II Congresso de Pesquisa e Extensão da FSG http://ojs.fsg.br/index.php/pesquisaextensao ISSN 2318-8014 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS DE PRESUNTOS COZIDOS CONSERVADOS EM SALMOURA Caroline Pezzi,¹ Gabriela Oliveira¹, gabim.n_oliveira@hotmail.com Marina Madalosso¹ Thaís Pagnussat¹ Ana Rita Fonseca Nunes 2 ana.nunes@fsg.br ¹ Acadêmicas do Curso de Biomedicina da Faculdade da Serra Gaúcha. 2 Professora do Curso de Biomedicina da Faculdade da Serra Gaúcha Professor Supervisor da APS Ana Rita Fonseca Nunes Graduada em Licenciatura e Bacharelado Em Ciências Biológicas pela Universidade de Caxias do Sul, Mestre em Biotecnologia e doutoranda em Biotecnologia na Universidade de Caxias do Sul. Palavras-chave: Presunto cozido, análises microbiológicas, micro-organismos patogênicos. Resumo O presente trabalho teve como objetivo analisar três amostras de presuntos conservados em embalagens plásticas seladas e comercializados em Caxias do Sul, para verificar a presença de micro-organismos que podem colocar em risco a saúde do consumidor. As amostras foram semeadas em quatro meios de cultura e conservadas em estufa microbiológica por 48 horas à 35ºC. Após este período, as placas foram analisadas conforme crescimento microbiano, seguido de coloração de gram. Das três amostras avaliadas apenas uma mostrou contaminação, apresentando presença de bactérias patogênicas pertencentes aos gêneros Salmonella, Enterobacter, Shigella e Staphiloccocus. Todos esses microorganismos apresentam risco à saúde do consumidor, assim podemos concluir que há um indício de inadequação durante processamento, transporte ou distribuição dos presuntos. 1 INTRODUÇÃO Atualmente verifica-se crescente demanda dos consumidores por alimentos com boa qualidade, que sejam frescos, naturais e práticos para serem consumidos. O presunto caracteriza-se por ser um produto bastante consumido e apreciado pela população mundial, por ter um sabor e um aroma característico. Além disso, é um alimento rico em nutrientes, água, proteínas e outros fatores que favorecem o aparecimento de micro-organismos. Diante disso, torna-se evidente a necessidade de um permanente controle durante o transporte, armazenamento, manipulação e controle da data de validade, para assim monitorar a contaminação e manter a qualidade do produto de acordo com a exigência do consumidor. O processo de fabricação do presunto constitui-se em nove etapas que são: preparo da carne, injeção de salmoura, tambleamento, enformação, cozimento, resfriamento,
414 desinformação, embalagem e estocagem. Deste modo a qualidade do produto dependerá de todas as fases deste processo, sendo bem executadas e cautelosas em relação à contaminação. O presente trabalho teve como objetivo analisar três amostras de presuntos conservados em embalagens plásticas lacradas e comercializados em Caxias do Sul, para verificar a presença de micro-organismos pode colocar em risco a saúde do consumidor. 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1. Importância dos micro-organismos Sabe-se que micro-organismos podem desempenhar papéis muito importantes nos alimentos, sejam como deterioradores microbianos ou como parte importante em sua produção. As interações entre micro-organismos e alimentos podem ocasionar alterações químicas prejudiciais, alterando sua cor, sabor, textura e aspecto. Essas alterações ocorrem devido ao metabolismo destes seres, que estão apenas perpetuando sua espécie e utilizando o alimento como fonte de energia. Micro-organismos que causam riscos a saúde, também conhecidos como patogênicos acarretam em doenças nos seres humanos e animais. O modo como uma enfermidade se manifesta depende do organismo a ser infectado, do agente patológico, do alimento contaminado e outros quesitos como o número de células a que o hospedeiro é exposto. Essas formas de vida microscópicas chegam ao hospedeiro de diversas maneiras, quase sempre relacionadas à higiene na produção, estocagem e manipulação do produto. A interação alimento-micróbio é benéfica, quando causa alterações químicas que induzem a matéria prima tornar-se um alimento, como, por exemplo, as leveduras que estão presente em fermentos biológicos, vinhos e cervejas. Os micro-organismos são, normalmente, diferenciados, distribuídos e identificados através de suas características fisiológicas e morfológicas. Mais atualmente novos critérios têm sido inseridos referentes às suas características bioquímicas e genéticas. Dados relativos à composição química de alguns mecanismos como a parede celular, à caracterização de
415 determinantes antigênicos e ao perfil enzimático têm revolucionado a taxonomia das microbiotas. (FRANCO & LANDGRAF, 2004.) 2.2 Fontes de contaminação De acordo com FRANCO & LANDGRAF (2004) as fontes de contaminação dos alimentos podem ser elencadas da seguinte forma: 1) plantas, onde poucos micro-organismos provenientes do solo ou da água tem capacidade de sobreviver e se multiplicar, com exceção dos fitopatógenos, que entre estes se destacam Corynebacterium, Pseudomonas, Xanthomonas e alguns fungos. 2) solo e água que são ambientes que podem ser analisados em conjunto devido a muitos dos micro-organismos neles presentes terem características semelhantes. Micróbios do solo podem, através do vento, infectar o ar e posteriormente chegar até os reservatórios de água por meio da chuva. Assim como a água da chuva pode remover micro-organismos do solo e levá-los até os mananciais. Este ciclo faz com que os micro-organismos da água e do solo sejam quase os mesmos. 3) utensílios como recipientes, invólucros objetos de manipulação e afins tem suma importância na contaminação de alimentos. Sua higienização imprópria gera uma contaminação cruzada entre os produtos. 4) trato intestinal do homem e de animais que são ricos em número e variedades de microorganismos. Esta é a fundamental fonte de contaminação dos alimentos com cepas de Salmonella e Shigella, entre outros. 5) manipuladores que podem estar contaminados com micro-organismos provenientes de todo o ambiente que os cercam e, em casos de higiene duvidosa, estes podem estar contaminados com organismos do trato intestinal e por consequência, podem transmitir estes microorganismos ao produto que manipulam. 6) ar e pó onde, teoricamente todos os micro-organismos podem ser encontrados na atmosfera, porém a prevalência é de bactérias Gram-Positivas e fungos. (FRANCO & LANDGRAF, 2004).
416 2.3. Doenças relacionadas com a ingestão de alimentos contaminados Infelizmente, através de alimentos contaminados, inúmeras pessoas irão contrair uma intoxicação ou uma infecção alimentar severas durante suas vidas (RICHARDS, 2003). As doenças de cunho alimentar significam milhares de dólares investidos em tratamentos, cerca de 76 milhões de doentes, 325 mil hospitalizações e 5 mil mortes por ano apenas nos Estados Unidos (DEWAAL, 2003). Nos países subdesenvolvidos estima-se que mais de seis mil pessoas morram todos os anos por doenças transmitidas por alimentos (Sistema de Informação sobre mortalidade), porém o número de casos pode ser muito maior, devido ao fato de alguns pacientes não procurarem ajuda médica, por motivos financeiros ou pelo fato de que a maioria das intoxicações e infecções alimentares terem sintomas muito parecidos com uma gripe. Os sintomas mais comuns são dores pelo corpo, principalmente no abdômen, estômago e cabeça, além de vômito e diarreia, sendo comum incriminar os alimentos recém-consumidos como causadores de distúrbios gastrintestinais. Considerando-se o fato de que, em condições normais, um indivíduo alimentam-se várias vezes por dia, é preciso mais do que o tempo de ingestão para esta moléstia se manifestar (FRANCO & LANDGRAF, 2004). 2.4. Doenças microbianas De acordo com o Center for Disease Control and Prevention (CDC) (2006), dos Estados Unidos, um surto de doença de origem alimentar deve ter a ocorrência de dois ou mais casos associados a um único alimento. Insumos de origem cárnea como o presunto apresentam um grande risco de contágio, pois apresentam as características ideais para a proliferação de vida microbiológica. Este risco é expandido quando a conservação e manipulação deste alimento são feitas em situação de higiene precária ou nula. De todos os micro-organismos passíveis de se encontrar em presuntos conservados em salmoura os mais comuns são: a) Escherichia coli Enteroinvasora (EIEC)
417 As cepas de EIEC são capazes de penetrar em células epiteliais e causar manifestações clínicas semelhantes às infecções causadas por Shigella. Em sua maioria, estas cepas apresentam diversas características bioquímicas que as tornam diferentes das cepas normais de E. coli, porém as assemelham a Shigella. As gastroenterites provocadas por EIEC apresentam como sintomas: diarreia, cólicas abdominais, febre e mal-estar geral, com eliminação de sangue e muco pelas fezes. O período de incubação varia de oito a vinte e quatro horas. O processo de invasão inicia-se com a internalização de EIEC pelos enterócitos através da endocitose, que tem seu citoesqueleto modificado para que este processo seja eficiente. Uma vez ingeridas, as cepas rompem as células e multiplicam-se e invadem células vizinhas, levando a um acúmulo de actínia e morte celular. As EIEC são mais comumente encontradas em crianças e adultos, mas seu isolamento em pacientes com diarréia não é comum. Alguns estudos têm apontado surtos com a ingestão de água e alimentos contaminados com estas cepas, no entanto a via mais comum de transmissão seja o contato interpessoal. (FRANCO & LANDGRAF, 2004) b) Salmonella sp. As doenças causadas por Salmonella sp. que se relacionam com alimentos são as febres entéricas causadas por Salmonella parathyphi, e as enterocolites ou salmoneloses causadas pelas demais espécies desta bactéria. O principal reservatório destas bactérias é o intestino tanto do homem quanto de animais. O reservatório de Salmonella thyphi é o homem, alguns se tornam portadores por muito tempo, mesmo após a eliminação dos sintomas. Estes portadores costumam ser a principal fonte de contaminação de alimentos e água com estas cepas. As febres entéricas são bastante semelhantes à febre tifóide, mas os sintomas são mais brandos. Geralmente ocorrem septicemia, febre, vômitos e diarreia. Enquanto a febre tifóide pode durar de uma a oito semanas, as febres entéricas duram no máximo três semanas. As salmoneloses caracterizam-se por sintomas que incluem diarreia, febre, dores abdominais e vômitos, cerca de doze ou trinta e seis horas após a exposição ao agente patológico, durando de um a quatro dias. De modo geral, as enterocolites causadas por Salmonella sp. não precisam de tratamento com antibióticos. (FRANCO & LANDGRAF, 2004)
418 Estudos demonstram que bactérias do gênero Salmonella apresentam simultaneamente diversos fatores de virulência quando acarretam em doença no homem, estes fatores podem agir sinergicamente ou individualmente. As infecções principiam na mucosa do intestino delgado e do cólon, onde as bactérias são fagocitadas iniciando uma resposta inflamatória no organismo do hospedeiro. Este é um dos micro-organismos mais habitualmente envolvidos em episódios epidêmicos de males associados a alimentação em diversos países inclusive no Brasil, na Europa cerca de 90% dos casos ocorre devido à esta bactéria. Dados divulgados nos Estados Unidos e Japão mostram que o número de casos de salmoneloses aumenta a cada ano. (FRANCO & LANDGRAF, 2004) c) Shigella sp. Bactérias do gênero Shigella são bacilos Gram-negativos, pertencentes à família Enterobacteriaceae, são micro-organismos adaptados ao homem e a primatas. A doença é disseminada através da via fecal-oral, mas algumas vezes também por alimentos. Shigella sp causa disenteria, um tipo de diarréia no qual as fezes apresentam sangue e muco. O período de incubação da doença é de um a sete dias, os sintomas variam muito em intensidade: desde uma infecção assintomática ou fraca, sem febre, até uma disenteria fulminante caracterizada por fezes com muco e sangue, desidratação, tenesmos, toxemia e até mesmo convulsões em crianças menores de quatro anos. (FRANCO & LANDGRAF, 2004.) Apesar de esta bactéria ser transmitida de pessoa à pessoa, já foram relatados muitos surtos de infecção ocasionados pela ingestão de alimentos contaminados. As medidas de controle e prevenção da shigelose de origem alimentar estão relacionadas com a boa higiene pessoal e educação dos manipuladores de alimento. A contaminação de alimentos e água com Shigella sp, indica contato recente com fezes humanas devido a sensibilidade deste microorganismo. (FRANCO & LANDGRAF, 2004) d) Debaromyces São leveduras que apresentam células vegetativas esféricas e possuem reprodução por brotamento multilateral, apresentam pouca atividade fermentativa. As espécies de Debaromyces têm elevada tolerância ao sal e pertencem ao grupo das leveduras formadoras
419 de películas na superfície de alimentos salgados ou mantidos em salmouras, como é o caso do presunto(silva, JUNQUEIRA E SILVEIRA, 2001). 2.5. Controle do Desenvolvimento microbiano nos alimentos As principais preocupações quanto ao domínio do desenvolvimento microbiano é eliminar riscos oferecidos à saúde do consumidor, bem como prevenir ou retardar o surgimento de alterações indesejáveis no insumo. O ideal é que os micro-organismos nunca entrem em contato com os alimentos, porém uma vez isto sendo impossível, é preciso empregar métodos de controlar seu crescimento. Existem inúmeras maneiras para controlar este desenvolvimento como a manutenção de temperatura, controle das condições atmosféricas, armazenamento e embalagem. Através da combinação de dois ou mais métodos é possível conservar adequadamente um alimento. Os princípios envolvidos na conservação de alimentos são: a prevenção ou retardamento da decomposição microbiana; prevenção ou retardamento da auto decomposição do alimento; prevenção de injúrias causadas por insetos, roedores e produtos de origem química. Os métodos mais indicados para a conservação de presunto são a adição de conservantes químicos e a refrigeração, em alguns casos o congelamento. O armazenamento do produto em condições adequadas de umidade é necessário para prevenir o desenvolvimento de bolores e bactérias e para a estabilidade do alimento como um todo. 2.6. Conservação de alimentos através do resfriamento Temperaturas abaixo de 10ºC são geralmente as temperaturas de resfriamento de produtos cárneos, porém, não impede a proliferação dos micro-organismos, apenas diminui sua velocidade de crescimento. Alguns patógenos de cunho alimentar têm a capacidade de se desenvolver e produzir toxinas em temperatura de refrigeração, mas a maioria não cresce abaixo de 4 C. Os presuntos assim como outros alimentos podem conter fungos e bactérias que utilizam o produto como substrato para crescimento e desenvolvimento, e como resultado
420 de seu metabolismo liberam toxinas que causam a intoxicação alimentar em quem ingerir o produto em questão. Da mesma forma existem micro-organismos que infectarão o consumidor utilizando o organismo e metabolismo deste para se desenvolver. (FRANCO & LANDGRAF, 2004) 2.7. Legislação de conservação de alimentos Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), os alimentos devem ser armazenados de forma a impedir a contaminação e/ou a proliferação de micro-organismos. Os recipientes e embalagens devem estar protegidos contra alterações e danos. O local de armazenamento deve ser limpo, sendo os alimentos mantidos separados por tipo ou grupo, sobre estrados distantes do piso, ou sobre estantes, bem conservadas e limpas ou sobre outro sistema aprovado, afastados das paredes e distantes do teto de forma a permitir apropriada higienização, iluminação e circulação de ar (RESOLUÇÃO-RDC ANVISA n 275, 2002). 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Amostras Todos os experimentos foram realizados no laboratório de Microbiologia do Instituto Integrado de Saúde da Faculdade da Serra Gaúcha. Foram selecionadas três amostras de marcas diferentes, todas em embalagens plásticas seladas e conservadas em salmoura, adquiridas no mesmo estabelecimento, procurando observar a data de fabricação, certificando-se a data de validade (Tabela 1). As amostras foram compradas no dia da análise e condicionadas adequadamente para evitar contaminação, em temperatura igual ou inferior de 4 C. Tabela 1: Descrição das amostras. Amostra Data de Fabricação Data de Validade A1 07/10/13 21/11/13 A2 03/10/13 17/11/13
421 A3 24/09/13 25/12/13 3.2. Materiais Para garantir a esterilidade do experimento os meios de cultura, frascos, utensílios e vidrarias estes foram lavados e autoclavados em embalagens apropriadas. 3.3 Semeaduras das amostras nos meios de cultura: Foram pesadas em balança semi-analítica 25g de cada amostra, cortadas em pequenos pedaços com o auxílio de uma espátula e uma pinça, estas foram mergulhadas em 100 ml de Solução Salina Peptonada 0,1%, os frascos foram agitados por cerca 60 segundos em vórtex. Após foram realizadas duas diluições seriadas, sendo a primeira e a terceira diluição semeadas nas placas de Petry contendo os diferentes meios de cultura, todos os procedimentos foram realizados dentro da cabine de proteção biológica. As amostras foram semeadas nos seguintes meios: Agar Saboraud, Agar Nutriente, Agar Bile Esculin, SS Agar. Para cada amostra foram realizadas triplicatas em cada meio. Cada amostra recebeu um código, sendo assim cada placa recebeu uma identificação de acordo com o número da amostra e a diluição correspondente. Para o crescimento dos micro-organismos as placas foram colocadas em estufa bacteriológica por 48 horas à 35ºC. Passada as 48 horas, de acordo com cada meio de cultura foram efetuadas as análises de crescimento microbiano quanto ao crescimento, formato e cor das colônias. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Alimentos podem ser veículos de intoxicações e infecções alimentares. Em espécies como o presunto, não se espera encontrar contaminações por micróbios, pois uma vez presentes estes podem ser mascarados por conservantes químicos e ao serem consumidos podem causar moléstias em quem ingerir. Alguns produtos contêm altas taxas de conservantes
422 e em sua embalagem apresentam validade de até três meses como, por exemplo, uma das marcas utilizadas neste estudo. Neste trabalho pode-se observar o crescimento na amostra três enquanto na amostra um e dois não se observou presença de colônias significativas. De acordo com a tabela 2, a única amostra que estava contaminada era a amostra de numero três em todas as diluições. Tabela 2: Avaliação de crescimento. AMOSTRA MEIOS DE CULTURA Diluição 10-2 SS AGAR BILE AGAR NUTRIENTE SABOURAUD A1 Ausência Ausência Ausência Ausência A2 Ausência Ausência Ausência Ausência A3 Presença Presença Presença Presença Diluição 10-3 A1 Ausência Ausência Ausência Ausência A2 Ausência Ausência Ausência Ausência A3 Presença Presença Presença Presença Apesar de ainda estar no prazo de validade, conservado em refrigerador e com embalagem vedada e com a salmoura, a amostra número três apresentava, inicialmente, uma lâmina na superfície da fatia com uma coloração que alternava de acordo com a luz, conforme era manuseada a amostra apresentava um brilho hora esverdeado hora dourado acobreado. Esta amostra era a que tinha o maior período de validade descrito na amostra. Segundo as pesquisas realizadas, o organismo que ocasiona este efeito em alimentos conservados em salmoura é uma levedura do gênero Debaromyces ao produzir toxinas inerentes a seu metabolismo (FRANCO & LANDGRAF, 2004.). A cultura desta amostra comprovou a presença de um fungo do tipo leveduriforme no presunto, indicando a presença de Debaromyces. Ao mesmo tempo, esta amostra apresentou diagnóstico positivo para enterobactérias, Salmonella e Shigella, enquanto as outras apresentaram diagnóstico negativo em todas as placas. A coloração de gram e na análise microscópica, comprovou que a presença de, Bacillus gram negativos, confirmando a presença de bactérias patogênicas indicadas pelos meios seletivos que são Salmonella,
423 Enterobacter e Shigella. No meio Bili Esculina também foi encontrado um estafilococos gram negativo, podendo este ser um Micrococos. CONSIDERAÇÕES FINAIS A microbiologia de alimentos é de suma importância para a saúde da população em geral, sendo que as análises microbiológicas dos alimentos previnem a instauração de uma epidemia de doenças transmitidas por estes que podem ser carreadores de micro-organismo e suas toxinas metabólicas. A presença destes organismos reflete os métodos de higiene dês de a criação dos animais até a manipulação do produto pelo consumidor. Por vezes é impossível evitar a contaminação, porém boas práticas podem reduzir consideravelmente o risco de uma intoxicação e de uma infecção alimentar. Esta contaminação pode ocorrer por parte dos manipuladores ao não higienizarem as mãos e os utensílios ou mesmo por não utilizarem os equipamentos de proteção individual de forma apropriada, já por parte dos fornecedores, o contágio pode se dar por embalagem inadequada, estocagem e falta de cuidados quanto a temperatura de refrigeração e o fluxo de ar. O consumidor também deve ter cuidados com sua higiene para não contaminar os insumos e possivelmente transmitir doenças a outras pessoas. A adição de conservantes químicos também deve ser realizada com cuidados, pois estes podem encobrir a presença dos micróbios indicadores de degradação ou mesmo os patógenos. Estes aditivos ainda podem causar alergias, gastrointerites, desconforto abdominal e outros sintomas decorrentes da intoxicação química. Cabe aos órgãos públicos como a Vigilância Sanitária, a Agência Nacional de Vigilância e Saúde fiscalizar as empresas produtoras, os estabelecimentos fornecedores e os transportadores dos produtos de maneira rígida para que não sejam liberados à população alimentos insalubres que prejudiquem sua saúde e seu modo de vida. Quanto aos consumidores cabe cobrar dos responsáveis esta vigilância. 5 REFERÊNCIAS FRANCO, M. G.D.B.; LANDGRAF M. Microbiologia dos alimentos. 1 ed. São Paulo: Editora Atheneu, 2004.
424 SILVA, N.; JUNQUEIRA, A.C.V.; SILVEIRA, A. F. N. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. 2 ed. São Paulo: Livraria Varela, 2001. GEITENES, S.; OLIVEIRA, B. F. M.; KALSCHNE, L. D. Avaliação de micro-organismo patogênicos e modelagem matemática do crescimento de deteriorantes em presunto fatiado embalado à vácuo. Paraná. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária; Regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos. Brasil, 2001. CDC. Center of Desease Control and Prefention; Doenças transmitidas por alimentos. Estados Unidos, 2006.