Técnica de Imunodifusão para a Detecção de Anticorpos Precipitantes contra Antígenos Solúveis. Prof. Helio José Montassier

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1 Técnica de Imunodifusão para a Detecção de Anticorpos Precipitantes contra Antígenos Solúveis Prof. Helio José Montassier

2 INTRODUÇÃO Termo utilizado para designar testes sorológicos realizados em meio gelificado, no qual os reagentes (Ag e Ac) se misturam por difusão Difusão simples em uma dimensão Oudin Difusão dupla em duas dimensões Ouchterlony.

3 INTRODUÇÃO Dupla difusão em gel de ágar Reação de precipitação entre o Ag e o Ac específico em meio gelificado, onde ambos os reagentes se difundem um contra o outro, formando uma linha ou arco de precipitação na área de reação Essa técnica permite também avaliar com relativa facilidade os "componentes antigênicos" encontrados em misturas complexas

4 INTRODUÇÃO A IDGA Permite também revelar se duas ou mais substâncias são imunologicamente idênticas ou independentes. Essa técnica geralmente é feita sobre lâminas de microscopia ou placas de Petri, revestida com uma camada de gel de ágar de 0,6 a 1,5% em solução fisiológica ou tamponada.

5 Fig. Fenômeno da Imunoprecipitação Importância da Equivalência entre as Concentrações de Ag e Ac para ocorrer a Soroprecipitação e a maior formação de imunecomplexos precipitáveis.

6 Passos básicos para a realização de IDGA (1)

7 Passos básicos para a realização de IDGA (2)

8 Passos básicos para a realização de IDGA (3)

9 Passos básicos para a realização de IDGA (4) Antígenos e Anticorpos se encontram em proporções ótimas de suas concentrações (zona de equivalência) reagem, formam imunocomplexos que se precipitam formando uma linha ou arco de precipitação.

10 Conceitos e Características da IDGA

11 Fatores que influenciam na velocidade da difusão na técnica de IDGA:- O tamanho dos poros de gel A temperatura A concentração e pureza do ágar As concentrações das substâncias reagentes e o tamanho e forma molecular dos reagentes.

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13 Aplicações em Medicina Veterinária:- O teste de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) Diagnóstico da Anemia Infecciosa Equina (AIE) - MAPA (Redação dada pelo(a) Portaria) 495/2010/SDA/MAPA. Diagnóstico da Leucose Bovina Diagnóstico de Língua Azul Diagnóstico da Artrite-encefalite dos caprinos (CAEV) Diagnóstico da influenza aviária Diagnóstico de Brucelose canina

14 Material para a técnica de IDGA:- 1. Ágar a l% em solução fisiológica 2. Lâmina de microscopia 3. Pipeta graduada de 5ml 4. Micropipetadores 5. Solução do Ag (gama globulina bovina a l mg de proteína por/ml) 6. Soros de camundongos imunizados com gama globulina bovina e diferentes tipos de adjuvante (completo de Freund (ACF) ou incompleto de Freund (AIF) ou com hidróxido de alumínio (AlOH3), ou ainda sem adjuvante) devendo conter, portanto, Acs anti- gama globulina bovina. 7. Molde perfurador de ágar para IDGA 8. Placas de Petri com algodão umedecido (Câmara úmida) 9. tubos de ensaio e estantes para diluição 10. Pipetas de lml 11. Solução salina

15 Metodologia:- 1. Fundir o ágar em banho-maria de água fervente 2. Aplicar com cotonete sobre a lâmina uma camada de ágar e esperar secar 3. Colocar, com a pipeta, 3ml de ágar sobre as lâminas. Esperar esfriar e solidificar. Manter as lâminas em câmara úmida para não dessecar o gel. 4. Com o molde perfurador adequado, fazer os orifícios no gel e, em seguida, retirar os fragmentos de ágar com uma agulha hipodérmica 5. Diluir os soros de cobaio anti- gama globulina bovina a l/2, l/4, l/8, l/l6 e l/32 distribuindo em cada um dos 5 tubos 0,5ml de solução salina e, depois, no lº tubo colocar 0,5ml de soro. Homogeneizar bem e passar 0,5ml para o 2º tubo e assim sucessivamente até o último tubo 6. Aplicar, usando um micropipetador, 10 ul para cada amostra, o Ag gama globulina bovina (lmg/ml), as diluições do soro de camundongo anti-gama globulina bovina e incubar por hs. E depois fazer a leitura das linhas de precipitação (próxima quarta-feira- 21/09/16, no Laboratório de Imunologia).

16 Características e Vantagens e Desvantagens da Técnica de IDGA

17 Metodologia Preparo de Diluições seriadas de razão = 2 do soro teste. Distribuição de cada uma das diluições seriadas do soro em cada um dos pocinhos abertos no ágar para a técnica de IDGA. Ag

18 Metodologia

19 APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE IDGA PARA O SORODIAGNÓSTICO DA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA

20 Fig. 1. (A) Model of an EIAV particle showing probable locations of the major structural antigens. (B) EIAV proviral genome organization. The structural proteins of EIAV are produced from polyprotein precursor molecules that are cleaved either by a virally encoded Protease (Gag/Pol) or by cellular endoproteinases (SU/TM). LTR, long terminal repeat; PR, protease; RT- RH, reverse transcriptase-rnase H; DU, dutpase; IN, integrase; tat, transcriptional trans-activator; rev, regulator of viral mrna splicing and transport; SU, surface unit glycoprotein; TM, transmembrane glycoprotein.

21 Pathogenesis (chronic infection) virus multiplies in leukocytes antigenic change immune complexes anemia thrombocytopenia Fever and viremia infectious phases

22 Asymptomatic carriers infectious phase viremia stress or steroids

23 Fig. - Kinetics of adaptive immune responses following experimental infection with EIAV. Humoral immune responses in terms of relative neutralizing antibody (neut Ab), Env-specific and p26 specific IgG levels are shown along with immunoglobulin avidity index and conformational dependence measurements (Hammond et al., 1997). Relative levels of Env-specific cytotoxic T- lymphocyte (CTL) activity during the 36-month observation period are also included.

24 Atualmente, o único meio seguro de se diagnosticar a infecção pelo vírus da anemia infecciosa equina (VAIE) é através de um exame de sangue. A técnica utilizada é a Imunodifusão dupla em gel de ágar (IDGA), também chamada de prova de Coggin s. Desde 1970 este teste, que detecta a presença de anticorpos contra uma proteína do vírus, tem sido usado e reconhecido internacionalmente como o teste sorológico - gold standard para o diagnóstico da AIE (anemia infecciosa equina). Trata-se de uma prova qualitativa, isto é, identifica o animal portador e não-portador. Sua especificidade é alta devido ao fato de que as reações inespecíficas poderão ser identificadas pela formação de linhas de "não-identidade". Por isto, é o método escolhido para certificar animais como livres da doença para exportação, transporte e eventos. Uma vez que o vírus da anemia infecciosa equina sofre alta variação antigênica, resultando em mutantes com diferentes antígenos, o antígeno escolhido na prova de Imunodifusão é a proteína principal do core viral: a p26. Esta proteína mostrou ser altamente conservada em diferentes variantes isoladas.

25 (B) (C) (D) Fig. IDGA para a detecção de Acs no soro de cavalos contra o VAIE REAÇÃO NEGATIVA (B): -não ocorre linha de precipitação entre os poços contendo o antígeno e o soro teste. -as linhas de precipitação entre os poços cotnedo o antígeno e o soro padrão são retas e prolongam-se até a cavidade contendo o soro teste sem encurvar-se: REAÇÃO POSITIVA (C): - ocorre uma linha de precipitação entre os poços contendo o antígeno e o soro teste e esta linha é contínua com a linha formada entre o antígeno e o soro padrão: REAÇÃO POSITIVA FRACA (D): -as linhas de precipitação entre os poços contendo o antígeno e o soro padrão encurvam-se em direção ao poço contendo o soro teste. -ocorre ou não a formação de uma linha muito fraca entre os poços contendo o antígeno e o soro teste.

26 Interpretação dos Resultados do Teste de IDGA para a detecção de Acs de Cavalos contra o vírus da anemia infecciosa equina a. qualquer cavalo adulto que reaja à prova de Imunodifusão pode ser considerado infectado pelo vírus AIE. b. um soro recolhido durante o período de incubação da AIE poderá fornecer um resultado fraco-positivo. O reteste, após 2 ou 3 semanas, produzirá uma reação mais forte. c. soros de potros que mamam em éguas infectadas podem fornecer resultados positivos devido aos anticorpos maternos presentes no colostro.

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