ROTEIRO DE AULAS TEÓRICO-PRÁTICAS EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

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1 Unesp - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CÂMPUS DE JABOTICABAL FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS Departamento de Patologia Veterinária ROTEIRO DE AULAS TEÓRICO-PRÁTICAS EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA HÉLIO JOSÉ MONTASSIER (Professor Titular - Disciplina de Imunologia Veterinária ) JABOTICABAL - SP

2 1 ÍNDICE Introdução as técnicas de laboratório em Imunologia... 3 Preparo de antígenos para imunização de camundongos e cobaias para a obtenção de soros precipitantes e aglutinantes... 8 Purificação parcial dos anticorpos presentes no soro normal através da precipitação da fração gama-globulina com sulfato de amônio Purificação de IgG através de cromatografia de troca iônica Reação quantitativa de soroprecipitação Caracterização da fração gama globulina precipitada por imunoeletrofores Imunohemólise - experiência de Erlich Morgenroth Modificada Técnica de Imunodifusão Dupla em Gel de Agar para Titulação de Soro Anti-Gama Globulina Reação de Soroaglutinação para Titulação de Anticorpos Anti-Hemácias de 34 Carneiro... Método indireto de ELISA para detecção e titulação de anticorpos de cobaia antigamaglobulina bovina Técnicas de SDS-PAGE e de WESTERN-BLOTTING Testes Rápidos de Sorodiagnóstico Testes Imunocromatográficos 43

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4 3 INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS DE LABORATÓRIO EM IMUNOLOGIA São imprescindíveis para o estudo e o desenvolvimento do conhecimento em Imunologia a experimentação e a manipulação de materiais denominados antígenos, cuja principal propriedade é a capacidade de induzir respostas imunes (no caso de serem antígenos completos) e de reagir com os produtos de tais respostas imunes (sejam antígenos completos ou incompletos/haptenos), particularmente com anticorpos. Os antígenos mais utilizados na experimentação em Imunologia são provenientes de fontes naturais, como proteínas séricas ou de ovos de galinha (soro albumina, gama globulina e ovoalbumina, etc.), eritrócitos (eritrócitos de carneiro, eritrócitos de galinha etc.) e microrganismos (bactérias e vírus). A maioria desses antígenos naturais possuem muitos sítios antigênicos diferentes, em uma única molécula; e se forem considerados os antígenos presentes em uma membrana ou parede celular (eritrócitos e bactérias) há um número muito maior de sítios antigênicos, que fazem parte da estrutura de cada molécula, a qual faz parte da constituição de tal membrana ou parede celular. Os exercícios apresentados a seguir descrevem o preparo de dois tipos básicos de preparações antigênicas: um de natureza macromolecular solúvel (soro albumina bovina) e o outro de natureza particulada (eritrócitos de carneiro). Deve ser salientado que esses dois tipos de antígenos representam dois grupos importantes (um de natureza solúvel e o outro de natureza particulada) e para efeito de estudo e experimentação se constituem em ótimos modelos de trabalho, substituindo muito bem preparações antigênicas de microrganismos que podem oferecer riscos quando são manipulados por indivíduos não experientes. Principais preparações antigênicas usadas em atividades experimentais em imunologia: Antígenos particulados: apresentam dimensão de uma célula e, ao se adicionar um diluente apropriado, forma-se uma suspensão. Ex: bactérias e células eucariontes, como hemácias (carneiro, galinha). Antígenos solúveis: apresentam dimensão de macro-molécula e, ao se adicionar um diluente apropriado, forma-se uma solução. Ex: proteínas (ovoalbumina, gamaglobulina) e polissacarídeos.

5 4 Tipos de diluentes Solução salina (NaCl 0,15 M) PBS ou Tampão Fosfato Bicarbonato 01. Preparo de suspensão de hemácias de carneiro a 2%: (Antígeno Particulado Indutor de Anticorpos Soroaglutinantes). Os eritrócitos de uma dada espécie animal revelam propriedades antigênicas marcantes quando são injetados em animais de uma outra espécie. Os anticorpos anti-eritrocitários são induzidos diretamente contra determinantes antigênicos presentes nas membranas dessas células. Essas membranas celulares se constituem, por sua vez, de misturas complexas de proteínas fibrosas, lipídeos e mucopolissacarídeos, sendo que os lipídeos são ligados mais ou menos firmemente a algumas dessas proteínas. As variações na estrutura molecular das proteínas, lipídeos e carboidratos nas membranas celulares dos eritrócitos de diferentes espécies animais e mesmo entre indivíduos de uma mesma espécie são os principais responsáveis pelo amplo espectro de determinantes antigênicos diferentes que essas células apresentam. Além de serem usados como antígenos particulados para a produção e titulação de anticorpos específicos aglutinantes, os eritrócitos podem ser empregados na montagem da técnica de hemaglutinação passiva condicionada e para a detecção de anticorpos contra antígenos solúveis que, nesse caso, são ligados à superfície de eritrócitos. As suspensões de eritrócitos podem ser padronizadas volumetricamente e espectrofotometricamente. A primeira técnica é suficiente para se prepararem suspensões de hemácias para serem usadas na imunização de animais, mas a técnica de padronização espectrofotométrica é necessária para preparar suspensões de hemácias que são empregadas em reações de imuno-hemólise, ou na detecção/titulação de anticorpos hemolíticos, isto é, fixadores do complemento. Em virtude de sua grande sensibilidade a mudanças do ambiente físico e químico, os eritrócitos recém-colhidos devem ser manipulados com muito cuidado e as suspensões preparadas para serem usadas nas titulações de anticorpos não devem ser armazenadas por mais de um dia, em temperatura de geladeira. 1.- Materiais e Métodos:

6 5 (Figura01) 1.1. Sangue de carneiro colhido em solução anti-coagulante de Alsever 1 (v : v) 1.2. Filtrar em Algodão hidrófilo Centrifugar a 2500 rpm/4 minutos Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 15 volumes de solução salina 0,l5M. (Figura 02) 1.5. Centrifugar a 2500 rpm/4 minutos Repetir os ítens l.4. e l.5. mais uma vez Preparar a suspensão de hemácias a 2% em solução salina(v:v), aferição e padronização volumétrica Para aferição ou padronização espectrofotométrica de uma suspensão de eritrócitos a 1%, proceder como no protocolo abaixo descrito: Pipete 4 ml de água destilada em 1 tubo e adicione 1 ml de uma suspensão de eritrócitos a 2%. Misture bem para promover a lise, invertendo o tubo, previamente coberto com papel filme sobre o polegar Leia a densidade óptica (DO) da solução de lisado de eritrócitos contra um branco de água destilada, no espectrofotômetro, e no comprimento de onda de 550 nm. A seguir, aplique a fórmula abaixo: Vf = Vi x DO / 0,300 e Vf - Vi = Volume de diluente que deve ser acrescentado para proporcionar uma suspensão de eritrócitos de carneiro com concentração padronizada de 1%. Sangue + Anti- Coagulante Após passos 1.2 e 1.3 Sobrenadante Figura 01 Salina 4ml 1 Tipos de soluções anti-coagulantes: solução de Alsever (citrato de sódio + glicose + NaCl + ácido cítrico), oxalato, EDTA, heparina.

7 6 02. Preparo de solução de soroalbumina bovina a l,0% e 5%, considerando que você vai usar um volume de 5ml para inocular os animais (Exercício teórico) (Antígeno Solúvel Indutores de Anticorpos Soroneutralizantes) 03. Técnica de diluições seriadas: 3.1. Séries com razão constante e diluições sucessivas. Nesta técnica, transferem-se volumes sucessivamente de um tubo para outro seguinte, ao qual se adicionou quantidade adequada de diluente. Exemplo 1. Diluições sucessivas com razão constante igual a 2 (figura 03) 1) Distribuir numa série de tubos com l ml de diluente. 2) Ao tubo l adicionar l ml do material. 3) Transferir l ml do tubo l para o tubo 2. 1ml Material 1ml de salina em todos 1 1/2 1ml 1ml 1ml 1ml ml 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 6 Figura 02 4) Transferir l ml do tubo 2 para o tubo 3. 5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. As diluições obtidas serão: l:2; l:4; l:8; l:l6; l:32;l:64 Exemplo 2. Diluições sucessivas com razão constante igual a l0 (figura 04) 1) Distribuir 9ml de diluente numa série de tubos. 2) Ao tubo 1 adicionar 1 ml do material não diluído. 3) Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2.

8 7 4) Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3. 5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. As diluições obtidas serão: 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10.000; e 1: ml Assunto 01- figura 03 Material 1 1ml 1ml 1ml 1ml /10 1/100 1/ / / Figura 03 Problemas: 1. Como você faz para diluir um soro a 1/50;1/100;1/200;1/400 e 1/800? 2. Como você procede para diluir um vírus de 10-3 a 10-8? Perguntas: 1. Qual o procedimento geral para se preparar uma suspensão antigênica bacteriana a 5%? 2. Como se faz para preparar uma solução antigênica de gamaglobulina bovina a 0,1%, num volume final de 5ml? 3. Qual das preparações antigênicas acima (exercícios 1 e 2) será usada para a obtenção de soros: a) Precipitantes b) Aglutinantes 4. Qual(is) a(s) principal(is) finalidade(s) de se fazer uma escala de diluições seriadas? 5. O que são: a) Solução anti-coagulante de Alsever b) Solução salina d) Soro c) Plasma e) Solução salina tamponanda

9 8 PREPARO DE ANTÍGENOS PARA IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS E COBAIAS PARA A OBTENÇÃO DE SOROS PRECIPITANTES E AGLUTINANTES ESTUDAR AS BASES DA IMUNOLOGIA ESTUDAR MODELOS DE FENÔMENOS IMUNOLÓGICOS Antígeno + Estímulo do Sistema Imune = Resposta Imune (Resposta Imune Humoral e/ou Resposta Imune Celular) Características fundamentais das respostas imunes: Reconhecimento Especificidade Memória I - PREPARO DE SOLUÇÃO DE GAMA GLOBULINA BOVINA 1. Preparar uma solução de Gama Globulina Bovina (GGB) a 2 ml/ml. (figura01) 2. Após a dissolução misturar 1ml da solução de GGB com 1ml de adjuvante completo de Freund (ACF) ou com 1ml de adjuvante incompleto de Freund (AIF).(figura 02) 3. Misturar a solução de GGB com a de hidróxido de alumínio a 2,5% na proporção de 7 volumes da primeira para 3 volumes da segunda.(figura 03) 4. Imunizar a cada 15 dias durante 30 dias as cobaias, sendo cada grupo para um adjuvante diferente. Imunizar um grupo só com a solução de antígeno sem adjuvante. A via de injeção é subcutânea, devendo-se inocular 0,5ml por animal. 5. Sangrar os animais 2 semanas após o início e, ao final, l semana após a reimunização. Separar os soros, nos 2 casos e fazer a titulação deles por imunodifusão dupla em gel de ágar.

10 9 GGB a 2mg/ml 5ml da solução 1ml de ACF ou 1ml deaif 7 volumes de GGB 3 volumes de Hidróxido Figura 04 de sódio

11 10 II - PREPARO DE SUSPENSÃO ANTIGÊNICA DE ERITRÓCITOS DE CARNEIRO 1. O sangue é retirado previamente com anticoagulante (solução de alsever) de um carneiro, conforme o descrito no roteiro anterior. (figura 04) 2. Passar o sangue colhido por um funil com algodão hidrófilo. 3. Recolher o sangue filtrado e centrifugá-lo a baixa rotação por 5 minutos. 4. Dispensar o sobrenadante com pipeta pasteur ou com trompa de vácuo. 5. Colocar cerca de l0ml de salina, homogeneizar e centrifugar novamente, para lavar as hemácias. 6. Repetir os ítens (4) e (5) mais 2 vezes, ou até quando o sobrenadante estiver claro. 7. Preparar a suspensão de hemácias a l0% (v/v) em solução salina. Homogeneizar bem. 8. Injetar 3 grupos de camundongos de 5 camundongos cada, por via subcutânea (0,1ml/animal). Em 5 camundongos injetar hemácias de carneiro com adjuvante completo de Freund, em outros 5 camundongos injetar a mistura de hemácias de carneiro mais adjuvante incompleto de Freund e nos outros 5 camundongos restantes injetar a suspensão de hemácias sem adjuvante. (figura 05) 9. Repetir as imunizações depois de l5 dias, e sangrar 20 dias depois da última imunização. (figura 06) Sangue + Anti- Coagulante Figura 05 Hemácias Hemácias Hemácias + + sem Adjuvante ACF Grupo 1 AIF Grupo 2 Grupo 3 Figura 06

12 11 Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 0,1 ml 0,1 ml 0,1ml Figura 07 Espera-se que ocorra: Antígeno Sistema Imunológico Respostas Imunológicas Estímulo 1ª Etapa Organismos Antígeno Inoculados Macrófagos ou Células dendríticas 2ª Etapa Lisossoma MHC II + Fragmentos Peptídicos Fragmentos Peptídicos Fragmentos Peptídicos T B Lisossoma Estímulo Secundário Figura 08

13 12 Principais fatores que interferem na imunogenicidade dos Ags: Peso molecular Complexidade molecular Concentração Digestibilidade Adjuvantes São imunomodeladores, ou seja, substâncias capazes de potenciar, inespecificamente, as respostas imunes contra os antígenos. Tipos: Minerais Ex: Al(OH) 3, óleo mineral/emulsionante (Adjuvante Incompleto de Freund AIF) Orgânicos Ex: Saponina, óleos vegetais e lecitina de soja Produtos derivados de microrganismos Ex: bactérias (Mycobacterium spp.; Propyonabacterium acnes; bactérias gram negativas - LPS), fungos (Sacharomyces cerevisae - Glucana) OBS: O Adjuvante Completo de Freund (ACF) é composto de óleo mineral + emulsionante + Mycobacterium spp. Efeitos principais dos Adjuvantes: Efeito depósito Aumentar resposta inflamatória no local da inoculação Ativação de células imunocompetentes ou apresentadoras de antígenos PERGUNTAS 1. Em quais formas principais podem-se apresentar os antígenos e qual a natureza química deles? 2. O que são adjuvantes, quais as principais formas e para que eles são usados? 3. Quais as principais vias de administração de um antígeno no organismo normal? 4. Por que são feitas várias inoculações de um antígeno, durante o processo de imunização? 5. Após o término da imunização, qual a modalidade de Resposta Imune que será avaliada?

14 13 PURIFICAÇÃO PARCIAL DOS ANTICORPOS PRESENTES NO SORO NORMAL ATRAVÉS DA PRECIPITAÇÃO DA FRAÇÃO GAMA-GLOBULINA COM SULFATO DE AMÔNIO. 1. INTRODUÇÃO - GENERALIDADES Para estudar a estrutura dos Acs é necessário purificá-los previamente. Tal purificação é de grande interesse prático, pois diminui consideravelmente as reações produzidas pelos soros quando eles são utilizados com finalidades profilática ou terapêutica. Os métodos usados para purificação dos Acs se filiam a duas modalidades: métodos não específicos e específicos. Os primeiros se baseiam em técnicas de fracionamento físico ou físico-químico e não permitem separar as gamaglobulinas normais dos Acs. Os métodos específicos, por outro lado, baseiam-se na dissociação ou eluição dos imunocomplexos e permitem obter os Acs em alto grau de pureza, livres de imunoglobulinas (Igs) inespecíficas. São os métodos de escolha para estudos experimentais, porém, não podem ser aplicados aos soros terapêuticos em virtude de baixo rendimento inerente ao processo de purificação. O método de precipitação com sais neutros ("Salting-out") é de uso corrente e utiliza, sobretudo, o sulfato de amônio e o sulfato de sódio. De modo geral, quando se deseja precipitar todas as globulinas de um soro sanguíneo, adiciona-se sulfato de amônio a 50% de saturação ou sulfato de sódio a 22% de saturação (a 37ºC) permanecendo solúvel apenas a fração albumina. Outra maneira é precipitar as frações Gama e Beta globulina que contêm praticamente a maior parte das proteínas com função de Acs com sulfato de amônio a 40% de saturação ou com sulfato de sódio a l9% de saturação (a 37ºC). No nosso caso, será utilizado o método de precipitação das frações gama e beta globulina com sulfato de amônio a 40% de saturação.

15 14 2. MATERIAL - 5ml de soro sanguíneo - 5ml solução salina tamponada com fosfatos (PBS) - solução de sulfato de amônio a l00% de saturação - becker de 50ml - pipeta de lml, 2ml, 5ml, l0ml - tubos cônicos plásticos de centrífugas - bastões de vidro pequenos e grandes - provetas de 25, 50ml e 1000ml - saco de diálise, cordonê - becker de 2 litros - pipeta pasteur e tetina - erlenmeyer de 125 e 250 ml 10ml de solução Figura MÉTODOLOGIA 3.1. Juntar 5ml de soro com 5ml de P.B.S Calcular o volume de sulfato de amônio a l00% de saturação que deverá ser acrescentado a mistura de soro mais P.B.S. no volume final de l0ml; volume de sulfato de amônio a l00% de saturação onde: V - volume final de soro + PBS C - A saturação do sulfato de amônio desejado (40%) V x C X = l00-c

16 Sob agitação cuidadosa, acrescentar gota a gota o volume calculado do sulfato de amônio a l00% de saturação, para dar uma saturação final de 40%. Soro + PBS Proteínas solúveis Proteína H O H Proteína / Globulinas Camada de Solvatação Figura Continuar agitando por mais 30 minutos Transferir o volume para os tubos de centrífuga e levar a centrífuga a 3000rpm por l5 minutos. + Sulfato de Amônio Remoção da Camada de Solvatação Precipitação das Globulinas Figura Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com solução de sulfato de amônio a 42% de saturação, isto é deve-se centrifugar e descartar o sobrenadante, ressuspender com cuidado o sedimento na solução de sulfato de amônio a 42% de saturação. Obs.: Cálculo da solução do sulfato de amônio a 42% de saturação: X = V x C X = Vol. de sulfato de amônio a 100% de saturação C X = 30 x 42 V = Vol. desejado da solução (30 ml) C = Saturação final do sulfato de amônio (42% de saturação) X = 21,72 ml de sulfato de amônio a 100% de saturação + 30 ml de água destilada

17 16 Figura Após a última lavagem, descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 ml de PBS com cuidado e com o uso de pipeta Pasteur O sedimento ressuspenso deve ser colocado dentro do saco de diálise, esse deve ser fechado e se coloca para dialisar contra salina. Deixa-se dialisar por 2 dias a 4ºC, com duas trocas de líquido de diálise ao dia. 4. Retira-se a fração precipitada do saco de diálise e guarda-se em congelador a -20ºC para ser testada por imunodifusão. PERGUNTAS 1) O que são imunoglobulinas e quais as suas principais propriedades físico-químicas e biológicas? 2) Qual o objetivo de se purificar anticorpos? 3) Como atua o sulfato de amônio sobre moléculas de imunoglobulinas e por que é importante se conhecer o grau de saturação sulfato de amônio para fazer a separação das imunoglobulinas? 4) O que é diálise, e por que esse processo é empregado nesse caso?

18 17 PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA 1.- INTRODUÇÃO E GENERALIDADES São reconhecidos, no mínimo, dois métodos diferentes que podem ser usados, separadamente ou combinados, para se obter uma preparação de IgG ou de IgM com grau de elevada pureza. Um desses métodos é a cromatografia de troca iônica e o outro é a filtração em gel. A cromatografia de troca iônica é um dos métodos mais conhecidos para se fazer a separação de proteínas séricas e o isolamento de imunoglobulinas. Esse método se fundamenta no fato de as proteínas apresentarem cargas elétricas e poderem se ligar eletrostaticamente na matriz de troca iônica, a qual possui uma carga oposta à das proteínas. A força de interação com que as proteínas se ligam a esse tipo de matriz de troca iônica depende da densidade de cargas elétricas da proteína bem como do ph e da força iônica do meio onde a proteína se encontra. Dessa forma, para se eluir ( desligar ) as proteínas adsorvidas eletrostaticamente a esse tipo de matriz, deve-se aumentar a força iônica do meio, aumentando-se a concentração dos sais do tampão de eluição, uma vez que os sais adicionados vão competir com as proteínas pelos sítios carregados dessa mesma matriz. Outra forma de se promover a eluição é alterar o ph do tampão de eluição, pois, à medida em que o ph do meio onde se encontra a proteína se aproxima do ponto isoelétrico dessa mesma proteína, a somatória da carga elétrica da mesma se aproxima de zero, de forma que essa proteína perde a capacidade de continuar ligada à matriz de troca iônica. Há dois tipos básicos de matrizes de troca iônica: uma delas é recomendada para a interação com proteínas carregadas positivamente, sendo a matriz trocadora de cátions, como é o caso do carboxi-metil-celulose (CM-celulose), enquanto que o outro tipo é recomendado para a interação com proteínas carregada negativamente, sendo a matriz trocadora de ânions, como o dietil-amino-etil-celulose (DEAE-celulose). No caso de se fazer a separação de IgG, a resina ou matriz recomendada é DEAE-celulose. O método mais indicado para se conseguir um melhor grau de pureza e de rendimento da fração IgG é se fazer primeiramente a precipitação da fração gama-globulina de um soro sanguíneo com sulfato de amônio ou sulfato de sódio, tal como foi feito na aula anterior. Essa fração gama globulina depois de dialisada para se eliminar o excesso de sais usados na precipitação, depois de ter a sua concentração protéica determinada, é colocada em uma coluna previamente montada de DEAE celulose.

19 Método para preparação da coluna dedeae celulose para a separação de Ig G Materiais DEAE celulose previamente embebido e carregado por tratamento com soluções de ácido (HCl) em seguida álcali (NaOH) Fração gamaglobulina previamente precipitada com sulfato de amônio e dialisada com o mesmo tampão de eluição a ser usado na coluna de DEAE celulose. A concentração protéica dessa coluna deve ser previamente determinada Coluna cromatográfica pequena (seringa de 10ml) já montada e preparada para ser preenchida com DEAE-celulose e acompanhada de cânulas de pequenas pinças para regulagem do fluxo da coluna Tampão fosfato 0,01M ph 8, Frascos pequenos de coleta (frascos do tipo penicilina), rotulados com a numeração de 1 a Método Deixe o volume de tampão imediatamente acima da coluna abaixar abrindo cuidadosamente a coluna, e aproveite para regular o fluxo da coluna para 12 gotas por minuto. Quando não houver mais tampão acima da resina e com a coluna fechada, deve ser adicionada a solução de gama globulina, com muito cuidado e com o auxílio da micropipeta. Em seguida, abrir vagarosamente a coluna para deixar o solução de gama globulina entrar na resina, fechando a coluna quando isso ocorrer. Adicionar, a seguir, com muito cuidado, um volume de tampão de eluição. Conectar com o frasco de tampão com cânula e sifonado de modo a permitir um fluxo continuado de tampão para a coluna de resina. Abrir o fluxo da coluna, começar a colher as frações de 3 ml cada uma, aferindo o fluxo novamente para 12 gotas por minuto Faça a leitura das frações colhidas em espectrofotômetro UV, no comprimento de onda de 280nm, contra um branco de tampão fosfato 0,005M ph 8, Faça um pool das frações com maior concentração proteíca e armazene a -20ºC para ser testada na próxima aula, por imunoeletroforese.

20 19 Gama-Globulina 12 gotas/min Assunto 04- figura 01 Figura 13 3ml PERGUNTAS 1.- Qual o fundamento do processo de purificação de IgG por cromatografia de troca iônica? 2.- A obtenção de IgG em alto grau de pureza poderia contribuir em quais aspectos ou em que técnicas? 3.- Que outros métodos são também indicados para a separação de imunoglobulinas em elevado grau de pureza? 4.- Para a separação de IgG é indicado o uso de coluna cromatográfica trocadora de ânions (DEAE-celulose). No caso da necessidade de separar uma proteína com cargas opostas a da IgG, qual resina seria então recomendada?

21 20 REAÇÃO QUANTITATIVA DE SOROPRECIPITAÇÃO Uma das primeiras observações da interação antígeno-anticorpo (Ag-Ac) é a formação de precipitados que aparecem em um tubo de reação em meio líquido depois que tais reagentes tenham-se combinado em determinadas proporções relativas. A reação quantitativa de soro-precipitação se fundamenta nesse fato. Este teste se constituiu com base de todos os estudos que foram feitos sobre os fenômenos decorrentes da interação Ag-Ac. Nesse tipo de reação, via de regra, quantidades crescentes de Ags são adicionadas a diferentes tubos de ensaio apropriados contendo uma concentração constante de Ac e, ao final, são determinadas as concentrações do precipitado Ag-Ac formado em cada tubo da reação. Nesse experimento, você determinará: a-) A concentração de Acs de um soro teste b-) O número de determinantes antigênicos (sítios que ligam os anticorpos) presentes em uma molécula de Ag. Materiais: Soro de Coelho anti-bsa com um título desconhecido (concentração) - fonte de Acs. Soro Albumina Bovina (4mg/ml) - o Ag. Salina tamponada com fosfatos (PBS) ph 7,2. NaOH 0,1M. 8 tubos de ensaio para precipitação. Micropipetadores de volume ajustável de 1000, 100 e 10 l. Banho-Maria Geladeira Espectrofotômetro UV e cuvetas de quartzo para UV. Metodologia: Marque cada um dos tubos de uma série de 6 com o volume de Ag que será a ele adicionado. Adicone os seguintes volumes de Ag em cada tubo: 0, 5, 20, 35, 50, 100 l. Adicione PBS a cada tubo para completar um volume de 300 l. Adicione 100µl de antissoro a cada tubo e misture bem.

22 21 Incube por 1h a 37ºC em Banho-Maria e a seguir a 4ºC em geladeira por 1h. Centrifugue os tubos testes a 4000 (2000g) rpm/10 min. Remova o sobrenadante e transfira-o para um outro tubo devidamente identificado como estava o tubo inicial. Conserve o precipitado (pellet). Para calcular a concentração de Ac no antissoro: Lave o precipitado, ressuspendendo-o em PBS e re-centrifugando a 4000 (2000g) rpm/10 min. Remova o PBS do sobrenadante e descarte-o. Ressuspenda o pellet colocando cada um dos tubos em um vórtex. Adicione 1ml de NaOH 0,1M a cada precipitado e leve para solubilizar no vórtex e conserve mais 1ml de NaOH 0,1M para servir como branco no espectrofotômetro. Faça a leitura da absorbância no comprimento de onda de 280nm (A 280 ) em um espectrofotômetro UV. Calcule a quantidade de Acs específicos contra BSA/ml de antissoro: A partir do gráfico, anote a quantidade de antígeno no ponto de equivalência, (o ponto onde a quantidade máxima de precipitado se forma). Vide o exemplo abaixo: a) A 280 = 0,100 0 l de Ag. b) A 280 = 0,370 5 l de Ag. c) A 280 = 0, l de Ag. d) A 280 = 1,08 35 l de Ag***. e) A 280 = 0, l de Ag. f) A 280 = 0, l de Ag. Quantidade de Ag usado = 0,035ml (= 35 l) x 4 (mg/ml BSA) = 0,140mg. Transformar essa quantidade de antígeno em A 280nm, considerando que 1,9mg/ml de BSA dá um A 280nm = 1,0, então (0,140 x 1)/1,9= 0,073. Subtraia este valor da A 280nm total do precipitado para obter a A 280 da concentração de Ac: A 280 / Ac = A 280(ppt) - A 280(Ag). 1,08 0,073 = 1,007 Transformar essa A 280nm em quantidade de anticorpo, isto é IgG (mg/ml), considerando que 0,7 mg de IgG corresponde a uma A 280 = 1,0, você pode calcular

23 22 a concentração de Acs no ponto de equivalência (não se esqueça de levar em conta todas as diluições que foram feitas): A 280 (Ac) = 1,08 (= A 280(pptado. ) - 0,073 (=A 280(Ag ) = 1,007. 1,007 x 0,7 (mg IgG=A 280 1,0) = 0,705mg. 100µl de antissoro foram usados em cada tubo, portanto a concentração de anticorpos no soro original é 0,705 x 10= 7,05mg/ml. Estimativa do Número de Determinantes Antigênicos na Molécula de Soroalbumina Bovina: O número de determinantes antigênicos em cada molécula de Ag pode ser estimado quando se considera que em uma condição de extremo excesso de anticorpos todo determinante antigênico vai estar ligado com pelo menos uma molécula individual de Ac. Se a quantidade de Ac no precipitado formado sob essas circunstâncias é calculada, então os números relativos de moléculas de Ac e Ag podem ser calculados, isto é: Concentração de Ag : P.M. Ag Concentração de Ac P.M. Ac Em soros hiperimunes a maior parte dos Acs são do isótipo IgG que tem P.M de cerca de D. O Ag, BSA, apresenta um P.M. de A relação entre as concentrações molares de Ac para a molécula de Ag na sua menor concentração de Ag fornecerá uma estimativa do número de determinantes antigênicos presentes em uma determinada molécula de Ag. Concentração de Ag : Concentração de Ac P.M. Ag P.M. Ac = 0,14 : 0, ,058 Moles BSA : 4,693 Moles IgG Razão = 1 : 2,28, ou aproximadamente 1 : 2 Portanto há 2 sítios ligantes na molécula de Ag (BSA), considerando um erro experimental de aproximação de 2,28 para 2.

24 23 PERGUNTAS 1.- Como os Ags e Acs interagem? 2.- Responda verdadeiro (V) ou falso (F): a) A maioria dos Acs reage com estruturas topográficas que dependem da conformação nativa da molécula do Ag (epítopos conformacionais) ( ) b) Ags e Acs interagem através de ligações covalentes. ( ) c) Cada determinante antigênico em uma molécula de Ag representa um agrupamento de epítopos dominantes. ( ) d) As forças de ligação que mantém ligado um Ag a um Ac são inversamente proporcionais à distância entre essas moléculas. ( ) e) A especificidade do reconhecimento do Ac para o Ag é absoluta. ( )

25 24 CARACTERIZAÇÃO DA FRAÇÃO GAMA-GLOBULINA PRECIPITADA POR IMUNOELETROFORESE. 1) REAÇÃO DE DE IMUNOELETROFORESE DE FRAÇÃO PURIFICADA DE ANTICORPOS 1.1. Introdução e Generalidades A imunoeletroforese é a combinação de eletroforese e de dupla difusão em gel de ágar; é uma técnica que permite a discriminação de substâncias com base na carga elétrica, peso molecular, tamanho, forma, concentração e propriedades antigênicas. O método original de Grabar e William (l953-54) é feito em gel de ágar, procedendo-se na primeira etapa à separação eletroforética dos componentes e, a seguir, cada componente se difunde, a partir de seu centro de difusão, contra o imune-soro, formando, como na dupla imunodifusão, uma linha ou arco de precipitação. Somente na eletroforese teríamos: + - Posição do soro antes da eletroforese + - Posição do soro após a eletroforese Centro Gama- Globulina Albumina Alfa Beta Gama Figura 15

26 25 Assim, este método permite a caracterização de uma substância simultaneamente por 3 parâmetros: a) Características eletroforéticas (mobilidade em campo elétrico) b) Velocidade de difusão (coeficiente de Difusão) c) Especificidade imunoquímica (estrutura e composição dos determinantes antigênicos). Este método é atualmente aplicado a todos os ramos da pesquisa biológica, por seu alto poder resolutivo, bastando mencionar que, enquanto a eletroforese permite a evidenciação de 5 a 6 componentes no soro sanguíneo, a imunoeletroforese permite distinguir cerca de 30 componentes. Não se trata de maior sensibilidade, mas de maior poder discriminativo. No micro-método são aplicados 2 a 5ul de soro sanguíneo ou de mistura protéica no orifício do gel. Ao se passar a corrente elétrica, o soro se separa nos 5 componentes clásicos da eletroforese de Tiselius: Albumina, Alfa-l, Alfa-2, Beta e Gama-globulinas de acordo com suas cargas elétricas. Em função de seus coeficientes de difusão e da concentração, cada componente difunde-se encontrando o Ac que lhe corresponde, forma-se um precipitado em forma de arco de maior ou menor curvatura dependendo da dispersão dos Ags e cuja intensidade é função da concentração do Ag e também da relação Ag/Ac Material a) Solução de Bacto Ágar (Difco) a 1% em tampão Tris-Acetato ph 8,2 e força iônica = 0,06; b) Lâminas de Microscopia; c) Pipetas de 5ml; d) Micropipetadores e ponteiras para 10ul e 50ul; e) Molde perfurador para imunoeletroforese; f) Bomba de vácuo aplicada com kitassato, cânulas e pipetas Pasteur; g) Placa de Preti com gaze umidecida e suportes para lâminas (Câmara úmida); h) Tampão tris-acetato ph 8,2 e força iônica de 0,113; i) Fonte e cuba para eletroforese; j) Antissoros anti-proteínas totais séricas de bovinos e de cobaias; l) Tiras de papel de filtro; m) "Cotonete" com gaze;

27 Técnica a) Fundir o ágar em água fervente; b) Aplicar com um cotonete sobre a lâmina uma camada de ágar, esperar secar; c) Colocar, com pipeta, 2ml de ágar sobre as lâminas previamente revestidas com ágar e tomar cuidado para não formar bolhas nem deformidades, esperar esfriar e solidificar; d) Com o molde perfurador adequado, fazer os orifícios no gel e, em seguida, retirar os fragmentos de ágar com a trompa de vácuo; (figura 03) e) Cortar tiras de papel de filtro da largura da lâmina para fazer a ponte entre o tampão e as lâminas; f) Montar dentro da cuba, previamente preenchida com tampão, as lâminas, fazendo as pontes entre os polos de cuba com tiras de filtro; g) Aplicar em cada cavidade do ágar de 5 a 10ul da amostra a ser submetida à eletroforese; h) Fechar a cuba, ligar a fonte e regular a corrente para 6ml/lâmina, o que dá cerca de 50v/lâmina. Deixar a corrida prosseguir por 2h; (figura 04) i) Desligar a fonte e retirar as lâminas. Em seguida, remover, com o auxílio da tampa de vácuo, a canaleta de gel e adicionar dentro da canaleta o antissoro específico; j) Levar as lâminas, com cuidado, para a câmara úmida e fazer a leitura horas depois; Soro Total Bovino IgG Bovina Figura 16

28 27 Tampão de Corrida Papel Assunto 05- figura V Fonte de Energia IgG Soro anti soro bovino Soro Total Bovino Albumina alfa beta Figura 17 Gama IgG Bovina PERGUNTAS 1) Como podemos identificar imunologicamente a fração gama-globulina precipitada e da IgG purificada por cromatografia de troca iônica? 2) Quais os princípios da prova de imunodifusão dupla em gel de ágar e qual a sua utilidade dentro da imunologia e, nesse caso, em particular? 3) Quais os princípios da prova de imunoeletroforese e qual a sua principal utilidade dentro da imunologia e, nesse caso, em particular? 4) Qual dessas 2 técnicas (Imunodifusão dupla em gel de ágar e Imunoeletroforese) fornece respostas mais completas e esclarecedoras, a respeito das características imunoquímicas de uma mistura antigênica?

29 28 IMUNOHEMÓLISE - Experiência de Erlich Morgenroth Modificada I. OBJETIVOS Demonstrar os elementos que participam da reação de imunohemólise de hemácias de carneiro: (figura 01) (Ag) Antígeno - Hemácias de carneiro (E) (Ac) Anticorpos - Hemolisina de coelho anti-e (C) Complemento - Soro normal de cobaia C Ac Ag Figura 18 II. MATERIAL l) Estante para tubo de hemólise (l2x75mm) 2) 3 tubos de ensaio l2x75mm 3) 4 pipetas de lml com graduação centesimal 4) Suspensão de hemácias de carneiro a 5% 5) Hemolisina (já diluída) 6) Complemento (soro normal de cobaio) já titulado 7) Solução fisiológica III. TÉCNICA l) Numerar os tubos l, 2 e 3 2) Pipetar 0,lml de suspensões de hemácias nos 3 tubos 3) Pipetar 0,lml de hemolisina nos tubos l e 2 4) Pipetar 0,5ml de complemento nos tubos l e 3 5) Pipetar solução fisiológica: (figura 02)

30 29-0,8ml no tubo l - l,3ml no tubo 2-0,9ml no tubo 3 6) Incubar em B.M. a 37ºC por 30 minutos Solução Tampão Complemento Hemolisina Hemácia s 0,8ml 0,5ml 0,1ml 0,1ml 1,3ml 0,1ml 0,1ml ,9ml 0,5ml 0,1ml Figura 19 IV - RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO (figura 03) Uma vez realizada a leitura da experiência procedente, prosseguir do seguinte modo: 7) Centrifugar os tubos 2 e 3 8) Abandonar o sobrenadante do tubo 2 9) Decantar o sobrenadante do tubo 3 sobre as hemácias do tubo 2 e agitar este tubo para ressuspender as hemácias 10) Sobre o sedimento do tubo 3, colocar hemolisina (0,lml) e solução salina (l,3ml). Agitar para ressuspender as hemácias 11) Incubar os tubos 2 e 3 em B.M. a 37ºC por 30 minutos (figura 04)

31 30 Figura 20 Tubo 1 Figura 21 Tubo 2 Figura 22 Tubo 3 V. RESULTADOS FINAIS E INTERPRETAÇÃO 2 3 Tubo 2 Tubo 3 Figura 23 PERGUNTAS 1) Quais os elementos que participam de uma reação de imunohemólise e qual o papel de cada um deles nessa reação? 2) O que é Sistema Complemento? 3) Em que circunstâncias o Sistema Complemento é ativado na ausência de anticorpos? 4) Explique o que ocorreria com a reação de imunohemólise se o soro normal de cobaia tivesse sido incubado por 30 min a 56ºC?

32 31 TÉCNICA DE IMUNODIFUSÃO DUPLA EM GEL DE AGAR PARA TITULAÇÃO DE SORO ANTI GAMA-GLOBULINA Imunodifusão: Termo utilizado para designar testes sorológicos realizados em meio gelificado, no qual os reagentes só se misturam por difusão. Este teste foi introduzido para substituir o teste de precipitação em meio líquido, que tem alguns inconvenientes, por um teste de difusão e precipitação em gel de ágar que tem algumas vantagens. - Difusão simples em uma dimensão - Oudin - Difusão dupla em duas dimensões - Ouchterlony Dupla difusão em gel de ágar: Reação de precipitação entre o Ag e o Ac específico em meio gelificado, onde ambos os reagentes se difundem um contra o outro, formando uma linha ou arco de precipitação (figura 01) na área de reação. Essa técnica permite avaliar com relativa facilidade os "componentes antigênicos" encontrados em misturas complexas. Permite também revelar se duas ou mais substâncias são imunologicamente idênticas ou independentes. Essa prova geralmente é feita sobre lâminas de microscopia ou placas de Petri, revestida com uma camada de gel de ágar em solução fisiológica ou tamponada. Vários fatores influem na velocidade da difusão, entre as quais, o tamanho dos poros de gel, a temperatura, a concentração e pureza do ágar e, os mais importantes, as concentrações das substâncias reagentes e o tamanho e forma molecular dos reagentes. Figura 26 Material

33 32 1) Solução de ágar a l% em solução fisiológica 2) Lâmina de microscopia 3) Pipeta graduada de 5ml 4) Micropipetadores de 10 e 20 ul 5) Solução do Ag (Gama Globulina a lmg de proteína por/ml) 6) Soros de cobaios imunizados com Gama Globulina e adjuvante completo de Freund ou com adjuvante incompleto de Freund ou com Al(OH) 3 mais saponina e com Al(OH) 3 contendo, portanto, Acs anti-gama Globulina. 7) Molde perfurador de ágar 8) Placas de Petri com algodão umidecido (Câmara úmida) 9) l5 tubos de hemólise e estantes 10) Pipetas de lml 11) Solução salina Metodologia: 1) Fundir o ágar em banho-maria de água fervente; 2) Aplicar com cotonete sobre a lâmina uma camada de ágar. Esperar secar; 3) Colocar, com a pipeta, 3ml de ágar sobre as lâminas previamenrte revestidas com cuidado para não formar bolhas, nem deformidades. Esperar esfriar e solidificar. Manter as lâminas em câmara úmida para não dessecar o gel; 4) Com o molde perfurador adequado, fazer os orifícios no gel e, em seguida, retirar os fragmentos de ágar com uma agulha hipodérmica. Manter a lâmina em câmara úmida para evitar o dessecamento do gel; 5) Diluir os soros de cobaio anti-gama globulina a l/2, l/4, l/8, l/l6 e l/32, distribuindo em cada um dos 5 tubos 0,5ml de solução salina e, depois, no lº tubo colocar 0,5ml de soro. Homogeneizar bem e passar 0,5ml para o 2º tubo e assim sucessivamente até o último tubo; 6) Aplicar, usando um micropipetador, 10 ul para cada amostra, Ag, gama globulina (lmg/ml), as diluições do soro de cobaio anti-gama globulina de acordo com o seguinte esquema (figura 02):

34 33 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 0,5ml salina 0,5 ml salina 0,5ml salina 0,5ml salina 0,5ml salina 0,5ml soro 1/32 Soro puro 1/16 Ag 1/2 1/8 1/4 Figura 27 No centro, colocar o Ag (Solução de gamaglobulina na concentração de 1mg/ml), nos poços numerados e periféricos, colocar o soro: no nº lº - soro puro, nº 2 - soro diluído 1/2, n o 3 - diluído1/4, nº 4 diluído 1/8, n o 5 diluído 1/16 e no n o 6 diluído 1/32. (figura 02) 7) Colocar a lâmina dentro de uma placa de Petri com um algodão molhado dentro para manter a umidade; 8) Fazer a leitura após horas, anotando até que diluição houve reação. PERGUNTAS 1) Que tipos de antígenos são revelados pela reação de soroprecipitação? 2) Qual o mecanismo da reação de soroprecipitação? 3) Quais as utilidades do emprego da reação de imunodifusão dupla em gel de Agar, em medicina veterinária? 4) Como se faz para titular anticorpos de um soro precipitante?

35 34 REAÇÃO DE SOROAGLUTINAÇÃO PARA TITULAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI- HEMÁCIAS DE CARNEIRO As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno é constituído por suspensão homogênea de células. Estas células podem ser bactérias, hemácias etc, que normalmente são vistas no microscópio, mas quando aglutinadas, elas formam flocos ou flóculos que são aglomerados visíveis a olho nu. Um dos requisitos essenciais para se proceder a reação de aglutinação é que se possua uma suspensão celular estável. É óbvio, também, que tal reação se verifica somente com antígenos que estão situados na superfície celular. Características dos antígenos e anticorpos envolvidos na reação de soroaglutinação: Antígenos aglutinantes de natureza particulada (insolúveis), como células procariotas e eucariotas. Devem ser, no mínimo, bivalentes. Características dos anticorpos envolvidos na reação de soroaglutinação: Depende da classe isotípica Ig M tem maior atividade aglutinante, enquanto que a Ig G tem menor atividade. Anticorpos devem ser, no mínimo, bivalentes quanto à capacidade de se ligar aos antígenos específicos. Explicação do fenômeno da aglutinação: Duas explicações são mais correntemente aventadas: 1) Revestimento da superfície do antígeno pelo anticorpo o que transformaria a suspensão celular de hidrófila em hidrófoba e daí a aglutinação. (figura 01) Antígenos particulados hidrófilos Perda da camada de solvatação Hidrófobo Agregação - Aglutinação Figura 29

36 35 2) Teoria "das malhas" da qual os aglomerados seriam constituídos de células ligadas entre si pelos anticorpos. (figura 02) Excesso de Anticorpos Excesso de Antígenos Zona de Equivalência Figura 30 Técnicas das reações de aglutinação: As reações de aglutinação podem ser executadas sobre lâminas de microscopia ou placas de vidro, em tubos de ensaio e em microplacas. Elas podem ser: 1) Reações qualitativas. 2) Reações quantitativas. Na aula prática, os alunos terão uma demonstração sobre reação de aglutinação quantitativa feita em placas (micrométodo) usando soros anti-hemácias de carneiro e suspensão antigênica de hemácias de carneiro. Material necessário: 1) Microplacas plásticas para hemaglutinação. 2) Soros de camundongos (imunização feita em aula prática pelos grupos 2, 6, 3 e 7). 3) Suspensão de hemácias de carneiro a 1%. 4) Solução salina (0,l5M). 5) Micropipetadores de 25 ul

37 36 Técnica da Reação: 1) Adicionar um volume de 25ul de diluente (PBS) em todas as cavidades das fileiras A e B da microplaca (0,025ml). 2) Colocar na primeira cavidade da fileira A1 e B1 25ul (0,025ml) do soro positivo de camundongos 3) Com uma micropipeta de 25ul, começar a homogeneizar a primeira cavidade da fileira A, contendo o soro e, sem tocar na superfície ou na borda da placa, transferir 25ul para a segunda cavidade da fileira A2. Novamente homogeneizar bem e, com os mesmos cuidados, transferir 25ul para a terceira cavidade e assim sucessivamente até a 11ª cavidade (A11), pois para a última não será transferida nenhum volume da diluição dos soros e esta cavidade servirá como controle da suspensão antigênica de hemácias. No final, portanto, teremos as seguintes diluições dos soros: l/2, l/4, l/8, l/l6, l/32, l/64, l/l28, l/256, l/5l2, l/l024, l/ ) Repetir a mesma operação para a fileira B. 5) Colocar em todas as cavidades das duas fileiras 25ul (0,025ml) da suspensão de hemácias de carneiro. 6) Agitar com cuidado a placa e incubar por minutos à temperatura ambiente. 7) Fazer a leitura da reação e, comparando os resultados dos soros e fazer a interpretação dos resultados. A /2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 Controle B C D E F Figura 31 PERGUNTAS 1) Quais os mecanismos da reação de soroaglutinação? 2) Que tipos de antígenos participam da reação de soroaglutinação? 3) Qual(is) a(s) utilidade(s) da reação de soroaglutinação, no sorodiagnóstico em medicina veterinária? 4) Como se procede para titular anticorpos de um soro aglutinante?

38 37 MÉTODO INDIRETO DE ELISA PARA DETECÇÃO E TITULAÇÃO DE ANTICORPOS DE COBAIA ANTI-GAMAGLOBULINA BOVINA Trata-se de um método extensivamente usado para detecção e/ou titulação de anticorpos específicos presentes em soros sangüíneos. A especificidade desse ensaio imunoenzimático é direcionada pelo antígeno presente na fase sólida (superfície da microplaca), o qual pode ser uma preparação altamente purificada, ou então preparações semi-purificadas, ou até mesmo brutas. Após adição e incubação do antígeno (Ag), as cavidades da microplaca serão lavadas para eliminar o excesso e os antígenos não ligados à superfície dessas mesmas cavidades. Os soros contendo os anticorpos contra esse Ag podem ser então adicionados, diluindo-os em tampão apropriado que impeça a ligação não específica dos anticorpos a sítios livres presentes na superfície da microplaca, os quais não foram ocupados pelas molécula de Ag. Os soros podem ser adicionados com diluição única, ou com diluição seriada. Após incubação das diluições séricas, as cavidades devem ser novamente lavadas para se eliminar o excesso de anticorpos não ligados. Os anticorpos combinados ao Ag são então detectados após incubação com o conjugado imunoenzimático anti-imunoglobulinas ou anti-ig G da espécie cujos anticorpos se pretende titular. O conjugado deve ser diluído no mesmo tampão em que foram diluídos os soros. Após incubação e lavagem das cavidades da microplaca, é adicionada às cavidades uma solução de substrato imunoenzimático (água oxigenada) e cromógeno (orto-fenilenodiamina), incubando-se a reação para desenvolvimento de cor e, ao final, depois de bloqueada a reação enzimática, devem ser lidas as densidades ópticas (DOs),em leitor de microplacas no comprimento de onda de 490nm. O esquema básico do método indireto do Elisa é o seguinte: Ag + Ac (?) + conjugado I.E. + S leitura de Dos Ag preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina Ac soros-teste de cobaia Conjugado I. E. conjugado de Ig G de coelho anti-ig G de cobaia com peroxidase S substrato Observar esquema abaixo (figura 01):

39 38 Antígeno Soro Antiglobulina Substrato Reação Marcada com enzimático de cor enzima Lavagem Lavagem Lavagem Antiglobulina marcada com enzima Substrato Enzimático Anticorpo Bloqueador Antígeno Figura 34 Material Preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina Soros-teste de cobaias imunizadas anteriormente com antígeno citado + adjuvantes distintos (ACF Adjuvante Completo de Freund; AIF Adjuvante Incompleto de Freund; Al(OH) 3 Hidróxido de alumínio) Conjugado de Ig G de coelho anti-ig G de cobaia com peroxidase (enzima) Peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 água oxigenada) a 3% (substrato) Orto-Fenileno-Diamina OPD (cromógeno) Microplacas para Elisa Tampão Carbonato-Bicarbonato ph 9,6 a 0,05M Tampão PBS ph 7,4 Tampão PBST ph 7,4 + 10% de LPD (Leite em Pó Desnatado) Solução de HCl concentrado 2N

40 39 Procedimento 1. Adicionar volumes de 50 L da solução antigênica em sua diluição ideal de uso (1 g/ml) preparada em Tampão Carbonato-Bicarbonato (1:12500). Incubar a reação overnight, em geladeira. Ao final, lavar as cavidades da microplaca 4 5 vezes com PBS. 2. Bloquear as cavidades da microplaca através da adição de LPD a 10% em TCB, incubar a reação por 45 minutos a 37 º C. Ao final, lavar a microplaca como no item anterior. 3. Adicionar as diluições das amostras de soros-teste preparadas em tampão PBST + LPD. Incubar a reação por 60 minutos a 37 º C. Ao final, lavar novamente, conforme já descrito. 4. Adicionar o conjugado em sua diluição ideal de uso (1:2000) preparada em tampão PBST + LPD. Incubar por mais 60 minutos a 37 º C. Ao final, lavar novamente. 5. Adicionar a solução de substrato (H 2 O 2 ) + OPD. Incubar, sob proteção da luz, por 15 minutos e, então, bloquear a reação com HCl. 6. Fazer a leitura (figura 02) das DOs. Determinar a DO média dos controles para obtenção dos títulos de Acs presentes nos soros /100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/ / / / ACF A B AIF AlOH Sem Adjuvante C D E F G H Figura 35

41 40 PERGUNTAS 1) Em que se baseia e quais são os mecanismos / passos principais da reação imunoenzimática de ELISA? 2) Que tipos de antígenos e anticorpos participam da reação imunoenzimática de ELISA? 3) Qual(is) a(s) utilidade(s) do teste de ELISA, no sorodiagnóstico em medicina veterinária? 4) Como se procede para titular anticorpos de um soro no teste de ELISA?

42 41 SDS-PAGE e Western blotting Técnicas de SDS-PAGE e de Western-Blotting Soro normal de bovino, gamaglobulina bovina e IgG bovina 1. Preparo do gel (gel a 12%) No preparo do gel, são feitos dois géis, um para ser corado com Comassie blue e outro para ser transferido para a membrana de PVDF, na quais era feito o western blotting. Obs: Um gel é o espelho do outro. Gel de separação Separating gel buffer (ph8,8) 4 ml Acrilamida-bisacrilamida 3,2 ml Gel de empilhamento Stacking gel buffer (ph6,0) 3 ml Acrilamida-bisacrilamida 0,5 ml Água MilliQ 0,8 ml Persulfato de amônio 10% - 80 µl Persulfato de amômio 10% µl TEMED 8 µl TEMED 12 µl Preparo da amostra 60 µl da amostra (proteína a ser testada) (soro normal bovino, gamaglobulina bovina e IgG bovina) 20 µl tampão da amostra 4X 8 µl de ß-mercaptoetanol Ferver por 2 minutos e aplicar no gel 30µg de proteína a ser testada. 2. Eletroforese do gel de poliacrilamida A corrida é feita em média por 2 horas a 100 V, logo após este período um dos géis é corado com Comassie blue e o outro é tranferido para a membrana. 3. Transferência para a membrana Tampão de transferência 100 ml de CAPS 10X 100 ml de metanol 800 ml de Água MilliQ Cortar 2 papéis Watmann de 3mm nas seguintes medidas: 10X7cm

43 42 Cortar a membrana de PVDF: 9X6cm Para a transferência deve-se montar um sanduíche onde todos os materiais envolvidos (papel Watmann, esponjas, cassete de transferência, membrana de PVDF) devem ser embebidos no tampão de transferência. O sanduíche deve obedecer a seguinte seqüência: - placa preta, - esponja, - papel watmann, - gel, - membrana de PVDF, - papel watmann, - esponja, - placa branca Após a montagem do sanduíche este é colocado no cassete de transferência, e esta é feita por 45 minutos, a 4ºC, a 90V. 1. Western blotting Após a transferência das proteínas do gel para a membrana de PVDF, segue-se o western blotting: 1. Retirar a membrana e colocar Ponceau sob agitação para detectar a transferência. 2. Lavar com água MilliQ sob agitação, para retirar o Ponceau 3. Bloquear a membrana com PBS-T + 2% BSA (0,5g de BSA + 10 ml de PBS- T), incubar por 2 horas sob agitação. 4. Adicionar o conjugado anti-igg bovina, na diluição de 1:1000 (10 µl do conjugado anti-igg bovina + 5 ml de PBS-T), incubar por 1 hora sob agitação. 5. Lavar a membrana 4X com PBS-T por 5 minutos 6. Lavar a membrana 1X com PBS por 10 minutos 7. Diluir 3 comprimidos de DAB e 3 comprimidos de uréia em 3 ml de água MilliQ, sob agitação. Adicionar esta solução a membrana, esperar alguns minutos até que apareça algum sinal, no máximo 5 minutos, e após este período bloquear a reação com água MilliQ. 2. Coloração do gel de poliacrilamida - Retirar o gel da cuba e depois do suporte com a ajuda dos espaçadores. Cortar o gel de empilhamento. - Mergulhar o gel na solução descorante-corante sob agitação por 5 minutos. - Passar para a solução corante (Comassie Blue) sob agitação por 15 minutos. - Transferir para a solução descorante. Deixar por 3 horas, trocando a solução quando esta estiver saturada. PERGUNTAS 1) Em que se baseia e quais são os passos principais das técnicas de poliacrilamida gel-eletroforese (PAGE) e de Western-blotting (W.B.)? 2) Que tipos de antígenos e anticorpos participam da técnica de Western-blotting? 3) Qual(is) a(s) utilidade(s) das técnicas de PAGE e de W.B., no sorodiagnóstico em medicina veterinária? 4) Como se procede para caracterizar um antígeno proteico pelas técnicas de PAGE e de W.B.?

44 43 TESTES RÁPIDOS DE SORODIAGNÓSTICO TESTES IMUNOCROMATOGRÁFICOS A ampliação do acesso ao diagnóstico é um desafio aos programas de saúde humana e veterinária. Os testes laboratoriais convencionais de sorodiagnóstico são operacionalmente complexos, requerem profissionais especializados e infraestrutura laboratorial apropriada. Além disso, o prazo para entrega dos resultados desses testes pode ser longo, levando o indivíduo a se desinteressar pelo resultado do teste e à consequente perda deste pelo sistema de saúde, ou não atender a demanda por decisões mais rápidas para o estabelecimento de procedimentos terapêuticos e, principalmente, medidas mais efetivas de controle. No início da década de 1990, uma nova estratégia diagnóstica surgiu. Chegaram ao mercado, os testes rápidos. Com o avanço das tecnologias de desenvolvimento e produção, esses testes revelaram-se eficientes na investigação de doenças infectocontagiosas. Desde 2005, a utilização dos testes rápidos permite atender à crescente demanda pelo diagnóstico de agravos relevantes à saúde publica, visto que sua utilização aumenta a agilidade da resposta aos indivíduos e permite seu rápido encaminhamento para assistência médica e início de tratamento. Testes rápidos são aqueles cuja execução, leitura e interpretação dos resultados são feitas em, no máximo, 30 minutos. Além disso, são de fácil execução e não necessitam de estrutura laboratorial. Testes rápidos são, primariamente, recomendados para exames presenciais de sorodiagnóstico. Podem ser feitos com amostra de sangue total obtida por punção venosa ou da polpa digital, ou com amostras de fluido oral. Dependendo do fabricante, podem também ser realizados com soro e (ou) plasma. A execução dos testes rápidos, habitualmente, é muito simples e a capacitação de pessoal pode ser realizada presencialmente, ou por meio de ensino a distância. A primeira vantagem significativa dos testes rápidos é que eles possibilitam a liberação dos resultados e a tomada de decisões sobre o diagnóstico em uma única ocasião em que se obtém amostras de um paciente ou de um indivíduo suspeito de ter sido acometido por uma doença infecciosa. Os testes rápidos não necessitam de estruturas laboratoriais ou de profissionais graduados para sua execução, assim como dispensam o transporte de amostras e a necessidade de coleta de sangue venoso. Além disso, a aplicação de testes rápidos auxilia na prevenção da transmissão vertical de agentes infecciosos, facilita o diagnóstico em populações-chave. Esses testes, que podem ser realizados durante atendimento ou consulta em qualquer local, aumentam a probabilidade de solucionar os diagnósticos de doenças infecciosas aos indivíduos acometidos e também podem fornecer dados importantes sobre a situação imunológica desses indivíduos. Dentre os testes rápidos de sorodiagnóstico destaca-se a técnica de testes imunocromatográficos, que é uma metodologia de detecção baseada na utilização de tiras de um material de suporte (nitrocelulose) impregnadas com reagentes dessecados / liofilizados (anticorpos ou antígenos conjugados a partículas coloridas constituídas por ouro ou prata coloidais) que são ativadas, interagem com os analitos das amostras testes e migram por

45 44 cromatografia pelos microcanais da membrana do suporte após a aplicação de amostras testes fluidas, revelando ao final resultados em locais do suporte sólido nos quais estão imobilizados anticorpos de captura para cada sistema ou alvo do analito que se busca detectar. Aplicações desta metodologia incluem testes para detecção de patógenos e/ou de seus anticorpos específicos, drogas, hormônios e metabolitos presentes em amostras médicas, veterinárias, alimentos, e de análises ambientais e outros. Como funciona para a detecção de anticorpos anti-antígenos específicos? 1. A amostra de soro teste é colocada no local indicado, na membrana (área A). 2. A solução tampão é colocada sobre a amostra. 3. Os anticorpos da amostra fluem lateralmente pela membrana, passando pela área I, onde se inicia a ligação com o conjugado e prosseguem em direção à área de teste (T). 4. Na área T, o complexo anticorpo-conjugado liga-se aos antígenos do agente infeccioso investigado que está imobilizado em uma linha da membrana do suporte, formando uma linha (ou banda) colorida. 5. O conjugado não ligado ao anticorpo e o excesso do complexo imune continuam a migração, ao longo da membrana de nitrocelulose, em direção à área C, onde são capturados por anticorpos anti-imunoglobulina, formando outra linha (ou banda) colorida. Detecção de Ag do vírus da cinomose pelo teste imunocromatográfico:- Amostra: mucosa nasal, conjuntiva, saliva, urina, soro e plasma; Kit: diluente, swab esterilizado, conta-gotas (pipeta) e dispositivo teste; Materiais necessários não fornecidos: solução salina e cronômetro. Quando o teste começar a reagir, deve-se observar uma cor rosa se movendo através da janela de resultado no centro do dispositivo de teste. Se esta não for visualizada após 1 minuto, adicionar mais uma gota da amostra + diluente no orifício; Interpretar o resultado do teste entre 5 e 10 minutos. Não interpretar o resultado em um tempo superior a 12 minutos.

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