UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Ehrlichia canis DE CÃES DE BELÉM, PARÁ CLAUDIA PINHEIRO RUFINO RABÊLO Belém- Pará 2013

2 CLAUDIA PINHEIRO RUFINO RABÊLO DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Ehrlichia canis DE CÃES DE BELÉM, PARÁ Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves Co-orientador: Prof. Dr. Andre Marcelo Conceição Meneses Belém- Pará 2013

3 CLAUDIA PINHEIRO RUFINO RABÊLO DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Ehrlichia canis DE CÃES DE BELÉM, PARÁ Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Co-orientador: Banca Examinadora: Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves Instituto de Ciências Biológicas, UFPA Prof. Dr. Andre Marcelo Conceição Meneses Universidade Federal do Pará Prof. Dr. Eduardo José Melo dos Santos Instituto de Ciências Biológicas, UFPA Profa. Dra. Elane Guerreiro Giese Instituto de Saúde e Produção Animal, UFRA Prof. Dr. Gustavo Góes Cavalcante Instituto de Medicina Veterinária, UFPA Prof. Dr. Raimundo Nonato Moraes Benigno (Suplente) Instituto de Saúde e Produção Animal, UFRA Belém, 01 de abril de 2013

4 Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes. (Martin Luther King)

5 Ao meu marido Ival e filhos Ivy, Smir Neto, Apollo e Príon, por todo amor e companheirismo ao longo da minha jornada em busca do aperfeiçoamento profissional.

6 AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar agradeço a Deus, por sempre ter guiado meus passos no caminho certo, me amparando nos momentos mais difíceis. Aos meus avós e anjos da guarda, Maria Clara e Alfredo Pinheiro, os verdadeiros responsáveis por todas as minhas vitórias. Ao meu marido Ival, por todo o amor, por realizar todos os meus sonhos e, principalmente, por ser o meu maior incentivador. Aos meus pais Claudio e Sílvia, pelo amor e dedicação, aos meus irmãos Meg, Gabriela, Ivy e Beto, pelo companheirismo de sempre e a toda a minha família, por todo o apoio, incentivo e compreensão. Ao meu orientador Evonnildo Gonçalves, por ter acreditado em mim quando ninguém mais acreditou e ter me acolhido como uma filha. Agradeço pelos ensinamentos de biologia molecular e genética, mas também pelos ensinamentos de ética, profissionalismo e, principalmente, de como fazer tudo ao mesmo tempo com excelência. Obrigada por ser um pai amoroso na maioria das vezes e por ser um pai brigão quando precisou ser. Todos os puxões de orelha vão servir pra que eu me torne uma pessoa melhor e uma profissional exemplar, assim, que nem o senhor. Ao meu co-orientador Andre Meneses, por disponibilizar o material para o desenvolvimento da minha pesquisa ( perfeito! ). Ao Dr. Manuel Ayres, pela hospitalidade, gentileza, conhecimentos repassados e por uma análise estatística para ninguém colocar defeito. Às amigas biólogas Soraya Andrade e Silvanira Barbosa, pela amizade, por toda ajuda no processamento das amostras e ensinamentos de técnicas moleculares. Aos professores e amigos do Laboratório de Tecnologia Biomolecular Délia, Pablo, Thaís, Ruan, Elton, Fábio, Rafaela, Laíse, Marcela, Sanclayver, Bruno, Andrei, Jonathan, Michele, Cássia, Tássia e Leopoldo, por toda ajuda e companheirismo ao longo desses dois anos. Em especial ao professor John, pelos constantes ensinamentos e pelo abstract impecável. Aos médicos veterinários e funcionários do HOVET UFRA pela ajuda nas coletas das amostras. À Universidade Federal do Pará, ao Programa de Pós Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários (PPGBAIP) e à coordenação deste, pela oportunidade de ingresso em um dos cursos de pós graduação mais conceituados no Brasil.

7 Aos professores do PPGBAIP pelas aulas ministradas e pelos valiosos conhecimentos compartilhados. A CAPES pelo suporte financeiro ao longo desses 24 meses de pesquisa. Ao Dr. Márcio Nunes do Instituto Evandro chagas pelo apoio nas análises de sequenciamento de DNA. Aos membros da banca de qualificação Dr. Cláudio Mafra e Dra. Cláudia Portes e aos da banca de defesa Dr. Eduardo José Melo dos Santos, Dra. Elane Guerreiro Giese e Dr. Gustavo Góes Cavalcante pelas valorosas contribuições. Ao meu grupo de estudo Fabrício, Guto, Marcos, Kleber e Poliana. Sem vocês nada disso estaria acontecendo agora. Aos meus filhos de quatro patas Ivy, Smir Neto, Apollo e Príon, pelo amor incondicional que só um animal sabe dar.

8 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO HEMOPARASITOSES ANIMAIS ERLIQUIOSE CANINA Taxonomia e histórico Vetores Ciclo biológico Sinais clínicos e laboratoriais Prevalência Diagnóstico, prevenção e tratamento OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAL E MÉTODOS AMOSTRAGEM ANÁLISES MOLECULARES ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS DETECÇÃO E DIVERSIDADE NUCLEOTÍDICA CORRELAÇÃO COM IDADE, SEXO E PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DISCUSSÃO DETECÇÃO E FREQUÊNCIA DE PREVALÊNCIA DO DNA DE EHRLICHIA CANIS EM BELÉM, PARÁ IDENTIFICAÇÃO DA ESPÉCIE DE EHRLICHIA EM BELÉM, PARÁ CORRELAÇÃO DE INFECÇÃO POR EHRLICHIA CANIS COM VARIÁVEIS HEMATOLÓGICAS E EPIDEMIOLÓGICAS CONCLUSÕES REFERÊNCIAS... 35

9 LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figura 1 - Mórula de Ehrlichia spp. em neutrófilo canino Figura 2 - Carrapato Rhipicephalus sanguineus Figura 3 - Ocorrência de infecção por E. canis em cães no Brasil Figura 4 - Detecção de E. canis através de nested PCR, em amostras de sangue total de cães atendidos no período de julho a agosto de 2011 na rotina do Hospital Veterinário (HOVET) da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA). Linhas 2 a 8 correspondem à primeira reação da PCR, enquanto as linhas 10 a 16 à segunda reação da PCR; Linhas: 1 e 9 correspondem ao Ladder 100 pb (O GeneRuler); 2 e 10: controles positivos (Amostra de DNA obtida de cão parasitado por E. canis); Linhas 8 e 16: controles negativos (sem amostra de DNA). As setas correspondem ao fragmento de 500 pb do ladder Tabela 1 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas por esfregaço sanguíneo no Brasil. Os números entre parênteses correspondem ao tamanho amostral Tabela 2 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas por testes de ELISA no Brasil. Números entre parênteses correspondem ao tamanho amostral Tabela 3 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas por Reação de Imunofluorescência Indireta no Brasil. Números entre parênteses correspondem ao tamanho amostral Tabela 4 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas por testes moleculares no Brasil. Números entre parênteses correspondem ao tamanho amostral Tabela 5 - Identidade nucleotídica par a par do rdna 16S de Ehrlichia canis de Belém, Pará e 14 outras cepas de E. canis distribuídas mundialmente Tabela 6 Polimorfismo do rdna 16S de Ehrlichia canis de Belém, Pará em comparação a 14 outras cepas de E. canis distribuídas mundialmente Tabela 7 - Associação entre achados hematológicos e resultados da reação em cadeia da polimerase (PCR), em cães atendidos no período de julho a agosto de 2011 na rotina do Hospital Veterinário (HOVET) da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA) Tabela 8 - Frequência de cães positivos pela reação em cadeia da polimerase (PCR) para Ehrlichia canis, segundo faixa etária e sexo, em cães atendidos no período de julho a agosto de 2011 na rotina do Hospital Veterinário (HOVET) da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA)... 30

10 RESUMO As hemoparasitoses são doenças causadas por patógenos transmitidos por vetores hematófagos. Estas se caracterizam por serem enfermidades de grande importância na Medicina Veterinária, uma vez que acometem várias espécies animais como cães e gatos. Dentre os hemoparasitos, a Ehrlichia canis é a espécie mais patogênica e o principal bioagente causador da Erliquiose Monocítica Canina EMC. Assim, objetivando detectar e caracterizar molecularmente as cepas do hemoparasito Ehrlichia spp. circulantes na região metropolitana de Belém, Pará, foram analisadas, neste trabalho, 200 amostras de sangue total de cães atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal Rural da Amazônia (HOVET/UFRA) durante o período de julho a outubro de Estas amostras foram escolhidas aleatoriamente, não necessariamente envolvendo animais com sintomatologia para Erliquiose Monocítica Canina - EMC. O diagnóstico de EMC foi feito através de um protocolo de nested PCR, o qual resultou em uma frequência de 24% (48/200) de positividade para os animais analisados, corroborando a frequência de EMC em estudos realizados em Belo Horizonte, Nanuque e Londrina. O sequenciamento do rdna 16S destas amostras positivas sugere a exclusividade de Ehrlichia canis como o agente causador de EMC em Belém, Pará. Adicionalmente, a comparação destas sequências com outras sequências do rdna 16S de E. canis disponíveis no GenBank, apresentaram de 99,5 a 100% de identidade, reforçando dados da literatura que sugerem a baixa variabilidade genética deste biogente. A despeito das análises epidemiológicas e hematológicas, assim como para a idade e sexo dos animais, não foram observadas correlações estatisticamente significativas entre a presença de E. canis e parâmetros como anemia, trombocitopenia, leucopenia e leucocitose, sugerindo que estes não são adequados para o diagnóstico diferencial de EMC. Palavras chave: Erliquiose Monocítica Canina, Ehrlichia canis, diagnóstico molecular, Belém, Amazônia.

11 ABSTRACT Haemoparasitoses are diseases that are caused by pathogens transmitted by haematophagous vectors. These diseases are of great importance in veterinary medicine because they affect several animal species, such as dogs and cats. Amongst haemoparasites, Ehrlichia canis is the most virulent and principal etiologic agent of Canine Monocytic Ehrlichiosis CME. In view of this, in the present study, we set out to characterise Ehrlichia spp. strains circulating in the metropolitan region of Belém PA by performing molecular biology analyses in 200 total blood samples obtained from dogs attending the Veterinary Hospital of the Federal Rural University of Amazonia (UFRA) during the period from July to October These samples were chosen randomly, and were not restricted to animals presenting symptoms of EMC. Conclusive diagnosis of EMC was achieved by nested PCR specific for the amplification of Ehrlichia spp. DNA. We found a prevalence of 24% (48/200) among the animals tested, which corroborates the prevalence of EMC obtained in other studies, carried out in populations in other Brazilian cities (Belo Horizonte, Nanuque and Londrina). Sequencing of 16S rrna DNA coding regions (rdna) of PCR-positive samples suggests exclusivity of Ehrlichia canis as the sole etiologic agent of EMC in Belém. Additionally, comparison of the 16S rdna obtained in this study to those available in GenBank yielded nucleotide sequence identities to E. canis 16S rdna ranging from 99.5% to 100%, which confirms the reports of low variability of this pathogen in the literature. The diagnosis of CME by nested PCR did not correlate to animal characteristics such as age or sex, nor to clinical parameters such as presence of anaemia, thrombocytopenia, leukopenia or leucocytosis, suggesting that these signs are not adequate semiological markers of CME. Key words: Canine Monocytic Ehrlichiosis, Ehrlichia canis, molecular diagnosis, Belém, Amazonia.

12 11 1 INTRODUÇÃO 1.1 HEMOPARASITOSES ANIMAIS As hemoparasitoses são doenças causadas por patógenos transmitidos por vetores hematófagos. Estas se caracterizam por serem enfermidades de grande importância na Medicina Veterinária, uma vez que acometem várias espécies animais como cães, gatos, eqüinos, bovinos, etc. As manifestações clínicas destas doenças podem variar desde imperceptíveis até quadros clínicos graves, sendo letais em alguns casos (Dawson et al., 1991; Magnarelli & Anderson, 1993; Matthewman et al., 1996). Embora a ocorrência de hemoparasitoses em equinos, ovinos e bovinos possa ser responsável por grandes perdas econômicas, há grande interesse da comunidade científica nas hemoparasitoses dos animais de estimação como cães e gatos, em especial por que muitas destas doenças têm caráter zoonótico. Dentre os hemoparasitos mais estudados nestes animais estão aqueles dos gêneros Ehrlichia, Anaplasma, Babesia, Hepatozoon e Mycoplasma (Magnarelli & Anderson, 1993). As hemoparasitoses têm sido identificadas como causas crescentes de morbidade e mortalidade de caninos e, em alguns países, do homem, em virtude da maior exposição a locais onde é comum a presença de carrapatos (Labruna & Pereira, 2001). 1.2 ERLIQUIOSE CANINA Taxonomia e histórico Taxonomicamente, as espécies do gênero Ehrlichia, que são pertencentes à família Anaplasmataceae e ordem Rickettsiales, são pleomórficas, de crescimento intracelular obrigatório e consideradas bactérias gram-negativas por não apresentarem lipopolissacarídeos - LPS e peptidoglicanos. Comparado às espécies do gênero Rickettsia essas espécies se replicam em vacúolos derivados da membrana celular das células infectadas, que são principalmente monócitos e neutrófilos. Estes vacúolos propiciam a formação de mórulas que são visíveis ao microscópio (Oteo & Brouqui, 2005) (Figura 1). As espécies de Ehrlichia podem infectar cães (Magnarelli & Anderson, 1993), gatos (Matthewman et al., 1996) e humanos (Dawson et al., 1991; Magnarelli & Anderson, 1993), embora possam ainda infectar outros hospedeiros como ruminantes e equinos (Magnarelli & Anderson, 1993). Ehrlichia canis, causadora da Erliquiose Monocítica Canina EMC é a espécie mais patogênica e mais frequente em cães (Jojima et al., 2002; Oteo & Brouqui, 2005).

13 12 O primeiro relato de EMC foi feito em 1935 na Argélia, tendo como agente etiológico a Rickettsia canis que foi posteriormente reclassificada como Ehrlichia canis por Mashkovsky em1945 (Huxsoll et al., 1970). Figura 1 Mórula de Ehrlichia spp. em neutrófilo canino (seta). Foto: Raimundo Nonato Moraes Benigno. Bool & Sutmöller (1957) relataram a doença em cães da Antilhas e em 1962, esta foi diagnosticada também na África, Índia, Antilhas holandesas, Sri Lanka e nos Estados Unidos. Depois disto, novos relatos mostraram a disseminação da doença por todo o continente americano (Beer, 1988; Corrêa & Corrêa, 1992). Porém, foi somente depois da guerra do Vietnã que a doença recebeu maior atenção e reconhecimento, isto depois da morte de 200 a 300 cães militares dos Estados Unidos, diagnosticados como infectados por E. canis. No Brasil, o primeiro relato de EMC ocorreu em Belo Horizonte, Minas Gerais (Costa et al., 1973). Em 1978 houve um surto na cidade de Jaboticabal, São Paulo (Maregati, 1978 apud Kavinski et al., 1988). Atualmente a EMC têm assumido grande importância tanto na saúde pública, quanto animal e está disseminada em vários Estados brasileiros (Macedo & Leal, 2005). Até o ano de 2009, E. canis era o único táxon do gênero Ehrlichia reconhecido como agente causador de doenças em cães no Brasil. Porém, com base na amplificação do 16S rdna, Oliveira et al. (2009) relataram a ocorrência de Ehrlichia ewingii no Estado de Minas Gerais, e embora, não havendo a confirmação da espécie por

14 13 sequenciamento de DNA, este foi o primeiro estudo a fornecer evidências de infecção por E. ewingii em cães do Brasil. Tradicionalmente, tanto a E. canis quanto a E. ewingii estão envolvidas em infecções caninas, porém apenas a primeira possui uma distribuição mundial, um reflexo do vetor primário Rhipicephalus sanguineus, o carrapato marrom [vermelho] do cão (Rikihisa, 1991; Breitschwerdt et al., 1998; Dumler et al., 2001) Vetores Os vetores classificados de maior importância na transmissão da EMC são os carrapatos da ordem Ixodides, mais especificamente Rhipicephalus sanguineus, também conhecido como carrapato marrom [vermelho] do cão, que pertence à família Ixodidae, subfamília Rhipicephalinae (Figura 2). O papel do R. sanguineus como vetor da doença foi documentado primeiramente por Donatien & Lestoquard (1935). Mais tarde, este papel como vetor foi comprovado por estudos experimentais, onde através de nested PCR (npcr) foi confirmada a transmissão do parasito para cães livres de E. canis, por larvas e ninfas adquiridas de cães infectados com este bioagente na sua fase aguda (Mathew et al., 1996). Pelo fato desta espécie de carrapato ser de ampla distribuição geográfica e ter como hospedeiro principal o cão, do qual depende para a sua fonte de nutrição, a mesma ganha grande importância na disseminação da enfermidade no Brasil e no mundo (Fortes, 1997; Rosez et al., 2001) Ciclo biológico O ciclo da E. canis se dá inicialmente com a infecção dos carrapatos por essa rickettsia quando estes realizam o repasto sanguíneo em cães que estejam infectados elas, mais frequentemente durante as primeiras 2-3 semanas de infecção, no momento em que os leucócitos parasitados são mais abundantes no sangue. Os microorganismos multiplicam-se nos hemócitos, células do intestino médio e células das glândulas salivares dos carrapatos infectados, com a transmissão acontecendo no momento que o carrapato infectado ingere sangue e a infecção ocorrendo através das secreções salivares que contém o microorganismo (Swango et al, 1992). No cão, o ciclo da E. canis é dividido em três fases. Inicialmente, ocorre a penetração de corpos elementares nos monócitos por fagocitose, onde se desenvolvem

15 14 por dois dias até começarem a multiplicação. Essa etapa tem duração de três a cinco dias e culmina com a formação do corpo inicial, o qual pode ser visualizado como inclusões pleomórficas (1,0 a 2,5 μm). Por fim, as mórulas se completam ao longo de 7 a 12 dias, sendo constituídas de corpos elementares envoltos por uma membrana e permanecendo nas células hospedeiras por até quatro dias, quando ocorre a liberação das mórulas através da lise celular ou por exocitose. A partir deste momento, tornam-se livres na circulação passando a infectar novas células do hospedeiro acometido (Rosez et al, 2001). Figura 2 - Carrapato Rhipicephalus sanguineus Sinais clínicos e laboratoriais A doença pode incluir três fases: aguda, crônica e subclínica. Na sua fase aguda, os sinais da EMC incluem depressão, letargia, anorexia, pirexia, linfoadenomegalia, esplenomegalia e perda de peso. Na fase crônica os sinais mais comuns são tendências a sangramento, principalmente petéquias e equimoses na pele e nas membranas mucosas, e epistaxe ocasional. Os sinais oculares não são incomuns e incluem uveíte anterior e opacidade corneana (Waner et al., 1997). A infecção subclinica é freqüentemente encontrada e é associada com a persistência do organismo e aumento dos anticorpos séricos (Huxsoll et al., 1970; Buhles et al., 1974; Stephenson et al., 1975; Kuehn et al., 1985; Greene & Harvey, 1990; Hoskins, 1991 a, b). As anormalidades hematológicas mais frequentemente observadas em infecções naturais são anemia não regenerativa, trombocitopenia e leucopenia (Almosny et al., 2000). O número de leucócitos comumente varia durante a fase aguda, podendo diminuir em decorrência da indução ao sequestro destes por mecanismos imunológicos

16 15 (Moreira et al., 2003) e, nesse caso, a linfocitopenia e eosinopenia são consequências diretas (Waddle & Littman, 1987) Prevalência De acordo com Keefe et al. (1982) a prevalência de Ehrlichia canis varia de acordo com as condições climáticas. Outros fatores também podem influenciar nesta prevalência, como a distribuição dos vetores, sobrevivência do animal, média de idade da população estudada, práticas de manejo e habitat dos animais (Sainz et al., 1996; Rodriguez-Vivas et al., 2005). As prevalências mundiais quando a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) foi utilizada como método diagnóstico variam de 36,2% na Turquia (Tuna & Ulutas, 2009) a 41% na África (Ndip et al, 2007) e nos E.U.A. (Wen et al., 1997). Baseado em npcr, foram observados valores de prevalência de 24,7% no Caribe (Yabsley et al., 2008) e 44% nos E.U.A. (Wen et al., 1997). Lakshmanan et al. (2007), em uma mesma amostra de 98 cães da Índia encontraram valores de 19,38% de infecção com base em esfregaço sanguíneo e 50%, com base na npcr. Isto mostra a maior sensibilidade do diagnóstico molecular na detecção deste bioagente. No Brasil, dependendo da população estudada e da técnica utilizada (esfregaço sanguíneo, ELISA, RIFI e técnicas moleculares), a prevalência de E. canis, varia de 0,7 a 92% (Tabelas 1 a 4). Vale ressaltar que independente da região, as menores prevalências da infecção por E. canis são sempre aquelas determinadas com base em testes de esfregaço sanguíneo. A região norte do Brasil possui clima tropical propício à ocorrência dos vetores, favorecendo o desenvolvimento da doença e infecção de cães sadios. Porém, segundo Vieira et al. (2011) não existem relatos científicos da ocorrência de E. canis nesta região do País (Figura 3).

17 16 Tabela 1 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas por esfregaço sanguíneo no Brasil. Os números entre parênteses correspondem ao tamanho amostral. Local Prevalência (%) Referência Jaboticabal SP (48) 2,00 Oliveira et al. (2000) Jaboticabal SP (35) 5,70 Faria et al. (2010) Botucatu SP (70) 7,00 Ueno et al. (2009) Anápolis GO (53) 5,56 Mundim et al. (2008) Minas Gerais (101) 16,0 Soares et al. (2006) Minas Gerais (4407) 5,70 Borin et al. (2009) Brasília (2952) 0,81 Vasconcelos et al. (2008) Recife PE (100) 9,00 Ramos et al. (2009) Cuiabá MT (195) 37,9 Sousa (2006) Campos dos Goytacazes RJ (1.576) 13,89 Albernaz et al. (2007)

18 17 Tabela 2 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas por testes de ELISA no Brasil. Números entre parênteses correspondem ao tamanho amostral. Local Prevalência (%) Referência Jaboticabal SP (52) 92,3 Oliveira et al. (2000) Jaboticabal SP (51) 86,2 Oriá et al. (2008) Jaboticabal SP (30) 70,0 Nakaghi et al. (2008) São Paulo (671) 15,5 Labarthe et al. (2003) Rio de Janeiro (422) 29,6 Labarthe et al. (2003) Minas Gerais (446) 20,9 Labarthe et al. (2003) Rio Grande do Sul (356) 1,70 Labarthe et al. (2003) Paraná (43) 4,70 Labarthe et al. (2003) Santa Catarina (142) 0,70 Labarthe et al. (2003) Bahia (117) 35,9 Labarthe et al. (2003) Ceará (11) 45,5 Labarthe et al. (2003) Pernambuco (105) 49,5 Labarthe et al. (2003) Alagoas (11) 54,5 Labarthe et al. (2003) Mato Grosso do Sul (126) 35,7 Labarthe et al. (2003) Distrito Federal (101) 23,8 Labarthe et al. (2003) Londrina PR (381) 22,8 Trapp et al. (2006) Ilhéus, Itabuna BA (200) 36,0 Carlos et al. (2007) Cajazeiras BA (203) 41,4 Souza et al. (2010) Itapuã BA (269) 31,2 Souza et al. (2010)

19 18 Tabela 3 - Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas por Reação de Imunofluorescência Indireta no Brasil. Números entre parênteses correspondem ao tamanho amostral. Local Prevalência (%) Referência Jaboticabal SP (51) 66,6 Oriá et al. (2008) Jaboticabal SP (30) 63,3 Nakaghi et al. (2008) Botucatu SP (198) 73,2 Diniz et al. (2007) Minas Gerais (226) 44,7 Costa Jr et al. (2007) Rio Grande do Sul (389) 4,80 Saito et al. (2008) Montenegro RO (314) 31,0 Aguiar et al. (2007) Salvador - BA (472) 35,6 Souza et al. (2010) Cuiabá MT (254) 42,5 Silva et al. (2010) Tabela 4. Prevalências de infecções por Ehrlichia canis em cães, diagnosticadas por testes moleculares no Brasil. Números entre parênteses correspondem ao tamanho amostral. Local Prevalência (%) Referência Botucatu SP (198) 77,7 Diniz et al. (2007) 1 Botucatu SP (70) 40,0 Ueno et al. (2009) 1 Rio de Janeiro RJ (226) 15,0 Macieira et al. (2005) 1 Londrina PR (129) 22,0 Dagnone et al. (2003) 1 Jaboticabal SP (25) 88,0 Dagnone et al. (2009) 2 Jaboticabal SP (30) 53,3 Nakaghi et al. (2008) 2 Jaboticabal SP (40) 72,5 Faria et al. (2010) 2 Botucatu SP (217) 30,9 Bulla et al. (2004) 2 Ribeirão Preto SP (221) 38,9 Santos et al. (2009) 2 Ilhéus-Itabuna BA (153) 7,80 Carvalho et al. (2008) 2 Campo Grande MS (26) 38,4 Dagnone et al. (2009) 2 Recife - PE (100) 57,0 Ramos et al. (2009) 2 Lavras MG (97) 1,03 Costa Jr (2007) 3 Belo Horizonte MG (49) 24,49 Costa Jr (2007) 3 Nanuque MG (102) 26,47 Costa Jr (2007) 3 Cuiabá MT (60) 20,0 Sousa (2006) 2 1 PCR, 2 nested PCR, 3 PCR em tempo real

20 19 Figura 3: Ocorrência de infecção por E. canis em cães no Brasil. Fonte: adaptado de Vieira et al. (2011) Diagnóstico, prevenção e tratamento O diagnóstico da erliquiose canina geralmente se dá através da observação dos sinais clínicos, por métodos sorológicos e por meio da detecção do patógeno em esfregaços sanguíneos (Waner et al., 2001). O diagnóstico pode ser feito também através da história de exposição a carrapatos, anormalidades hematológicas, aspirados de tecidos ou através de cultura de células (Rikihisa, 2000). Em função da gama de enfermidades que podem apresentar os mesmos sinais clínicos (Rikihisa, 2000), a baixa bacteremia (Harrus et al., 1997), e reações sorológicas cruzadas entre espécies relacionadas (Rikihisa et al., 1994), os métodos rotineiros de diagnóstico supracitados apresentam suas sensibilidades e/ou especificidades comprometidas. Desta forma, diagnósticos mais precisos e rápidos, como os diagnósticos moleculares, têm sido otimizados (Wen et al., 1997; Martin et al., 2005). A

21 20 otimização desses diagnósticos ganha grande importância em função do crescente interesse no estudo dessas rickettsias como agentes causais de infecções em humanos (Unver et al., 2001; Tami & Tami-Maury, 2004). Com isso, a precisa identificação do estado de infecção dos cães é um dado cada vez mais significativo. A PCR convencional ainda possui suas limitações, apresentando sensibilidade semelhante à cultura de células, RIFI, e Western Blotting, porém, em função da sua rapidez, comodidade e por ser um diagnóstico direto, este método é utilizado como teste de acompanhamento ao tratamento (Iqbal et al., 1994; Wen et al., 1997). Em função dessas limitações da técnica convencional de PCR, outras ferramentas moleculares derivadas da mesma têm sido desenvolvidas com o objetivo de aumentar a sensibilidade desta metodologia, como por exemplo, a npcr, RFLP-PCR e PCR em tempo real (Murphy et al., 1998; Wen et al., 1997; Dagnone et al., 2003; Campagner et al., 2004; Labruna et al., 2007). A vantagem do diagnóstico molecular em relação aos outros, é que neste há a detecção do DNA do parasito, diferente dos demais diagnósticos que se baseiam na visualização do próprio organismo ou na detecção da presença de anticorpos contra o mesmo, causando muitas vezes reações cruzadas com outros organismos, gerando um resultado falso positivo. No Brasil, a detecção de E. canis, ainda tem se baseado predominantemente no diagnóstico direto por meio de esfregaços sanguíneos e indireto através de métodos sorológicos (Soares et al., 2006; Carlos et al., 2007), dificultando a determinação da prevalência desses patógenos devido à baixa sensibilidade (Mylonakis et al., 2003) e especificidade destes métodos, respectivamente (Rikihisa et al., 1994). Vários são os medicamentos que podem ser utilizados para o tratamento dos animais acometidos, como as tetraciclinas e seus derivados (doxiclina) que estão entre os que têm maiores probabilidades de eliminar o agente (Woody & Hoskins, 1991; Dawson et al., 1991; Dagnone, 2002). Outros medicamentos como o cloranfenicol e o dipropionato de imidocarb são bastante eficazes no tratamento, principalmente quando há co-infecção com Babesia spp. (Dagnone et al., 2002; Dagnone et al., 2004), sendo que a recuperação depende da severidade do caso clínico e do período em que se inicia a medicação (Troy & Forrester, 1990). Estudos recentes demonstraram que uma cepa atenuada de E. canis pode proteger potencialmente cães da EMC e ser utilizada como vacina para esta doença. Nestes experimentos, cães que recebiam esta cepa atenuada, possuíam sinais clínicos e

22 21 cargas bacterianas reduzidas após o desafio com uma cepa selvagem de E. canis (Rudoler et al., 2012). Estes achados dão suporte a estudos anteriores que sugeriam que esta mesma cepa poderia ser utilizada na confecção de vacinas para a EMC (Or et al., 2009).

23 22 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Detectar e caracterizar molecularmente as cepas de Ehrlichia spp. circulantes na região metropolitana de Belém, Pará. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Identificar a(s) espécie(s) de Ehrlichia circulante(s) em Belém, Pará; Analisar a associação entre a infecção por Ehrlichia com a idade e sexo dos cães; Analisar a associação entre a infecção por Ehrlichia versus alterações quantitativas de plaquetas, hemácias e leucócitos em cães; Caracterizar molecularmente a(s) cepas de Ehrlichia spp. de Belém, Pará.

24 23 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 AMOSTRAGEM Um total de 200 amostras de sangue total foi obtido de animais atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal Rural da Amazônia (HOVET/UFRA) durante o período de julho a outubro de Estas amostras foram selecionadas aleatoriamente, não necessariamente envolvendo animais com sintomatologia para EMC. Após a coleta de sangue para a realização de hemograma completo, realizado como rotina do hospital, no Laboratório de Análises Clínicas do HOVET/UFRA, uma alíquota de sangue total foi enviada ao Laboratório de Tecnologia Biomolecular da Universidade Federal do Pará (LTB/UFPA). Todas as amostras foram armazenadas a 4ºC até o seu processamento, isto é extração do DNA. 3.2 ANÁLISES MOLECULARES O DNA total de cada amostra foi extraído através do método fenol-clorofórmio seguindo procedimentos padrões de Sambrook et al. (1989). A detecção de Ehrlichia spp. foi realizada com base na amplificação de um fragmento de aproximadamente 500 pares de bases (pb) do gene ribossomal 16S, cujos iniciadores foram desenhados para a amplificação de bactérias da família Anaplasmataceae, enquanto que a identificação de E. canis foi realizada através da amplificação de um fragmento de aproximadamente 400 pares de bases, também do gene ribossomal 16S, como um protocolo de nested PCR, cujos iniciadores são específicos apenas para E. canis. Assim, foi realizada uma primeira reação de volume total de 25 µl contendo ng de DNA molde, 2,0 mm de MgCl 2, 2,5 mm de cada dntp, 10 mm de Tris-HCl, 50 mm de KCl, 5 µm de cada iniciador (ECC e ECB [Dawson et al., 1994, 1996]) e 1 U de Taq DNA polymerase (Invitrogen). A segunda reação, também realizada em um volume de 25 µl, continha 1 µl do produto da primeira reação, 2,0 mm de MgCl 2, 2,5 mm de cada dntp, 10 mm de Tris-HCl, 50 mm de KCl, 5 µm de cada iniciador (Ecan [Murphy et al., 1998] e HE3 [Anderson et al., 1992]). O perfil de amplificação da primeira reação consistiu de 35 ciclos de 1 min a 94 o C, 1 min a 65 o C, e 1 min a 72 C, precedidos por 3 min a 94 o C seguidos por 5 min a 72 o C. A segunda reação consistiu de uma etapa de desnaturação de 94 o C por 5 min, seguidos de 35 ciclos de 94 o C por 1 min, 62ºC por um min e 72 o C por um min, com uma extensão final de 72 o C por 5 min.

25 24 O DNA de uma amostra de sangue de cão sabidamente infectada por E. canis foi utilizada como controle positivo de reação, enquanto que água bidestilada estéril, como controle negativo. A positividade desta amostra foi confirmada com base no sequenciamento nucleotídico do fragmento amplificado com os iniciadores Ecan/HE3 e sua comparação com a sequência EF obtida do GenBank (NCBI Todos os produtos de PCR foram visualizados após eletroforese em gel de agarose 1,5% em tampão TAE, coloração com o GelRed Nucleic Acid Stain (Biotium) e visualização através do fotodocumentador E-BOX VX2 (Vilber Lourmat). Um marcador de peso molecular de 100 pb (O GeneRuler) e/ou de 1 kb (DNA ladder Invitrogen ) foi utilizado para estimar o tamanho de cada fragmento amplificado. Para a confirmação das espécies e cepas circulantes em Belém, todas as amostras positivas pela PCR foram submetidas à análise segundo o protocolo de Pinyoowong et al. (2008), o qual permite a amplificação da sequência completa do 16S rdna. Os amplicons resultantes deste protocolo foram purificados com auxílio do kit GFX DNA PCR and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences), então, ligados ao vetor pgem-t Vector System (Promega) e inseridos em E. coli JM109 (Promega) quimiocompetente. Em seguida, as amostras foram sequenciadas no Centro de Inovações Tecnológicas - CIT do Instituto Evandro Chagas - IEC, em analisador automático de DNA modelo ABI 3500XL (Life Technologies), em conjunção com o Big Dye Terminator V3.1 kit, seguindo especificações do fabricante. Para a validação das sequências nucleotídicas cada amostra foi sequenciada com ambos os iniciadores, direto e reverso. Finalmente, estas foram editadas e alinhadas no programa BioEdit Hall (1999), o qual foi também utilizado para o cálculo de identidade nucleotídica em comparação com as sequências nucleotídicas das seguintes cepas obtidas do GenBank do NCBI - National Center for Biotechnoloy Information ( Brazil-CO1 (EF195134), TWN1 (EU106856), Bangkok (EF139458), VHE (AF373612), VDE (AF373613), GR21 (EF011110), Jake (CP000107), Brazil-CO2 (EF195135), Oklahoma (M73221), Florida (M73226), Gzh982 (AF162860), Germishuys (U54805), PDE (DQ915970), 611 (U26740) e Kagoshima 1 (AF536827).

26 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os hemogramas obtidos foram analisados para as variáveis hemácias, plaquetas e leucócitos totais. As mesmas foram analisadas de acordo com Bush (2004) onde foram considerados anêmicos, leucopênicos e trombocitopênicos os animais que apresentaram, respectivamente, valores inferiores a 5, /mm 3 hemácias, 6.000/mm 3 leucócitos e /mm plaquetas. Os animais foram considerados com leucocitose quando apresentavam valores de leucócitos totais superiores a / mm 3. Para a análise estatística dos resultados obtidos, foi utilizado o teste do Qui- Quadrado (χ 2 ) e o teste G, com intervalo de confiança de 95%, tendo sido considerados significativos os resultados com significância P < 0,05. A avaliação estatística foi feita através da associação do resultado da PCR com os valores hematológicos obtidos e as variáveis epidemiológicas sexo e idade. Para a realização dos cálculos estatísticos, os animais foram divididos entre os valores hematológicos de hemácias maior ou igual a 5, /mm 3 e abaixo de 5, /mm 3. Para os Leucócitos foram divididos em menor que 6.000/mm 3, de 6.000/mm 3 a /mm 3 e maior que /mm 3. Para as plaquetas foram divididos em maior ou igual a /mm e menor que /mm. Já para a variável idade, foram divididos em 1 a 12 meses, de 12 a 48 meses, acima de 48 meses e idade não determinada.

27 26 4 RESULTADOS 4.1 DETECÇÃO E DIVERSIDADE NUCLEOTÍDICA A amplificação de um fragmento de 458 pares de bases na primeira reação sugeriu a presença do DNA de Ehrlichia em 48 (24%) das 200 amostras de sangue total analisadas. Nestas 48 amostras foram posteriormente identificadas como positivas para a presença de E. canis com base na amplificação de um fragmento 398 pares de bases na segunda reação do protocolo de nested PCR. A amplificação da sequência completa do 16S rdna das 48 amostras positivas para Ehrlichia resultou em amplicons de 1481 nucleotídeos e um único haplótipo, cuja identidade nucleotídica, em comparação par a par com cepas de E. canis, de várias regiões do globo terrestre, variou de 99,7 a 100% (Tabelas 5 e 6). Figura 4 - Detecção de E. canis através de nested PCR, em amostras de sangue total de cães atendidos no período de julho a agosto de 2011 na rotina do Hospital Veterinário (HOVET) da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA). Linhas 2 a 8 correspondem à primeira reação da PCR, enquanto as linhas 10 a 16 à segunda reação da PCR; Linhas: 1 e 9 correspondem ao Ladder 100 pb (O GeneRuler); 2 e 10: controles positivos (Amostra de DNA obtida de cão parasitado por E. canis); Linhas 8 e 16: controles negativos (sem amostra de DNA). As setas correspondem ao fragmento de 500 pb do ladder.

28 27 Tabela 5 - Identidade nucleotídica par a par do rdna 16S de Ehrlichia canis de Belém, Pará e 14 outras cepas de E. canis distribuídas mundialmente. Cepa Jake Belém CO1 TW1 Bangkok CO2 Oklahoma Florida Gzh982 VHE Germishuys VDE PDE 611 Kagoshima Belém CO ,000 TW ,000 1,000 Bangkok ,000 1,000 1,000 CO Oklahoma Florida Gzh VHE ,000 1,000 1,000 1, Germishuys VDE ,000 1,000 1,000 1, , PDE Kagoshima GR ,000 1,000 1,000 1, , , Código de acesso do GenBanK: Jake (CP000107), CO1 (EF195134), TW1 (EU106856), Bangkok (EF139458), CO2 (EF195135), Oklahoma (M73221), Florida (M73226), Gzh982 (AF162860), VHE (AF373612), Germishuys (U54805), VDE (AF373613), PDE (DQ915970), 611 (U26740), Kagoshima (AF536827), GR21 (EF011110).

29 28 Tabela 6 - Polimorfismo do rdna 16S de Ehrlichia canis de Belém, Pará em comparação 14 outras cepas de E. canis distribuídas mundialmente. Cepa de E. canis País Número de acesso no GenBank Tamanho Sítios nucleotídeos a Belém c Brasil pb G C G A A - G C A T C C G Jake b E.U.A CP pb A Brazil-CO1 b Brasil EF pb - TWN1 b Taiwan EU pb - Bangkok c Tailândia EF pb - Brazil-CO2 b Brasil EF pb - T Oklahoma b E.U.A M pb A - - Florida b E.U.A M pb A - - T Gzh982 b China AF pb - - T VHE c Venezuela AF pb - Germishuys d África do Sul U pb - - VDE b Venezuela AF pb - PDE b Peru DQ pb G - T C 611 b Israel U pb S - C A Kagoshima 1 b Japão AF pb - C GR21 b Grécia EF pb - a Os números representam a posição da cepa de E. canis Belém ; mesma base da cepa de E. canis Belém ; - deleção; S = G ou C; b Isolados obtido de humanos; c Isolados obtido de cães; d Isolado obtido de ovelha.

30 CORRELAÇÃO COM IDADE, SEXO E PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS Dentre os 48 animais positivos para E. canis, 9 apresentavam anemia, 7 trombocitopenia, 2 leucocitose, 9 anemia e trombocitopenia, 3 anemia e leucocitose, 1 anemia e leucopenia, 6 anemia, trombocitopenia e leucopenia, 2 anemia, trombocitopenia e leucocitose e 9 animais apresentaram parâmetros hematológicos normais (Tabela 7). Não foram observadas correlações estatisticamente significativas entre esses parâmetros hematológicos e a infecção por Ehrlichia canis (Tabela 7). Contudo, sem correção de Yates, a variável trombocitopenia apresentou valor de P igual a 0,04. Nenhuma correlação foi observada entre a presença de Ehrlichia canis e a idade ou sexo dos animais (Tabela 8). Tabela 7 - Associação entre achados hematológicos e resultados da reação em cadeia da polimerase (PCR), em cães atendidos no período de julho a agosto de 2011 na rotina do Hospital Veterinário (HOVET) da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA). Exames Cães χ 2 P Hematológicos n PCR positivos % Hemácias ,7 3,776 0,07 < ,6 Leucócitos < , ,9 1,797 0,40 > ,5 Plaquetas ,4 4,306 0,05 < ,9

31 30 Tabela 8 - Frequência de cães positivos pela reação em cadeia da polimerase (PCR) para Ehrlichia canis, segundo faixa etária e sexo, em cães atendidos no período de julho a agosto de 2011 na rotina do Hospital Veterinário (HOVET) da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA). Idade Número de cães positivos/ número de cães testados (% positivos) (meses) Machos Fêmeas Total 1 a 12 5/17 (29,4) 0/11 (0,0) 5/28 (17,8)* >12 a 48 1/5 (20,0) 1/7 (14,3) 2/12 (16,7)* >48 9/38 (23,7) 23/69 (33,3) 32/107 (29,9)* Não determinada 3/21 (14,3) 6/32 (18,7) 9/53 (17,0)* Total 18/81 (22,2)** 30/119 (25,2)** 48/200 (24,0) * P > 0,05; ** P > 0,05

32 31 5 DISCUSSÃO 5.1 DETECÇÃO E FREQUÊNCIA DE PREVALÊNCIA DO DNA DE Ehrlichia canis EM BELÉM, PARÁ Este estudo demonstrou a presença de DNA de E. canis em cães de uma população hospitalar de Belém, Pará. Embora não haja nenhum relato científico da ocorrência e prevalência de Ehrlichia spp. na região norte brasileira a frequência de animais positivos em Belém, com base em testes moleculares, parece ser semelhante àquela descrita para algumas outras regiões do Brasil. Costa Jr (2007) observou uma frequência de positividade igual a 24,49 e 26,47% em Belo Horizonte e Nanuque - Minas Gerais, respectivamente. Dagnone et al. (2003) observaram uma frequência do DNA de E. canis em 21% de uma amostra de 129 cães de Londrina, Paraná. Por outro lado, a prevalência do DNA de E. canis detectada por diagnósticos moleculares no Brasil pode variar de 1,03% a 88% (Dagnone et al., 2003; Bulla et al., 2004; Macieira et al., 2005; Sousa, 2006; Costa Jr, 2007; Diniz et al., 2007; Carvalho et al., 2008; Nakaghi et al., 2008; Dagnone et al., 2009; Ramos et al., 2009; Santos et al., 2009; Ueno et al., 2009; Faria et al., 2010). Embora não existam informações para outras partes da região norte brasileira, os dados do presente estudo refutam a hipótese de que devido suas condições climáticas esta região devesse apresentar prevalência de infecção superior àquelas observadas para as regiões Sul e Sudeste por exemplo. Devido sua localização, a qual é situada às margens da Baía do Guajará ( S; W) e a uma distância de aproximadamente 100 Km do Oceano Atlântico, de acordo com a classificação de Köppen, Belém pertence ao grupo Af, possuindo clima quente e úmido, com temperatura média de 26ºC e umidade relativa do ar variando entre 80 a 90% (Abreu et al., 2004), o que deve favorecer o ciclo biológico do carrapato em todos os meses do ano, e consequentemente o aumento da prevalência de E. canis. Adicionalmente, com base nos índices pluviométricos, a cidade de Belém é caracterizada por dois períodos distintos, o chuvoso que se estende de dezembro a maio e o menos chuvoso que vai de junho a novembro. Assim, considerando que estudo se baseou apenas em amostras coletadas de julho a outubro, é interessante notar a necessidade de estudos que avaliem diferenças sazonais quanto à prevalência de E. canis em Belém.

33 IDENTIFICAÇÃO DA ESPÉCIE DE Ehrlichia EM BELÉM, PARÁ A nested PCR constitui um método de diagnóstico altamente sensível e específico além de ser uma forma rápida de detecção do parasito para diagnósticos clínicos e estudos epidemiológicos. Considerando que os iniciadores utilizados na primeira reação do protocolo de nested PCR utilizado no presente estudo amplifica um fragmento de tamanho semelhante para vários táxons da família Anaplasmataceae, este pode ser útil para a detecção de todas as espécies de Ehrlichia, dentre outros microrganismos. Contudo, neste estudo, as 48 amostras positivas para a primeira reação foram também positivas para a segunda reação, a qual utiliza iniciadores específicos para E. canis, sugerindo a ocorrência exclusiva de E. canis em Belém, Pará. Oliveira et al. (2009) sugere a ocorrência de Ehrlichia ewingii no Estado de Minas Gerais, mas até o presente momento nenhum estudo, baseado no sequenciamento de DNA, confirmou a ocorrência desta espécie no Brasil. O presente estudo favorece a hipótese de que a EMC no Brasil seja causada exclusivamente por E. canis, e que a observação de Oliveira et al. (2009) seja resultante de amplificação inespecífica. Isso reforça a necessidade do sequenciamento de DNA para a confirmação da espécie nos estudos de EMC. Adicionalmente, estes estudos devem ser baseados em grandes tamanhos amostrais e envolver amostragem em ampla distribuição geográfica. A exclusividade de E. canis, nas amostras testadas, em Belém, Pará foi confirmada através do sequenciamento do rdna 16S, que mesmo tendo sido amplificado com iniciadores genéricos para cinco espécies de Ehrlichia e cinco de Anaplasma, somente um haplótipo foi identificado nas 48 amostras positivas deste estudo. Adicionalmente, este haplótipo apresentou de 99,7 a 100% de identidade com diferentes cepas de E. canis, inclusive duas oriundas da região sudeste brasileira. É interessante notar que apesar de um baixo nível de polimorfismo (Aguirre et al., 2006; de la Fuente et al., 2006; Yu et al., 2007), o rdna 16S é, atualmente, considerado o melhor alvo para distinguir as diferentes cepas de E. canis (Unver et al., 2001). Diniz et al. (2007) e Ueno et al. (2009) utilizaram o método da PCR convencional para posterior confirmação da espécie E. canis por sequenciamento. Este método, apesar de seguro, não se mostra interessante para a realização de diagnósticos de rotina, uma vez que necessitam de um grande intervalo de tempo para a sua realização. O mesmo se aplica para os estudos realizados por Dagnone et al. (2003), uma vez que a mesma também utilizou a PCR convencional com posterior confirmação

34 33 da espécie através da utilização de enzimas de restrição. Este método além de mais demorado pode gerar resultados inespecíficos. 5.3 CORRELAÇÃO DE INFECÇÃO POR Ehrlichia canis COM VARIÁVEIS HEMATOLÓGICAS E EPIDEMIOLÓGICAS Os principais achados hematológicos nos animais do presente estudo foram anemia e trombocitopenia. Apesar de a trombocitopenia ser o principal achado hematológico observado em todas as fases da erliquiose canina (Almosny et al., 2000; Pagani et al., 2000; Moreira et al., 2003), não foi observada associação estatística significativa para a variável hemácia e leucócitos, e a variável plaqueta, o que corrobora os estudos de Scorpio et al. (2008) e Avizeh et al. (2010), respectivamente. Isto sugere a importância do diagnóstico laboratorial específico, visto que a falta de associação de parâmetros hematológicos e o desenvolvimento da infecção por E. canis não é condizente com um diagnóstico preciso. A falta de correlação entre a infecção por E. canis e a idade dos animais, aqui observada, corrobora os estudos de Matthewman et al. (1993), Inokuma et al. (1999) e Waner et al. (2000), enquanto a falta de correlação com o sexo dos animais está de acordo com Waner et al. (2000), Watanabe et al. (2004), Rodriguez-Vivas et al. (2005), Solano- Gallego et al. (2006) e Avizeh et al. (2010).

35 34 6 CONCLUSÕES De acordo com as análises aqui realizadas pôde-se concluir que: A espécie Ehrlichia canis é a única espécie de Ehrlichia circulante em Belém, Pará; As cepas de Ehrlichia canis circulantes em Belém, Pará apresentam baixa variabilidade genética quando comparadas com cepas de E. canis de outras regiões do globo terrestre; Não houve correlação estatística significativa entre a infecção por E. canis e a idade e o sexo dos cães analisados; Não houve correlação estatística significativa entre a infecção por E. canis e os valores hematológicos dos cães analisados.

36 35 REFERÊNCIAS ABREU, S.F., COSTA, J.P.R., ROLIM, P.A.M. Comportamento da TSM e anomalia da precipitação durante os eventos do El Niño 82/83 e 97/98, no regime de precipitação das cidades de Belém, Santarém e Manaus. Anais do XIII Congresso Brasileiro de Meteorologia, Fortaleza, AGUIAR, D.M., CAVALCANTE, G.T., PINTER, A., GENNARI, S.M., CAMARGO, L.M.A., LABRUNA, M.B. Prevalence of Ehrlichia canis (Rickettsiales: Anaplasmataceae) in dogs and Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) ticks from Brazil. Journal of Medical Entomology, 44(1): , AGUIRRE, E., TESOURO, M.A., RUIZ, L., AMUSATEGUI, I., SAINZ, A. Genetic characterization of Anaplasma (Ehrlichia) platys in dogs in Spain. Journal of Veterinary Medicine Series B-infectious Diseases and Veterinary Public Health, 53: , ALBERNAZ, A.P., MIRANDA, F.J.B., MELO JR., O.A., MACHADO, J.A., FAJARDO, H.V. Erliquiose canina em Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro, Brasil. Ciência Animal Brasileira, 8(4): , ALMOSNY, N.R.P., MASSARD, C.L., SILVA, G.V.O., RODRIGUES, L.M., XAVIER, M.S. Avaliação hematológica de cães infectados experimentalmente por Ehrlichia canis. Revista Brasileira de Ciência Veterinária, 7: , ANDERSON, B.E., SUMNER, J.W., DAWSON, J.E., TZIANABOS, T., GREENE, C.R., OLSON, J.G., FISHBEIN, D.B., OLSEN-RASMUSSEN, M., HOLLOWAY, B.P., GEORGE, E.H., AZAD, A.F. Detection of the etiologic agent of human ehrlichiosis by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, 30: , AVIZEH, R., MOSALLANEJAD, B., RAZI JALALI, M.H., ALBORZI, A.R. Seroprevalence of Ehrlichia canis in dogs referred to Veterinary Hospital of Shahid Chamran University of Ahvaz, Iran. Archives of Razi Institute, 65(1): 21-26, BEER, J. Doenças infecciosas em animais domésticos. São Paulo: Roca, p BOOL, P.H., SUTMÖLLER, P. Ehrlichia canis Infections in Dogs on Aruba (Netherlands Antilles). Jounal of American Veterinary Medical Association, 130(9): , BORIN, S., CRIVELENTI, L.Z., FERREIRA, F.A. Aspectos epidemiológicos, clínicos e hematológicos de 251 cães portadores de mórula de Ehrlichia spp. naturalmente