Como estudar uma proteína?

1 Métodos de estudo das proteínas 1 Como estudar uma proteína? 1. Separá-la e purificá-la. 2. Determinar a sua massa molecular. 3. Determinar a sua composição e sequência de aminoácidos. 4. Elucidar a sua estrutura tridimensional. 5. Caracterizá-la funcionalmente. 2 1

1. SEPARAÇÃO DAS PROTEÍNAS 3 - antes de mais, é necessário destruir a estrutura do tecido que contém a proteína ou proteínas a estudar Métodos de disrupção homogenizador tipo Potter misturador 4 comercial 2

RUPTURA DO TECIDO/CÉLULAS CRIA ALGUNS PROBLEMAS: libertação de ácidos e outras substâncias acumuladas nalguns organelos oxidações (>O2, oxidases) libertação de proteases (ex.dos lisossomas) desnaturação proteica Solução tampão mantém ph Incluir substâncias antioxidantes (ex.c/sh:dtt ou cisteína) realizar todo o processo a baixa temperatura ( 4ºC) 5 6 3

PARA SEPARAR AS PROTEÍNAS - Exploram-se diferenças em propriedades fisicoquímicas das proteínas, resultantes das diferentes sequências primárias de aminoácidos: 1. Tamanho 2. Solubilidade 3. Carga 4. Afinidade de ligação 7 Técnicas de separação e purificação de proteínas: 1. Diálise, ultrafiltração, centrifugação, precipitação 2. Cromatografia de exclusão molecular 3.Cromatografia de troca iónica e de fase reversa 4. Cromatografia de afinidade 5. Electroforese 8 4

Princípio: dimensão/forma molecular Diálise 9 Ultrafiltração 10 5

Ultracentrifugação 11 - gradientes de densidade aumento da densidade do meio inicial força centrífuga final partículas menos densas partículas de densidade intermédia partículas mais densas 12 6

Princípio pio: solubilidade (precipitação) A solubilidade das proteínas varia com: - ph - temperatura - força a iónicai - constante dieléctrica do solvente Técnicas baseadas em diferenças de solubilidade: 1. Precipitação isoeléctrica (variação de ph) 2. Salting in / salting out (variação da força iónica) 3. Precipitação por solventes orgânicos 13 1. Precipitação isoeléctrica ctrica: Solubilidade pi ph em geral, a solubilidade é menor no pi porque há menos interacções electrostáticas ticas com o solvente 14 7

2. Precipitação por soluções salinas: Solubilidade Salting in Salting out depende de: - hidrofobicidade da proteína - força iónica do sal - temperatura - ph (se ph=pi solubilidade) [sal] Salificação (salting in): a solubilidade aumenta até certo ponto, com o aumento da [sal] Dessalificação (salting out): os sais, a concentração muito elevada, retiram a H 2 O de hidratação da proteína as 15 moléculas de proteína precipitam -Exemplo: utilização do (NH 4 ) 2 SO 4 - Utiliza-se frequentemente o sulfato de amónio, (NH 4 ) 2 SO 4 devido à sua grande solubilidade em água - a precipitação com (NH 4 ) 2 SO 4 não desnatura as proteínas - diferentes proteínas têm diferente solubilidade precipitam a diferentes concentrações de (NH 4 ) 2 SO 4 ex: proteínas da clara de ovo Proteína ovomucina ovoglobulina ovalbumina Precipita à [(NH 4 ) SO 2 4 ] de: 50% da saturação 50% da saturação 100% saturada 16 8

3. Precipitação por solventes orgânicos: Ex. Etanol, acetona Precipitação proteica por solubilidade Solvente orgânico: solvata Sendo, solvatação e constante dieléctrica (D) D = F atracção entre 2 cargas no vazio F atracção entre as cargas no meio q1 q2 F = D r 2 Lei de Coulomb Então, Se D e F : Agregação proteica Precipitação Solubilidade 17 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS DE SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS Diferentes tipos: - exclusão molecular - troca iónica - afinidade - fase reversa 18 9

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR volume/forma 19 20 10

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÓNICA I carga Trocadores aniónicos (+) e catiónicos (-) 21 22 11

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE selectividade de ligação 23 - um esquema de purificação possível: Material de partida (células) Disrupção celular Centrifugação Precipitação fraccionada (Sais, polihydroxiálcoois) Diálise (para eliminar os sais) Cromatografia de troca iónica Cromatografia de exclusão molecular Cromatografia de afinidade Proteína purificada 24 12

25 2. DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR 26 13

- métodos diversos, tais como: Electroforese: 27 Espectrometria de massa MALDI-TOF: 28 14

Ultracentrifugação em gradientes de densidade: 29 3. DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO E SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS 30 15

DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DE AMINOÁCIDOS DE UMA PROTEÍNA Ex: determinação da composição de aminoácidos do fragmento ala-gly-asp-phe-arg-gly 1º Hidrólise ácida (HCl 6N, 110ºC, 24 horas) 2º Reacção de revelação dos aminoácidos (ex., ninidrina, cloreto de dansilo) 3º Separação e quantificação dos aminoácidos (ex. cromatográfica) 31 Reagentes utilizados para revelação e quantificação dos aminoácidos: Ninhidrina, 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno, fenilisotiocianato, cloreto de dansilo 32 16

Separação e quantificação dos aminoácidos por cromatografia (HPLC - High pressure liquid chromatography) - Matriz de separação (tirando partido das diferentes propriedades físicas de cada um dos aminoácidos) - Eluente (variação controlada das condições do meio) - Partição de cada aminoácido entre o meio e a matriz (de acordo com as suas propriedades fisico-químicas, ex carga, forma, hidrofobicidade) - Detecção após a sua derivatização) Fase reversa, eluição com eluente de baixa força iónica em gradiente 33 - resultado duma cromatografia de aminoácidos: Integrando os picos, determina-se a quantidade relativa 34 de cada aminoácido (mas não a sequência!!!) 17

USO DA CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS EM DIAGNÓSTICO CLÍNICO - Recém-nascido parto e peso (3 Kg) normais, alimentação com leite materno - Ao 5º dia de vida inicia recusa alimentar, vómitos, hipotonia, prostração - Agravamento progressivo e internalização ao 7º dia quadro clínico anterior + hipoglicémia, gasometria normal e cetonúria (corpos cetónicos) - Suspeita de sepsis (infecção generalizada). Tratamento com antibióticos, soro glicosilado c/ iões e pausa alimentar - Evolução, 9º dia melhoria. Leite administrado por sonda nasogástrica - 10-11º dia agravamento (prostação, coma com apneia) - Suspeita de doença metabólica, baseada em: - período de intoxicação - cetonúria (cetoácidos derivados de aminoácidos?) - maple syrup urine disease (MSUD, urina com cheiro a caramelo) Cromatografia de aminoácidos 35 USO DA CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS NO DIAGNÓSTICO CLÍNICO NORMAL LEUCINOSE 36 18

USO DA CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS NO DIAGNÓSTICO CLÍNICO Cromatografia de aminoácidos aumento de leucina, isoleucina e valina Cromatografia de ácidos orgânicos cetoácidos ramificados derivados de leucina, isoleucina e valina LEUCINOSE (defeito da desidrogenase dos α-cetoácidos ramificados ou α-cetovalerato desidrogenase) Tratamento: Soro com glucose, dieta com restrição proteica (< 1 g/kg/dia) com mistura de aminoácidos não-ramificados e diálise peritoneal ou hemodiálise (com o objectivo de aumentar o anabolismo, reduzir o catabolismo e remover tóxicos) 37 DETERMINAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE UMA PROTEÍNA + 3 HN-Ala-Thr-Gly-Ile-Asp-COO - 1- marca-se o resíduo N-terminal do péptido com feniltioisocianato( ): -Ala-Thr-Gly-Ile-Asp-COO - 2- hidrolisa-se o aminoácido N-terminal marcado, em condições suaves fica -Ala e + 3HN-Thr-Gly-Ile-Asp-COO - 3- identifica-se cromatograficamente o resíduo N-terminal e hidrolisado, -Ala 4- Repete-se o ciclo 1-3 até à total determinação da sequência. 38 19

39 DEGRADAÇÃO DE EDMAN Derivatização com fenilisotiocianato SEQUENCIAÇÃO DE PÉPTIDOS P PTIDOS PEQUENOS. Marcação do AA N-N terminal. Hidrólise do AA marcado marcado. Identificação do AA marcado marcado. Início de um novo ciclo de marcação, hidrólise e identificação do AA N-terminal seguinte 40 20

DEGRADAÇÃO DE EDMAN 41 SEQUENCIAÇÃO DE PÉPTIDOS P PTIDOS LONGOS CLIVAGEM ENZIMÁTICA Tripsina Quimotripsina 42 21

ESTRATÉGIA TRADICIONAL DE SEQUENCIAÇÃO DE PÉPTIDOS LONGOS 43 44 22

4. ELUCIDAÇÃO DA ESTRUTURA 3D 45 DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DE PROTEÍNAS DIFRACÇÃO DE RAIOS X Necessidade de cristalização de alguns grupos invisiveis 46 23

DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DE PROTEÍNAS RESONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR Espectros essencialmente para pequenas proteínas 47 24