) C [Controlo Negativo (Plasma Humano) COBAS TaqMan ] Plasma humano negativo, não reactivo em testes para anticorpos contra HCV, anticorpos contra HIV-1/2, antigénio p24 do HIV e HBsAg; ARN do HIV-1, ARN do HCV e ADN do HBV não detectáveis por métodos de PCR 0,1% de conservante ProClin 300 4 x 1,0 ml (3:1) mistura de 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona e 2-metil-2H-isotiazol-3-ona HIV-1 (+)C, v2.0 Clip (Clipe de Códigos de Barras de Controlo Positivo do HIV-1, v2.0) HIV-1 ( ) C Clip (Clipe de Códigos de Barras de Controlo Negativo do HIV-1, v2.0) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Reagente de Lavagem do COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: 03587797 190) PG WR (Reagente de Lavagem do COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) Citrato de sódio desidratado < 0,1% de N-Metilisotiazolona-HCl COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Specimen Pre-Extraction Reagent Reagente de Pré-Extracção de Amostras do COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: 06989861 190) PG WR SPEX 1 x 4 Clips 1 x 4 Clips 1 x 5,1 l 5 x 78 ml SPEX (Reagente de Pré-Extracção de Amostras do COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) 4 M GuSCN 30 mm de citrato de sódio 4% de Polidocanol 2% DTT 42,5% (p/p) de tiocianato de guanidina H302, H318, H412 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES A. PARA UTILIZAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VITRO. B. Este teste não se destina a ser utilizado em rastreio de sangue ou dadores de plasma. C. Este teste destina-se a ser utilizado com plasma humano e gotas secas de sangue preparadas a partir de sangue total fresco colhido em anticoagulante EDTA. D. Não efectue pipetagem com a boca. E. Não comer, beber ou fumar em áreas de trabalho laboratorial. Usar luvas protectoras descartáveis, bata de laboratório e protecção para os olhos quando manusear amostras e reagentes do kit. Lave cuidadosamente as mãos após manusear amostras e reagentes do teste. F. Evite a contaminação microbiana e por ribonuclease dos reagentes quando remover alíquotas dos frascos de controlo. G. Recomenda-se a utilização de pipetas esterilizadas descartáveis e de pontas de pipeta isentas de RNase. H. Não misture controlos de lotes diferentes nem de frascos diferentes do mesmo lote. 07002475001-01PT 5 Doc Rev. 1.0

I. Não misture cassetes de reagentes ou controlos de kits diferentes. J. Não abra cassetes COBAS AmpliPrep, nem troque, misture, retire ou adicione frascos. K. Elimine os reagentes não usados, desperdícios e amostras em conformidade com os regulamentos nacionais, federais, estaduais e locais. L. Não utilize um kit fora do prazo de validade. M. Encontram-se disponíveis Fichas de Dados de Segurança dos Materiais (MSDS, Material Safety Data Sheets) que podem ser solicitadas ao representante local da Roche. N. As amostras e os controlos deverão ser manipulados como se estivessem infectados, utilizando procedimentos de laboratório seguros, tais como os indicados em Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 37 e no Documento M29-A3 do CLSI 38. Limpe e desinfecte cuidadosamente todas as superfícies de trabalho com uma solução recentemente preparada de hipoclorito de sódio a 0,5% em água desionizada ou destilada. Nota: A lixívia líquida doméstica contém habitualmente hipoclorito de sódio a uma concentração de 5,25%. Uma diluição de lixívia doméstica de 1:10 irá dar origem a uma solução de hipoclorito de sódio a 0,5 %. O. ATENÇÃO: O CTM ( ) C e o HIV-1 (+)C, v2.0 contêm plasma humano derivado do sangue humano. O material de origem foi submetido a testes e considerado como não reactivo para a presença de antigénio de superfície da Hepatite B (HBsAg), anticorpos contra o HIV-1/2 e o HCV, e antigénio p24 do HIV. Testes ao Plasma Humano Negativo efectuados com métodos PCR não detectaram ARN de HIV-1, ARN de HCV ou ADN de HBV. Nenhum método de teste conhecido pode oferecer uma garantia completa de que os produtos derivados do sangue humano não transmitirão agentes infecciosos. Por conseguinte, todo o material de origem humana deverá ser considerado como potencialmente infeccioso. O CTM ( ) C e o HIV-1 (+)C, v2.0 deverão ser manipulados como sendo infecciosos, utilizando procedimentos de laboratório seguros, tais como os descritos em Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 37 e no Documento M29-A3 do CLSI 38. Limpe e desinfecte cuidadosamente todas as superfícies de trabalho com uma solução recentemente preparada de hipoclorito de sódio a 0,5% em água desionizada ou destilada. P. O HIV-1 IC, CAP/CTM Mn 2+ e o HIV-1 MMX contêm azida sódica. A azida sódica pode reagir com tubagens de chumbo e de cobre, produzindo azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar soluções com azida sódica pela canalização do laboratório, lave os canos com água em abundância, de modo a evitar a acumulação de azidas. Q. Use protecção para os olhos, bata de laboratório e luvas descartáveis quando manusear qualquer reagente. Evitar o contacto destes materiais com a pele, olhos ou membranas mucosas. Se ocorrer contacto, lavar imediatamente com água em abundância. Caso não seja efectuado tratamento, podem surgir queimaduras. Caso ocorra derramamento destes reagentes, dilua com água antes de limpar. R. Não permita que HIV-1 QL v2.0 CS2 e desperdícios líquidos do equipamento COBAS AmpliPrep, que contêm tiocianato de guanidina, entrem em contacto com solução de hipoclorito de sódio (lixívia). Estas misturas podem produzir um gás altamente tóxico. S. Ao eliminar Unidades de Processamento de Amostra (SPUs) COBAS AmpliPrep já usadas e que contêm tiocianato de guanidina, evite qualquer contacto com solução de hipoclorito de sódio (lixívia). Estas misturas podem produzir um gás altamente tóxico. REQUISITOS DE ARMAZENAMENTO E MANUSEAMENTO A. Não congele reagentes ou controlos. B. Armazene os HIV-1 QL v2.0 CS1, HIV-1 QL v2.0 CS2, HIV-1 QL v2.0 CS3 e HIV-1 QL v2.0 CS4 entre 2 e 8 C. Sem terem sido usados, estes reagentes mantêm-se estáveis até ao fim do prazo de validade indicado. Uma vez usados, estes reagentes mantêm-se estáveis durante 28 dias entre 2 e 8 C, ou até ao fim do prazo de validade indicado, o que primeiro se verificar. Os HIV-1 QL v2.0 CS1, HIV-1 QL v2.0 CS2, HIV-1 QL v2.0 CS3 e HIV-1 QL v2.0 CS4 podem ser usados durante um máximo de 4 ciclos do equipamento, até um máximo de 64 horas acumuladas a bordo do equipamento COBAS AmpliPrep. Entre os ciclos do equipamento, os reagentes devem ser armazenados entre 2 e 8 C. C. Armazene os HIV-1 (+)C, v2.0 e CTM ( ) C entre 2 e 8 C. Os controlos mantêm-se estáveis até ao fim do prazo de validade indicado. Uma vez abertos, qualquer porção não utilizada deve ser eliminada. D. Armazene os clipes de códigos de barras [HIV-1 (+)C, v2.0 Clip e HIV-1 ( ) C Clip] a uma temperatura entre 2 e 30 C. 07002475001-01PT 6 Doc Rev. 1.0

E. Armazene o PG WR a uma temperatura entre 2 e 30 C. O PG WR mantém-se estável até ao fim do prazo de validade indicado. Uma vez aberto, este reagente mantém-se estável durante 28 dias a uma temperatura entre 2 e 30 C, ou até ao fim do prazo de validade indicado, o que primeiro se verificar. MATERIAIS FORNECIDOS COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test, v2.0 (P/N: 06693083 190) HI2QCAP HIV-1 QL v2.0 CS1 (Cassete de Reagente de Partículas Magnéticas de Vidro do HIV-1) HIV-1 QL v2.0 CS2 (Cassete de Reagente de Lise do HIV-1) HIV-1 QL v2.0 CS3 (Cassete de Multi-Reagentes do HIV-1) HIV-1 QL v2.0 CS4 (Cassete de Reagente Específico do Teste do HIV-1) HIV-1 (+)C, v2.0 (Controlo Positivo do HIV-1, v2.0) CTM ( ) C [Controlo Negativo (Plasma Humano) do COBAS TaqMan ] HIV-1 (+)C, v2.0 Clip (Clipe de Códigos de Barras de Controlo Positivo do HIV-1, v2.0) HIV-1 ( ) C Clip (Clipe de Códigos de Barras de Controlo Negativo do HIV-1, v2.0) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Reagente de Lavagem do COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: 03587797 190) PG WR PG WR (Reagente de Lavagem do COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Specimen Pre-Extraction Reagent Reagente de Pré-Extracção de Amostras do COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: 06989861 190) SPEX MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS Equipamentos e Software Equipamento COBAS AmpliPrep Analisador COBAS TaqMan ou analisador COBAS TaqMan 48 Opcional: Estação de ancoragem Software AMPLILINK, série 3.3 Estação de dados para o software AMPLILINK, com impressora Manuais do software AMPLILINK, versão série 3.3: Manual do Equipamento do equipamento COBAS AmpliPrep para utilização com o analisador COBAS TaqMan, o analisador COBAS TaqMan 48 e o software AMPLILINK, versão série 3.3 07002475001-01PT 7 Doc Rev. 1.0

Manual do Equipamento do analisador COBAS TaqMan (mais estação de ancoragem opcional) para utilização com o Manual de Aplicação do software AMPLILINK, versão série 3.3 Manual do Equipamento do analisador COBAS TaqMan 48 para utilização com o Manual de Aplicação do software AMPLILINK, versão série 3.3 ou Manual de Aplicação do software AMPLILINK versão série 3.3 para utilização com o equipamento COBAS AmpliPrep, o analisador COBAS TaqMan e o analisador COBAS TaqMan 48 Ficheiros de Definições de Testes (TDF) do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, versão 2.0 (para o nome e a versão do TDF apropriado, consulte o Cartão Informativo do Produto (PIC) fornecido com o kit) Produtos descartáveis Unidades de processamento de amostras (SPUs) Tubos de entrada de amostras (tubos-s) com clipes de código de barras Racks de pontas-k Caixa de tubos-k de 12 x 96 OUTROS MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS Rack de amostras (rack SK 24) Rack de reagentes Rack de SPUs Aplicador de tampas em tubos-k, motorizado Aplicador de tampas em tubos-k Suporte-K Transportador de suporte-k Rack de suportes-k Pipetas com pontas com barreira para aerossóis ou de deslocamento positivo isentas de RNase (capacidade de 1000 μl)* Luvas descartáveis, sem pó Misturador de agitação forte Eppendorf Thermomixer comfort (apenas para aplicação de gotas secas de sange (DBS)) Sacos dessecantes (para armazenamento de DBS) IsoRack (número de encomenda Eppendorf 3880 001.034): encaixe para racks de 24 posições no Eppendorf Thermomixer comfort (apenas para aplicação de DBS) Cartões de filtro Whatman 903 ou cartão Munktell Specimen Collection TFN Brand 5 ou equivalente (apenas para aplicação de DBS) * A precisão das pipetas deve situar-se dentro de 3% do volume indicado. Devem ser usadas pontas com barreira para aerossóis ou de deslocamento positivo e isentas de RNase sempre que tal for especificado, para impedir a contaminação cruzada da amostra e do amplicon. 07002475001-01PT 8 Doc Rev. 1.0

COLHEITA, TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Nota: Manuseie todas as amostras e controlos tendo em conta a possibilidade de transmitirem agentes infecciosos. Nota: Este teste foi validado para utilização exclusiva com amostras de plasma humano colhidas no anticoagulante EDTA e amostras de sangue total colhidas em gotas secas de sangue. A utilização de outro tipo de amostras pode dar origem a resultados imprecisos. A. Colheita de amostras Plasma EDTA O Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 v2.0 destina-se a ser utilizado com amostras de plasma. O sangue deve ser colhido em tubos esterilizados com EDTA (tampa lilás) como anticoagulante, e misturado adequadamente de acordo com as instruções do fabricante dos tubos. Armazene o sangue total entre 2 e 25 C durante um período não superior a 24 horas. Separe o plasma do sangue total no prazo de 24 horas desde o momento da colheita, através de centrifugação a 800-1600 x g durante 20 minutos à temperatura ambiente. Transfira o plasma para um tubo de polipropileno esterilizado. Gotas secas de sangue (DBS) Efectue a colheita de amostras de gotas secas de sangue (DBS) utilizando procedimentos clínicos adequados. Recomenda-se a aplicação de um mínimo de 70 μl de sangue capilar dentro de cada círculo delineado no cartão de filtro Whatman 903 ou no cartão Munktell Specimen Collection TFN Brand 5 ou equivalente. Utilize papel de filtro, certificando-se de que AMBOS os lados do papel ficam saturados para além do círculo delineado. Deixe a amostra de DBS secar à temperatura ambiente (entre 18 e 25 C) durante pelo menos 3 horas, protegendo o cartão de DBS da luz directa do sol. Para mais detalhes, consulte o folheto informativo dos cartões de filtro utilizados. Recomenda-se que sejam preparados 3 discos de papel por amostra de doente. B. Transporte de amostras O transporte de sangue total ou de plasma deve obedecer às regulamentações nacionais, federais, estatais e locais relativas ao transporte de agentes etiológicos 39. O sangue total deve ser transportado entre 2 e 25 C e centrifugado no prazo de 24 horas após a colheita. O plasma pode ser transportado entre 2 e 8 C ou congelado entre -20 C e -80 C. C. Armazenamento de amostras Plasma EDTA As amostras de plasma podem ser armazenadas à temperatura ambiente (entre 25 e 30 C) durante 1 dia ou entre 2 e 8 C durante um máximo de 5 dias. As amostras de plasma mantêm-se estáveis durante seis semanas, se congeladas entre 20 C e 80 C. Recomenda-se que as amostras sejam armazenadas em alíquotas de in 1100 a 1200 μl, em tubos de polipropileno esterilizados de 2,0 ml, com tampas de enroscar (tais como os Sarstedt 72.694.006). As amostras de plasma podem ser congeladas e descongeladas até um número máximo de três vezes sem uma significativa perda de ARN do HIV-1. Gotas secas de sangue (DBS) Armazene as gotas secas de sangue à temperatura ambiente em sacos individuais resseláveis com saquetas dessecantes, durante um máximo de três meses. INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO Para instruções de funcionamento detalhadas, uma descrição das configurações possíveis, impressão de resultados e interpretação de alarmes, comentários e mensagens de erro, consulte os manuais do software AMPLILINK, versão série 3.3, conforme indicado na lista da secção Equipamentos e Software. Tamanho do lote e Configuração Cada kit contém reagentes suficientes para 48 testes, que podem ser efectuados em lotes de 12 a 24 testes. Pelo menos um de cada controlo [CTM ( ) C e HIV-1 (+)C, v2.0] deve ser incluído em cada lote (consultar a secção Controlo de Qualidade ). A execução no analisador COBAS TaqMan ou no analisador COBAS TaqMan 48 tem que ser iniciada no prazo de 120 minutos após a conclusão da preparação de amostras e controlos. Nota: Não congele nem armazene amostras e controlos processados entre 2 e 8 C. 07002475001-01PT 9 Doc Rev. 1.0

Preparação de amostras e controlos Nota: Se utilizar amostras congeladas, coloque as amostras à temperatura ambiente até ficarem completamente descongeladas e misture com agitação forte durante 3 a 5 segundos antes de utilizar. Antes de utilizar, os controlos devem ser removidos do armazenamento entre 2 e 8 C e equilibrados à temperatura ambiente. Configuração do equipamento COBAS AmpliPrep Parte A. Manutenção e purga A1. O equipamento COBAS AmpliPrep está pronto para operação em modo de espera (stand-by). A2. Ligue a estação de dados do software AMPLILINK (ON). Prepare a estação de dados da seguinte maneira: a. Inicie sessão no sistema operativo Windows XP. b. Faça duplo clique no ícone do software AMPLILINK. c. Inicie sessão no software AMPLILINK introduzindo a ID de utilizador e a palavra-passe. A3. Verifique a quantidade do PG WR no ecrã Status e substitua, caso seja necessário. A4. Execute todos os itens de manutenção indicados na lista do separador Due. O equipamento COBAS AmpliPrep efectua automaticamente a purga do sistema. Parte B. Carregamento de cassetes de reagente Nota: Todas as cassetes de reagente devem ser retiradas do armazenamento entre 2 e 8 C, carregadas imediatamente no equipamento COBAS AmpliPrep e deixadas equilibrar à temperatura ambiente no equipamento pelo menos 30 minutos antes da primeira amostra ser processada. Não deixe que as cassetes de reagente cheguem à temperatura ambiente fora do equipamento, uma vez que se pode formar condensação nas etiquetas de códigos de barras. Não limpe a condensação se esta se formar nas etiquetas de códigos de barras. B1. Coloque HIV-1 QL v2.0 CS1 numa rack de reagentes. Coloque HIV-1 QL v2.0 CS2, HIV-1 QL v2.0 CS3 e HIV-1QL v2.0 CS4 numa rack de reagentes separada. B2. Coloque a rack de reagentes que contém HIV-1 QL v2.0 CS1 na posição de rack A do equipamento COBAS AmpliPrep. B3. Coloque a rack de reagentes que contém HIV-1 QL v2.0 CS2, HIV-1 QL v2.0 CS3 e HIV-1 QL v2.0 CS4 na posição de rack B, C, D ou E do equipamento COBAS AmpliPrep. (Ver a Tabela 1 para mais informações.) Parte C. Carregamento de produtos descartáveis Nota: Determine o número necessário de cassetes de reagente COBAS AmpliPrep, unidades de processamento de amostras (SPUs), tubos de entrada de amostras (tubos-s), pontas-k e tubos-k. Para cada amostra ou controlo são necessários uma SPU, um tubo-s de entrada, uma ponta-k e um tubo-k. São possíveis várias configurações para a utilização do equipamento COBAS AmpliPrep com o analisador COBAS TaqMan ou o analisador COBAS TaqMan 48. Para referência, consulte a Tabela 1 mais adiante. Consoante a configuração utilizada, carregue o número adequado de racks de cassetes de reagentes, racks de amostras com tubos-s de entrada, racks de SPUs, racks de pontas-k, racks de tubos-k e suportes-k em racks de suportes-k nas posições de racks respectivas do equipamento COBAS AmpliPrep (para mais informações, consulte a Tabela 1). C1. Coloque as SPUs na(s) rack(s) de SPUs e carregue a(s) rack(s) na posição de rack J, K ou L do equipamento COBAS AmpliPrep. C2. Consoante a configuração utilizada, carregue rack(s) cheia(s) de tubos-k na posição de rack M, N, O ou P do equipamento COBAS AmpliPrep. C3. Carregue rack(s) cheia(s) de pontas-k na posição de rack M, N, O ou P do equipamento COBAS AmpliPrep. C4. Para a configuração 3 utilizando o analisador COBAS TaqMan 48, carregue suportes-k em rack(s) de suportes-k nas posições de racks M & N ou O & P do equipamento COBAS AmpliPrep. 07002475001-01PT 10 Doc Rev. 1.0

Tabela 1 Possíveis configurações para a utilização do equipamento COBAS AmpliPrep com o analisador COBAS TaqMan ou o analisador COBAS TaqMan 48 1 2 3 Configuração Equipamento COBAS AmpliPrep + Estação de ancoragem + Analisador COBAS TaqMan Equipamento COBAS AmpliPrep + Analisador COBAS TaqMan Equipamento COBAS AmpliPrep + Analisador(es) COBAS TaqMan 48 Modo de transferência para o analisador COBAS TaqMan ou o analisador COBAS TaqMan 48 Transferência automatizada de suportes-k Transferência manual de tubos-k em rack(s) de amostras para o analisador COBAS TaqMan Transferência manual de suporte-k em rack(s) de suportes-k para o analisador COBAS TaqMan 48 Racks, suportes e produtos descartáveis Tubos-K em racks de tubos-k cheias Pontas-K em racks de pontas-k cheias Tubos-S de entrada contendo amostras e controlos em racks de amostras SPUs em racks de SPUs CS1 em rack de cassetes CS2, CS3, CS4 em rack de cassetes Tubos-K em racks de tubos-k cheias Pontas-K em racks de pontas-k cheias Tubos-S de entrada contendo amostras e controlos em racks de amostras SPUs em racks de SPUs CS1 em rack de cassetes CS2, CS3, CS4 em rack de cassetes Após a conclusão do processamento de amostra: Tubos-K em racks de amostras (prontas para transferência manual) Tubos-K em racks de amostras Pontas-K em racks de pontas-k cheias Tubos-S de entrada contendo amostras e controlos em racks de amostras SPUs em racks de SPUs CS1 em rack de cassetes CS2, CS3, CS4 em rack de cassetes Suporte-K vazio com código de barras em rack de suportes-k Após a conclusão do processamento de amostra: Tubos-K em suporte-k numa rack de suportes-k Posição no equipamento COBAS AmpliPrep M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Idêntico ao de cima (F H) F - H M - P F - H J - L A B - E M - P Idêntico ao de cima (M P) Parte D. Pedido e carregamento de amostras D1. Prepare racks de amostras da seguinte maneira: Prenda um clipe de etiqueta de código de barras a cada posição de rack de amostras onde será colocada uma amostra (tubo-s). Prenda um dos clipes de etiquetas de códigos de barras específicos para os controlos [CTM ( ) C e HIV-1 (+)C, v2.0] a cada posição de rack de amostras onde serão colocados os controlos (tubo-s). Os clipes de etiquetas de códigos de barras dos controlos devem ter o mesmo número de lote de controlo que o número de lote dos frascos de controlo do kit. Tenha cuidado para atribuir o controlo correcto à posição com o clipe de código de barras de controlo adequado. D2. Utilizando o software AMPLILINK, crie pedidos de amostras para todas as amostras e controlos no separador Sample da janela Orders. Seleccione o ficheiro de teste apropriado (ficheiro de definição de teste EDTA ou DBS) e conclua guardando. (Para o nome e a versão do ficheiro de definição de teste (TDF) apropriado, consulte o cartão informativo do produto (PIC) fornecido com o kit). D3. Atribua pedidos de amostras e de controlos a posições de racks de amostras no separador Sample Rack da janela Orders. O número da rack de amostras deve ser o da rack preparada no Passo D1. 07002475001-01PT 11 Doc Rev. 1.0

D4. Imprima o relatório Sample Rack Order para o utilizar como uma folha de trabalho. D5. Prepare racks de amostras e de controlos na área designada para a adição de amostras e controlos, da seguinte maneira: Misture com agitação forte cada amostra e controlo [CTM ( ) C e HIV-1 (+)C, v2.0] durante 3 a 5 segundos. Evite contaminar as luvas quando manipular as amostras e controlos. Nota: Para amostras de plasma EDTA prossiga com o ponto D6. Nota: Para amostras de gotas secas de sangue (DBS) prossiga com o ponto D7. Nota: Não misture amostras de plasma EDTA com amostras de gotas secas de sangue (DBS) na mesma rack de amostras. D6. Coloque um tubo-s de entrada em cada posição que contém um clipe de etiqueta de código de barras. Transfira 1000 a 1050 μl de cada amostra para o tubo-s de entrada apropriado com etiqueta de código de barras, utilizando uma micropipeta com uma ponta com barreira para aerossóis ou de deslocamento positivo isenta de RNase. Evite transferir partículas e/ou coágulos de fibrina da amostra original para o tubo-s de entrada. As amostras são transferidos para posições de tubos, conforme determinado e registado na folha de trabalho no passo D4. Evite contaminar a parte superior dos tubos-s com amostras. Ignore o passo D7 e prossiga com o passo D8. D7. Coloque tubos-s em cada uma das posições 1 a 24 de uma IsoRack Thermomixer. Remova gotas secas de sangue (DBS) do cartão de filtro Whatman 903 ou cartão de colheita de amostras Munktell TFN Brand 5 ou equivalente (de acordo com as instruções do utilizador do cartão de filtro) e transfira para um tubo-s de entrada. Para todos os tipos de cartões de DBS usados, é fundamental certificar-se de que a gota seca de sangue fica anexada à parede do tubo-s de entrada (para evitar coágulos de amostra) e completamente coberta pelo reagente SPEX. É pipetado 1000 μl de reagente SPEX num tubo-s de entrada contendo a gota seca de sangue. Para a eluição do sangue total seco, o tubo-s de entrada é colocado num Eppendorf Thermomixer Comfort (número de produto 5355 000.011) durante 10 minutos, a 56 C e 1000 rpm. Transfira os tubos-s de entrada para a rack de amostras, nas posições de tubo conforme atribuído na folha de trabalho do passo D4. D8. Transfira 1000 a 1050 μl de cada controlo [CTM ( ) C e HIV-1 (+)C, v2.0] para o tubo-s de entrada apropriado com etiqueta de código de barras, utilizando uma micropipeta com uma ponta com barreira para aerossóis ou de deslocamento positivo isenta de RNase. Os controlos devem ser transferidos para posições de tubos conforme determinado e registado na folha de trabalho no passo D4. Os clipes de etiquetas de códigos de barras dos controlos devem ter o mesmo número de lote de controlo que o número de lote dos frascos de controlo do kit. Atribua o controlo correcto à posição com o clipe de código de barras de controlo apropriado. Evite contaminar a parte superior dos tubos-s com controlos. D9. Para as configurações 1 e 2, carregue a(s) rack(s) de amostras cheia(s) com tubos-s de entrada nas posições de rack F, G ou H do equipamento COBAS AmpliPrep. D10. Para a configuração 3 utilizando o analisador COBAS TaqMan 48, carregue a(s) rack(s) de amostras com tubos-s de entrada e tubos-k (um para cada tubo-s de entrada, carregado na posição da direita adjacente aos tubos-s de entrada) na posição de rack F, G ou H do equipamento COBAS AmpliPrep. Parte E. Início da execução no equipamento COBAS AmpliPrep E1. Inicie o equipamento COBAS AmpliPrep utilizando o software AMPLILINK. Parte F. Final da execução no equipamento COBAS AmpliPrep e transferência para o analisador COBAS TaqMan ou analisador COBAS TaqMan 48 (apenas para as configurações 2 e 3) F1. Verifique se existem alarmes ou mensagens de erro. F2. Retire as amostras e os controlos processados do equipamento COBAS AmpliPrep em racks de amostras (para o analisador COBAS TaqMan sem estação de acoplagem) ou em racks de suportes-k (para o analisador COBAS TaqMan 48), consoante a configuração (para mais pormenores, ver a Parte G). F3. Remova os desperdícios do equipamento COBAS AmpliPrep. Nota: Depois de concluída a preparação de amostras e controlos, as amostras e controlos processados não devem ser expostos à luz. 07002475001-01PT 12 Doc Rev. 1.0

Amplificação e detecção Configuração do analisador COBAS TaqMan ou analisador COBAS TaqMan 48 A execução no analisador COBAS TaqMan ou no analisador COBAS TaqMan 48 tem que ser iniciada no prazo de 120 minutos após a conclusão da preparação de amostras e controlos. Nota: Não congele nem armazene amostras e controlos processados entre 2 e 8 C. Parte G. Carregamento de amostras processadas G1. Consoante a configuração, execute os passos apropriados para transferir os tubos-k para o analisador COBAS TaqMan ou o analisador COBAS TaqMan 48: Configuração 1: Transferência automatizada de suporte-k através da estação de ancoragem para o analisador COBAS TaqMan. Não é necessária intervenção manual. Configuração 2: Transferência manual de tubos-k em rack(s) de amostras para o analisador COBAS TaqMan. Configuração 3: Transferência manual de suporte-k em rack(s) de suportes-k para o analisador COBAS TaqMan 48. Transferência manual de suportes-k para o analisador COBAS TaqMan 48 utilizando o transportador de suportes-k. Parte H. Início da execução no analisador COBAS TaqMan ou no analisador COBAS TaqMan 48 H1. Inicie o analisador COBAS TaqMan ou o analisador COBAS TaqMan 48 utilizando uma das opções indicadas a seguir, consoante a configuração utilizada: Configuração 1: Não é necessária qualquer intervenção. Configuração 2: Arranque automático do analisador COBAS TaqMan, depois de inserida(s) a(s) rack(s) de amostras. Configuração 3: Se o suporte-k tiver menos do que 6 tubos-k, encha o suporte-k com tubos-k vazios. O enchimento é controlado pelo software AMPLILINK. Abra a tampa do termociclador, carregue o suporte-k no termociclador e feche a tampa. Inicie a execução no analisador COBAS TaqMan 48. Parte I. Final da execução no analisador COBAS TaqMan ou no analisador COBAS TaqMan 48 I1. Depois de concluída a execução no analisador COBAS TaqMan ou no analisador COBAS TaqMan 48, imprima o Relatório dos Resultados. Verifique se existem alarmes ou mensagens de erro no Relatório dos Resultados. As amostras com alarmes e comentários são interpretadas conforme descrito na secção Resultados. Depois de aceitar os resultados, armazene-os no arquivo. I2. Retire os tubos-k usados do analisador COBAS TaqMan ou do analisador COBAS TaqMan 48. RESULTADOS O analisador COBAS TaqMan ou o analisador COBAS TaqMan 48 determina automaticamente a presença de ARN do HIV-1 das amostras e controlos. Software AMPLILINK: Determina o valor de limite do ciclo (Ct) para o ARN do HIV-1 e para o ARN do IC do HIV-1. Determina a presença de ARN do HIV-1 e de ARN do CI do HIV-1 com base nos valores de Ct do ARN do HIV-1 e do ARN do CI do HIV-1. 07002475001-01PT 13 Doc Rev. 1.0

Validação do lote Verifique na janela de resultados do software AMPLILINK ou na impressão se existem alarmes e comentários, para se assegurar de que o lote é válido. Para pedidos de controlo, é efectuada uma verificação para determinar se o valor de Ct do controlo está dentro do respectivo intervalo específico. Se o valor de Ct do controlo ficar fora do respectivo intervalo, é gerado um alarme para indicar que o controlo falhou. O lote é válido se não aparecer nenhum alarme para quaisquer dos controlos [HIV-1 (+)C, v2.0 e CTM ( ) C]. O lote não é válido se aparecer qualquer um dos seguintes alarmes para os controlos do HIV-1: Controlo Negativo Alarme Resultado Interpretação NC_INVALID Invalid Um resultado inválido ou o resultado do controlo negativo não é negativo. Controlo Positivo do HIV-1, v2.0 Alarme Resultado Interpretação PC_INVALID Invalid Um resultado inválido ou o resultado do controlo positivo não é positivo. Caso o lote seja inválido, repita o lote todo, incluindo a preparação de amostras e controlos, amplificação e detecção. Interpretação dos Resultados Para um lote válido, verifique cada amostra individual relativamente a alarmes ou comentários na impressão dos resultados. Um lote valido pode incluir resultados de amostras válidos e inválidos, dependendo de serem obtidos alarmes e/ou comentários para as amostras individuais. Os resultados de amostras são interpretados conforme se segue: Tipo de Amostra Resultado de detecção Interpretação Plasma EDTA Gota seca de sangue (DBS) Not Detected Detected Not Detected DBS Detected DBS O valor Ct para o HIV-1 está acima do limite para o ensaio ou não foi obtido nenhum valor Ct para o HIV-1. Reporte os resultados como Não detectado ARN do HIV-1. Reporte os resultados como Detectado ARN do HIV-1. O valor Ct para o HIV-1 está acima do limite para o ensaio ou não foi obtido nenhum valor Ct para o HIV-1. Reporte os resultados como Não detectado ARN do HIV-1. Reporte os resultados como Detectado ARN do HIV-1. Se o elemento apresentado do resultado da amostra for Failed, Invalid ou Aborted, consulte o Manual de Aplicação do software AMPLILINK versão série 3.3, conforme indicado na secção Materiais necessários mas não fornecidos. 07002475001-01PT 14 Doc Rev. 1.0

LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO 1. Este teste foi validado para utilização com amostras de plasma humano colhidas em anticoagulante EDTA e amostras de gotas secas de sangue total colhidas em anticoagulante EDTA. A utilização de outro tipo de amostras pode dar origem a resultados imprecisos. 2. O desempenho do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 não foi avaliado com amostras contendo o grupo N do HIV-1, nem com amostras contendo o HIV-2. 3. A obtenção de resultados fiáveis está dependente da execução de procedimentos adequados de colheita, transporte, armazenamento e processamento das amostras. 4. A presença de enzima AmpErase na Mistura Principal do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 reduz o risco de contaminação do amplicon. No entanto, a contaminação de controlos positivos e de amostras clínicas do HIV-1 só pode ser evitada através do cumprimento de boas práticas laboratoriais e de um cuidadoso cumprimento dos procedimentos especificados neste folheto informativo. 5. A utilização deste produto deve ser restringida a pessoal com formação nas técnicas de PCR. 6. Este produto só pode ser utilizado com o equipamento COBAS AmpliPrep e o analisador COBAS TaqMan ou o analisador COBAS TaqMan 48. 7. Embora raras, as mutações dentro de regiões altamente conservadas do genoma viral cobertas pelos iniciadores e/ou sondas do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 podem resultar na não detecção do vírus. 8. A detecção de ARN de HIV-1 depende do número de partículas virais presentes na amostra e pode ser afectada pelos métodos de colheita da amostra e por factores inerentes ao próprio paciente (por ex., a idade, a presença de sintomas, o estádio da infecção, o ponto de ajuste da carga viral e medicamentos anti-retrovirais). 9. Devido a diferenças básicas entre tecnologias, recomenda-se que, antes de mudarem de uma tecnologia para outra, os utilizadores realizem estudos de correlação de métodos nos seus laboratórios, para quantificar as diferenças tecnológicas. SUBSTÂNCIAS INTERFERENTES Níveis elevados de triglicéridos (até 30 g/l), bilirrubina conjugada e não conjugada (até 0,2 g/l), albumina sérica humana (até 60 g/l), hemoglobina (até 2 g/l) e ADN humano (até 2 mg/l) em amostras de gotas secas de sangue (DBS) e amostras de plasma mostraram não interferir com a quantificação do ARN do HIV-1, nem ter impacto sobre a especificidade do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0. Auto-anticorpos de doentes com um Anticorpo Antinuclear activo mostraram não interferir com o teste em amostras de gotas secas de sangue (DBS) e amostras de plasma. Amostras de plasma com Lúpus Eritematoso Sistémico (LES) e Artrite Reumatóide (AR) mostraram não interferir com a detecção de ARN do HIV-1 que pode originar resultados falsos negativos em casos raros. Os marcadores das doenças auto-imunes mencionadas acima foram também testados em gotas secas de sangue (DBS) e não apresentaram interferência. A avaliação foi efectuada de acordo com a Directiva EP7-A2 do CLSI, utilizando mais de um lote de reagentes do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0. Foi observado que o foscarnet sódico (fármaco do CMV, inibidor da polimerase viral) a concentrações superiores a 2x o nível máximo de plasma (Cmax) indicado pelo fabricante, interfere com o Controlo Interno (IC) do ensaio, originando a invalidação de alguns testes. Não foram observados determinações de resultados com falsos positivos ou falsos negativos. As combinações de fármacos seguintes, testadas a 3 vezes o Nível Máximo de Plasma (Cmax), mostraram não interferir com a detecção do ARN do HIV-1, nem ter impacto sobre a especificidade do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0: 07002475001-01PT 15 Doc Rev. 1.0

Fármacos para HIV: Inibidores da Protease Atazanavir Saquinavir Ritonavir Lopinavir/Ritonavir Mesilato de nelfinavir Darunavir Tipranavir Fosamprenavir Inibidor da Integrase Raltegravir Elvitegravir Inibidor de Entrada Maraviroc Inibidores Análogos de Nucleósidos/Nucleótidos da Transcriptase Reversa Zidovudine, AZT Sulfato de abacavir, ABC Lamivudina, 3TC Tenofovir DF, TDF Emtricitabina, FTC Stavudina, d4t Inibidores Não Nucleósidos da Transcriptase Reversa Efavirenz Rilpivirina Etravirina Nevirapina Agente de reforço farmacocinético Cobicistat Fármacos para HBV e/ou HCV: Análogo de Nucleótido Adefovir dipivoxil Imuno-Moduladores Peginterferão alfa-2 Peginterferão alfa-2b Ribavirina Análogo de Nucleósido Entecavir Telbivudina Inibidor da Protease Boceprevir Telaprevir Compostos para o tratamento de Vírus Herpes: Análogos de Nucleósido Acyclovir Ganciclovir Valganciclovir HCl Cidofovir Compostos para o tratamento ou a prevenção de infecções oportunistas em doença por HIV: Anti infeccioso Sulfamethoxazole Trimethoprim Anti fúngico Fluconazol Anti micobacteriano Azitromicina Isoniazida Rifampicina Rifabutina Etambutol Claritromicina Pirazinamida 07002475001-01PT 16 Doc Rev. 1.0

AVALIAÇÃO DO DESEMPENHO NÃO CLÍNICO A. Limite de detecção O limite de detecção do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 foi determinado testando o 2 o Padrão Internacional da OMS para o ARN do HIV-1, NIBSC Código 97/650 41, subtipo B do HIV-1, diluído em plasma EDTA humano ou gotas secas de sangue total, negativo para o HIV-1. Uma cópia de ARN do HIV-1 é equivalente a 1,7 ± 0,1 Unidades Internacionais (IU). O limite de detecção foi determinado para três lotes de reagentes. Foram analisadas três séries de diluição para cada lote de reagente. Foi testado um total de aproximadamente 126 exemplares por nível de concentração para o plasma EDTA e um total de aproximadamente 189 exemplares por nível de concentração para gotas secas de sangue. A avaliação foi efectuada de acordo com a Directiva EP17-A2 do CLSI. A Tabela 2 e Tabela 3 apresentam os resultados combinados dos três lotes testados para plasma EDTA e gotas secas de sangue e demonstram que o Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 detectou ARN do HIV-1 a concentrações respectivamente de 20 cp/ml em plasma EDTA e de 300 cp/ml em amostras de gotas secas de sangue, ou superior com uma taxa de positividade 95%, conforme determinado por análise PROBIT. Tabela 2 Limite de Detecção em plasma EDTA do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 utilizando o Padrão Internacional da OMS e a análise PROBIT Entrada nominal (ARN do HIV-1 em cópias/ml) N.º de réplicas N.º de positivos Taxa de positividade 60 126 126 100 40 186 185 99 30 126 125 99 20 126 124 98 15 59 53 90 10 126 108 86 5 125 66 53 0 126 0 0 Taxa de positividade de 95% PROBIT 16,5 cp/ml Intervalo de confiança de 95%: 14,3 a 19,8 cp/ml Tabela 3 Limite de Detecção em gotas secas de sangue do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 utilizando o Padrão Internacional da OMS e a análise PROBIT Entrada nominal (ARN do HIV-1 em cópias/ml) N.º de réplicas N.º de positivos Taxa de positividade 500 189 189 100 400 187 185 99 300 188 183 97 150 188 166 88 75 188 108 57 0 188 0 0 Taxa de positividade de 95% PROBIT 221,8 cp/ml Intervalo de confiança de 95%: 195,6 a 260,5 cp/ml 07002475001-01PT 17 Doc Rev. 1.0

B. Precisão A precisão do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 foi determinada por análise de diluições em série de uma amostra de sobrenadante em cultura celular de HIV-1 (subtipo B do HIV-1) em amostras negativas para o HIV-1 de plasma EDTA humano e de gotas secas de sangue. A atribuição do título do sobrenadante de cultura celular (concentração de stock) foi efectuada utilizando um método que garante rastreabilidade ao 1 o Padrão Internacional da Organização Mundial de Saúde para o ARN do HIV-1, NIBSC Código 97/656 36. Uma cópia de ARN do HIV-1 é equivalente a 1,7 ± 0,1 Unidades Internacionais (UI). Para o plasma EDTA foram analisados três lotes de reagentes, que foram divididos entre 11 execuções. Cada execução era constituída por 7 níveis de diluição com 14 exemplares em cada nível. Para as gotas secas de sangue foram analisados três lotes de reagentes, que foram divididos entre 15 execuções. Cada execução era constituída por 6 níveis de diluição com 21 exemplares em cada nível. Cada amostra foi submetida ao procedimento completo do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, incluindo preparação da amostra, amplificação e detecção. O estudo foi realizado utilizando 3 lotes de reagentes do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0. Todos os dados de precisão válidos foram avaliados calculando a taxa de positividade em % para cada membro do painel por lote de reagente, para o plasma e para as gotas secas de sangue. O Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 demonstrou um desempenho consistente a níveis de concentração de 60, 40, 30, 20, 10, 5 e 0 cp/ml para o plasma EDTA e a níveis de concentração de 500, 400, 300, 150, 75 e 0 cp/ml para gotas secas de sangue, em todos os três lotes de reagente testados (Tabela 4 e Tabela 5). Tabela 4 Precisão do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 (plasma EDTA) Concentração nominal Taxa de positividade (%) (cp/ml) Lote 1 Lote 2 Lote 3 60 100 100 100 40 100 99 100 30 98 100 100 20 95 100 100 10 88 88 81 5 52 49 57 0 0 0 0 Tabela 5 Precisão do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 (gotas secas de sangue) Concentração nominal Taxa de positividade (%) (cp/ml) Lote 1 Lote 2 Lote 3 500 100 100 100 400 100 98 98 300 100 95 97 150 95 84 86 75 60 56 57 0 0 0 0 C. Inclusividade do Grupo M, N e O do HIV-1 Foram propostas oito categorias de subtipos para o grupo M do HIV-1 com base na divergência de nucleótidos. Estes subtipos são designados com letras alfabéticas maiúsculas, de A a H 40. Foi avaliado o desempenho do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 em cada um dos subtipos A a H do grupo M do HIV-1, CRF01_AE, grupo O e grupo N, verificando o Limite de Detecção. Foi efectuada a avaliação dos 8 isolados dos subtipos do grupo M do HIV-1, o CRF01_AE, um isolado do grupo N e um isolado do grupo O a até 4 diferentes níveis de concentração em plasma EDTA ou gotas secas de sangue e foi efectuada uma determinação da taxa de positividade para cada nível, com até 49 exemplares. O estudo foi conduzido com até 2 lotes de reagentes do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0. Os resultados para o plasma EDTA e as gotas secas de sangue são apresentados na Tabela 6 e na Tabela 7, e foi verificado que o Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 detectou ARN do HIV-1 para 10 diferentes genótipos/subtipos a concentrações de 7.5E+01 cp/ml (ou inferiores) para o plasma e de 1.0E+3 cp/ml (ou inferiores) para as gotas secas de sangue, com uma taxa de positividade > 95%. 07002475001-01PT 18 Doc Rev. 1.0

Tabela 6 Verificação de genótipos do Limite de Detecção do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 (plasma EDTA) Subtipo Designação do isolado Nível mais baixo de concentração > Taxa de positividade de 95% (cp/ml) subtipo A do grupo M 92UG029 1,0E+01 subtipo A do grupo M 4237A/98 2,9E+01 subtipo B do grupo M 92TH026 3,2E+01 subtipo B do grupo M 8E5/LAV 7.5E+01 subtipo C do grupo M 92BR025 3,0E+01 subtipo C do grupo M 3777A/97 1,1E+01 subtipo D do grupo M 92UG021 3,0E+01 subtipo D do grupo M 92UG035 1,1E+01 subtipo E do grupo M 92TH022 1,2E+01 subtipo E do grupo M 92TH009 1,4E+01 subtipo F do grupo M 93BR020 3,2E+01 subtipo G do grupo M ARP173/RU570 1,3E+01 subtipo H do grupo M HIV V1557 1,6E+01 subtipo CRF01_AE do grupo M 1019-HIV-0027 6,0E+01 grupo O MVP5180 5,0E+01 grupo N YBF30 6,0E+01 Tabela 7 Verificação de genótipos do Limite de Detecção do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 (gotas secas de sangue) Subtipo Designação do isolado Nível mais baixo de concentração > Taxa de positividade de 95% (cp/ml) subtipo A do grupo M 92UG029 2,0E+02 subtipo C do grupo M 92BR025 3,0E+02 subtipo D do grupo M 92UG021 2,0E+02 subtipo E do grupo M 92TH022 2,0E+02 subtipo F do grupo M 93BR020 3,0E+02 subtipo G do grupo M ARP173/RU570 2,0E+02 subtipo H do grupo M HIV V1557 4,0E+02 subtipo CRF01_AE do grupo M 1019-HIV-0027 1,0E+03 grupo O MVP5180 4,0E+02 grupo N YBF30 1,0E+03 D. Sensibilidade do diagnóstico A sensibilidade do diagnóstico do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 foi determinada analisando amostras individuais de plasma EDTA (168 resultados totais) e amostras de gotas secas de sangue de adultos (172 resultados totais), positivas do HIV-1, com 3 lotes de reagentes do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0. Todas as amostras de plasma EDTA e de gotas secas de sangue (DBS) de adultos tiverem resultados positivos nos testes de HIV-1. Neste painel, a sensibilidade do diagnóstico do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 é de 100% (limite inferior de confiança de 95% unilateral: > 98,2%) em plasma EDTA e em gotas secas de sangue (DBS) de adultos (limite inferior de confiança de 95% unilateral: > 98,3%) Além disso, a sensibilidade do diagnóstico do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 foi avaliada durante a seroconversão. Os membros de 10 painéis de seroconversão do HIV-1 disponíveis no mercado, cada um destes colhido de um dador de plasma individual durante um período de seroconversão de anticorpos do HIV-1, foram testados com um lote de 07002475001-01PT 19 Doc Rev. 1.0

reagentes do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0. O Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, quando comparado com o ensaio qualitativo Abbott RealTime HIV-1 de referência serológica, detectou o HIV-1 mais cedo em 5 dos 10 painéis de seroconversão. E. Especificidade A especificidade do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 foi determinada com dois lotes de reagentes por análise de amostras negativas do HIV-1 de plasma EDTA e de gotas secas de sangue (DBS) de dadores de sangue. Um total de 1298 amostras individuais de plasma EDTA e 998 amostras de DBS tiverem resultados válidos. Para o ARN do HIV-1, com a excepção de 2 amostras de plasma EDTA e 1 amostra de DBS, todos os resultados foram negativos no Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0. Com base nestes resultados, a especificidade do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0 é de 99,8% (limite inferior de confiança de 95% unilateral: > 99,5%) em plasma EDTA e de 99,9% ((limite inferior de confiança de 95% unilateral: > 99,5%) em amostras de gotas secas de sangue (DBS). F. Especificidade analítica Foi avaliada a especificidade analítica do Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0, adicionando organismos em cultura (vírus, bactérias, leveduras) numa concentração de 1,0E+06 partículas/ml e o vírus da hepatite C numa concentração de entrada de 1,0E+07 partículas/ml ao plasma EDTA humano negativo para o HIV-1 e ao plasma EDTA positivo para o HIV-1 a uma concentração de 6.0E+01 cp/ml do HIV-1 e ao plasma EDTA positivo para o HIV-1 a 1,0E+03 para gotas secas de sangue (ver a Tabela 8). Nenhum dos organismos testados apresentou reactividade cruzada com o Teste Qualitativo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, v2.0. Tabela 8 Amostras de Especificidade analítica Vírus Adenovírus tipo 5 Citomegalovírus Vírus de Epstein-Barr Vírus do Herpes humano, tipo 6 Vírus do Herpes simples, tipo 1 Vírus do Herpes simples, tipo 2 Vírus linfotrópico da célula T humana, tipo 1 Vírus linfotrópico da célula T humana, tipo 2 Influenza A Vírus da Hepatite A Vírus da Hepatite B Vírus da Hepatite C Vírus da Hepatite G Vírus da Hepatite E Vírus do Papiloma humano Vírus da Varicela Zoster Vírus do Nilo Ocidental Vírus da Encefalite de St. Louis Vírus da Encefalite de Murray Valley Vírus da Dengue, tipos 1, 2, 3 e 4 Vírus da Febre Amarela Vírus Zika Vírus da Encefalite da carraça estirpe HYPR Parvovírus B19 Vírus Chikungunya Bactérias Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Streptococcus sanguinis Propionibacterium acnes Escherichia coli Leveduras Candida albicans 07002475001-01PT 20 Doc Rev. 1.0