DETECÇÃO MOLECULAR E SOROLÓGICA DE Ehrlichia spp. EM FELINOS DOMÉSTICOS DA REGIÃO METROPOLITANA DE CUIABÁ, BRASIL.

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DETECÇÃO MOLECULAR E SOROLÓGICA DE Ehrlichia spp. EM FELINOS DOMÉSTICOS DA REGIÃO METROPOLITANA DE CUIABÁ, BRASIL. Ísis Assis Braga CUIABÁ-MT 2013

2 2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DETECÇÃO MOLECULAR E SOROLÓGICA DE Ehrlichia spp. EM FELINOS DOMÉSTICOS DA REGIÃO METROPOLITANA DE CUIABÁ, BRASIL. Autor (a): Ísis Assis Braga Orientador: Prof. Dr. Daniel Moura de Aguiar Co-Orientador: Prof. Dra. Valéria Régia Franco Sousa Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Medicina Veterinária, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. CUIABÁ-MT 2013

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5 5 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO PRÓ-REITORIA DE ENSINO DE PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Avenida Fernando Corrêa da Costa, Boa Esperança - Cep: CUIABÁ/MT Tel : cpgvet@ufmt.br FOLHA DE APROVAÇÃO TÍTULO : "Detecção molecular e sorológica de Ehrlichia spp. em felinos domésticos da região metropolitana de Cuiabá, Brasil" AUTOR : Mestranda Ísis Assis Braga Dissertação defendida e aprovada em 28/02/2013. Composição da Banca Examinadora: Presidente Banca / Orientador Doutor(a) Daniel Moura de Aguiar Instituição : Universidade Federal de Mato Grosso Examinador Interno Doutor(a) Richard de Campos Pacheco Instituição : Universidade Federal de Mato Grosso Examinador Externo Doutor(a) Instituição : Universidade do Oeste Paulista Vamilton Alvares Santarém Examinador Suplente Doutor(a) Luciano Nakazato Instituição : Universidade Federal de Mato Grosso CUIABÁ, 28/02/2013.

6 6 DEDICATÓRIA Aos meus pais, João Geraldo e Eliete pelos ensinamentos, apoio e amor incondicional. Ao meu irmão, Igor pelo exemplo de vida e dedicação.

7 7 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por mais esta conquista, pela força concedida nos momentos de aflição, e por ter colocado anjos em minha vida durante essa etapa. Aos meus pais, João Geraldo e Eliete, quaisquer que sejam as palavras descritas neste, serão incapazes de descrever meu sentimento por vocês. Ao Igor, meu irmão, que é meu orgulho e exemplo. AMO VOCÊS! Ao amigo e agregado da família, Lázaro (Broto), que apesar da distância sempre acompanhou e torceu pelos meus objetivos. Ao meu orientador, Daniel. Muito obrigada pela confiança, paciência, ensinamentos e por me fazer sentir a vontade em trabalhar com você. As colegas de laboratório Andréia, Thábata, Thaysa e Clara pelo apoio técnico. Aos anjos Alvair, Cris, Dirceu, Elenice, Luana, Marcus (Poodle) e Samara, obrigada pela amizade, pela força e pelos risos. Aos professores Adriane Jorge, Luciano Nakazato, Richard Pacheco (Tiozão), Valéria Dutra e Valéria Régia pelo auxílio e disponibilidade de materiais necessários para a realização deste trabalho.

8 8 RESUMO DETECÇÃO MOLECULAR E SOROLÓGICA DE Ehrlichia spp. EM FELINOS DOMÉSTICOS DA REGIÃO METROPOLITANA DE CUIABÁ, BRASIL A erliquiose é uma doença de distribuição mundial, causada pelas Rickettsias Ehrlichia spp.. É considerada endêmica em cães de várias regiões do Brasil, porém em felinos essa informação é desconhecida e poucos estudos foram realizados até o momento no país. Com o intuito de detectar a presença de infecção por Ehrlichia spp. em gatos da região metropolitana de Cuiabá, Mato Grosso, foram coletadas amostras de sangue de uma população de 212 indivíduos da região e submetidos a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Ehrlichia spp. e a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) visando a amplificação de um fragmento de 409 pb do gene dsb de Ehrlichia. Dos animais avaliados 88 (41,5%) foram soropositivos pela RIFI e 20 (9,4%) foram positivos pela PCR. Sequências parciais de DNA obtidas a partir dos produtos da PCR foram idênticas às sequências de E. canis depositadas no GenBank. Doze gatos foram positivos em ambos testes molecular e sorológico. Testes de associação baseados nas alterações clínicas e laboratoriais de uma parcela da população estudada demonstraram que gatos soropositivos apresentaram palidez de mucosas e baixas contagens de eritrócitos como variáveis associadas (p 0,05). No momento da coleta de sangue não foi visualizado infestação por carrapatos nos animais. O presente estudo complementa a demanda de trabalhos nesta espécie, relatando pela primeira vez a detecção molecular e sorológica de E. canis em gatos da região metropolitana de Cuiabá, região Centro- Oeste do Brasil. Palavras-chave: Carrapatos, erliquiose, felinos, PCR, RIFI

9 9 ABSTRACT MOLECULAR AND SEROLOGICAL DETECTION OF Ehrlichia spp. IN DOMESTIC CATS IN THE METROPOLITAN REGION OF CUIABÁ, BRAZIL Ehrlichiosis is a disease of worldwide distribution, caused by the rickettsial agent Ehrlichia spp.. The occurrence in dogs is considered endemic in several regions of Brazil. However, this information in cats is unknown and few studies have been performed to date in Brazil. In order to detect the presence of Ehrlichia spp. in cats from the metropolitan area of Cuiabá, Mato Grosso state, blood and serum samples were collected from a regional population of 212 individuals and tested by Immunofluorescence Assay (IFA) and the Polymerase Chain Reaction (PCR) designed to amplify a 409 bp fragment of the dsb gene. Eighty-eight (41.5%) animals were seropositive by IFAT and 20 (9.4%) were PCR positive. Partial sequences of DNA obtained from PCR products were identical to the GenBank E. canis sequences. Twelve cats were positive in both molecular and serological tests. Association tests, based on clinical and laboratory findings of a partial evaluated population, showed that seropositive cats presenting pale mucous membranes and lower counts of erythrocytes as associated variables (p 0.05). Tick infestation was not observed at blood collection. This study complements the demand for more information on this species, reporting the presence and the first molecular and serological detection of E. canis infection in cats from the metropolitan area of Cuiabá, Midwest region in Brazil. Keywords: Ticks, ehrlichiosis, cats, PCR, IFA

10 10 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Freqüência de títulos observados em gatos positivos para Ehrlichia spp. através de Reação de Imunofluorescência Indireta. Cuiabá, MT Tabela 2: Associação entre os locais de origem dos felinos e os resultados da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR). Cuiabá, MT Tabela 3: Associação entre achados clínico-laboratoriais e os resultados da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) dos animais atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso. Cuiabá, MT Tabela 4: Associação entre achados clínico-laboratoriais e os resultados da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) dos animais atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso. Cuiabá, MT

11 11 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Localização dos municípios de Cuiabá e Várzea Grande, MT. Cuiabá,

12 12 SUMÁRIO Página RESUMO ABSTRACT LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Erliquiose Felina Histórico Agentes Etiológicos Patogenia Sinais Clínico-laboratoriais Transmissão e Ciclo Biológico Diagnóstico Erliquiose Humana MATERIAL E MÉTODOS Local de estudo Amostragem Reação de Imunofluorescência Indireta Extração de DNA Reação em Cadeia pela Polimerase Purificação e Sequenciamento Análise Estatística RESULTADOS Gatos Reação de Imunofluorescência Indireta Reação em Cadeia pela Polimerase Seqüenciamento Genético Achados Clínico-laboratoriais Análises Estatísticas DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 39

13 13 1 INTRODUÇÃO Dentre as enfermidades transmitidas por carrapatos, a erliquiose destaca-se como importante doença de distribuição cosmopolita, sendo causada por microorganismos do gênero Ehrlichia, acometendo principalmente cães e humanos (GROVES et al., 1975; RIKIHISA et al.,1991; COUTO, 1998). Todavia, devido a expansão dos limites zoogeográficos observados em meio aos artrópodes e as infecções transmitidas pelos mesmos, em decorrência de mudanças climáticas e maiores acessibilidades a certos nichos ambientais (SHAW et al., 2001), pesquisas vêm demonstrando também que os felinos domésticos (Felis catus domesticus) são infectados por espécies do gênero Ehrlichia. Entretanto, a possibilidade desses animais se comportarem como reservatórios do agente (STUBBS et al., 2000), bem como fonte de infecção para outros animais, inclusive humanos, ainda vem sendo explorado (COUTO, 1998; PADDOCK e CHILDS, 2003). Ehrlichia spp. pertence à Ordem Rickettsiales e Família Anaplasmataceae (DUMLER et al., 2001). São parasitos intracelulares obrigatórios gram-negativos, que se situam em vacúolos citoplasmáticos de células hematopoiéticas maduras ou imaturas e células endoteliais nos hospedeiros vertebrados ou no intestino e glândula salivar dos hospedeiros artrópodes (GROVES et al., 1975; UNVER et al., 2001). Estes organismos se mantêm na natureza através de interações complexas entre vetores invertebrados e hospedeiros vertebrados (DUMLER et al., 2001; PADDOCK e CHILDS, 2003). Diversas espécies são apontadas como causadoras de erliquiose, como a Ehrlichia canis, responsável pela Erliquiose Monocítica Canina (EMC); E. chaffeensis, agente etiológico da Erliquiose Monocítica Humana (EMH); E. ewingii, agente da Erliquiose Granulocítica Canina (EGC) e Humana (EGH) (LITTLE, 2010) e E. ruminantium, agente de uma erliquiose de ruminantes africanos e caribenhos conhecida por Hidropericardite bovina (PETER et al., 2002), compreendendo espécies filogeneticamente relacionadas, porém genética e antigenicamente diferentes (YU et al., 2007).

14 14 A E. canis é a principal espécie circulante no Brasil, tendo o carrapato Rhipicephalus sanguineus envolvido na transmissão do agente em cães (LABRUNA e PEREIRA, 2001). Os ciclos naturais e o potencial desses artrópodes na transmissão de doenças em gatos domésticos não estão totalmente elucidados (AMYX e HUXSOLL, 1997). Não obstante, sabe-se que o carrapato R. sanguineus têm hábitos nidícolas (do latim nidi= ninho; cola= que permanece) e demonstra ampla distribuição geográfica urbana no Brasil, onde encontra condições favoráveis para o parasitismo e reprodução (LABRUNA e PEREIRA, 2001). Vista como agente causal de disfunções hematológicas em cães, a patogenia gerada pela infecção por E. canis em felinos domésticos não foi totalmente esclarecida e são escassos os relatos que discorrem no que se refere as alterações clínicas e laboratoriais manifestadas na erliquiose felina. Contudo, estudos sugerem que a erliquiose seja incluída no diagnóstico diferencial de gatos com presença de leucopenia, anemia e trombocitopenia associado à apatia e febre (BUORO et al., 1989; BOULOY et al., 1994; BEAUFILS et al., 1995; ALMOSNY e MASSARD, 1999). No tocante aos aspectos de saúde pública referente à infecção por bactérias do gênero Ehrlichia, no Brasil pouco se conhece sobre erliquiose humana. Porém, destaca-se a possibilidade de acometimento humano dessa enfermidade, já que por muitas vezes espécies de Ehrlichia foram relatadas circulando entre cães, gatos e seus ectoparasitos (DAGNONE et al., 2003; AGUIAR et al., 2007 a,b; OLIVEIRA et al., 2009). Ressaltando os casos frequentes de hemoparasitoses no cotidiano médico-veterinário, faz-se necessário não somente a caracterização do microrganismo, como também definir a patogenia ocasionada na espécie felina. Contudo, o presente estudo objetiva investigar a detecção de infecção causada por Ehlichia spp. em felinos domésticos da região metropolitana de Cuiabá, Mato Grosso. Diante disto, associar a infecção por Ehrlichia spp. com possíveis alterações clinico-laboratoriais.

15 15 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Erliquiose Felina Histórico A erliquiose felina foi inicialmente identificada na França por Charpentier e Groulade (1986), através de detecção de mórulas em células mononucleares do sangue, desde então, são crescentes os relatos de casos de infecção por Ehrlichia spp. em felinos domésticos. Sucessivos relatos foram descritos, por meio de inquéritos sorológicos, demonstrando diferentes soroprevalencias: 43% no sudeste da África (MATTHERWMAN et al., 1996); 8,3% na França (BONI et al., 1997); 10,6% na região central (AGUIRRE et al., 2004) e 17,9% na região nordeste (ORTUNÕ et al., 2005) da Espanha. No continente americano, o primeiro caso foi relatado no Colorado, Estados Unidos da América (BOULOY et al., 1994). Os animais apresentaram títulos de anticorpos para E. canis e Neorickettsia (Ehrlichia) risticii. Os autores acreditavam na ocasião, que a E. canis fosse patogênica para gatos e consideraram também a possibilidade de transmissão através da ingestão de roedores ou dos parasitos destes, uma vez que os felinos não apresentavam sinais clínicos nem mórulas circulantes (BOULOY et al., 1994). Também nos EUA, Stubbs et al. (2000) relataram a soroprevalência de 13,2% para E. canis, e em seguida, organismos extremamente similares a E. canis foram detectados através de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) em três gatos que apresentaram manifestações clinicas tais como, poliartrite, além de disfunções hematológicas (BREITSCHWERDT et al., 2002). A primeira descrição na América Latina ocorreu no Brasil, na cidade do Rio de Janeiro, por meio de observação de mórulas em células mono e polimorfonucleares em esfregaço sanguíneo de gatos que apresentaram febre e sintomas inespecíficos (ALMOSNY et al., 1998). Em Viçosa, Oliveira et al.

16 16 (2009) relataram a primeira detecção molecular de E. canis em gatos da América do Sul. Posteriormente, Braga et al. (2011) detectaram 1% e 5,5% de positividade nos testes de PCR (baseado no gene 16S rrna) e Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) respectivamente em gatos peridomiciliados da cidade de São Luís do Maranhão Agentes Etiológicos Ehrlichias são bactérias Gram-negativas, intracelulares obrigatórias, imóveis, de forma ovóide a elipsoidal, que residem em fagossomos de células hematopoiéticas, tais como monócitos, macrófagos, neutrófilos e células endoteliais (DUMLER et al., 2001) localizadas também em células do aparelho digestório, glândula salivar e hemolinfa de carrapatos (GROVES et al., 1975). Pertencem à ordem Rickettsiales, que está dividida em duas grandes famílias: Rickettsiaceae e Anaplasmataceae. Dumler et al. (2001) propuseram a nova classificação taxonômica desta ordem, ao utilizarem descobertas no campo de biologia molecular sobre os genes 16S rrna e groesl, bem como as características biológicas e antigênicas existentes nestes agentes. Sendo assim, a família Rickettsiaceae é composta pelos gêneros Rickettsia e Orientia, enquanto que a família Anaplasmataceae é composta pelos gêneros Ehrlichia, Anaplasma, Wolbachia e Neorickettsia. As mudanças também envolveram os gêneros Anaplasma, Ehrlichia e Neorickettsia. O gênero Anaplasma atualmente composto pelas espécies A. phagocytophilum (originada da reclassificação da E. equi, E. phagocytophila e do agente da erliquiose granulocitica humana), A. platys (outrora E. platys), A. bovis (antes E. bovis), A. marginale, A. centrale e A ovis. O gênero Neorickettsia, agora contempla as espécies Neorickettsia risticii e N. sennetsu, anteriormente denominadas por E. risticii e E. sennetsu, respectivamente. Além disso, a espécie denominada por Cowdria ruminantium foi transferida ao gênero Ehrlichia e passou a ser designada por E. ruminantium.

17 17 Atualmente, o gênero Ehrlichia é composto por seis espécies: E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris, E. ruminantium (DUMLER et al., 2001) e Ehrlichia IOE (Ixodes ovatus Ehrlichia) (SHIBATA et al., 2000). As espécies de Ehrlichia que naturalmente infectam felinos não foram totalmente caracterizadas, porém inclusões foram detectadas em monócitos, linfócitos e granulócitos de gatos com doença febril e trombocitopenia (SHAW et al., 2001). Por tempos, as doenças causadas por esses patógenos eram tradicionalmente categorizadas pelos tipos celulares aos quais parasitam. No entanto, algumas espécies de Ehrlichia e Anaplasma já foram encontradas em outras células, que não a de tropismo. Além disso, mais de um gênero ou espécie pode ser responsável pela erliquiose monocítica e granulocítica. Assim, o sistema de classificação tradicional baseado nas células invadidas, não pode ser considerado como um caráter descritivo definitivo dessas doenças. E. canis é o agente primário da erliquiose monocítica canina (EMC), sendo importante patógeno, responsável por provocar doença grave em cães. Sua prevalência está largamente associada à distribuição do vetor, R. sanguineus, encontrado principalmente em regiões tropicais e subtropicais (RODRIGUEZ-VIVAS et al., 2005). De acordo com a revisão bibliográfica realizada por Vieira et al. (2011), E. canis é considerada endêmica em cães de diversas regiões do Brasil. Apesar de alguns autores terem demonstrado a capacidade de transmissão desse agente a felinos domésticos (ALMOSNY e MASSARD, 1999; BREITSCHWERDT et al., 2002; OLIVEIRA et al. 2009; BRAGA et al., 2011) e selvagens (FILONI et al., 2006), esta infecção necessita ser melhor avaliada, principalmente devido a escassez de relatos científicos. Infecção por E. chaffeensis foi relatado em um felino doméstico do município de São Luís do Maranhão por Braga et al. (2011) através de PCR. Este agente é responsável pela erliquiose monocítica humana (HME), tendo como principal hospedeiro vertebrado e vetor, o cervídeo da cauda branca (Odocoileus virginianus) e Ammblyomma americanum respectivamente (WALKER et al., 1987), ambos de ocorrência norte-americana. No Pantanal Mato-grossense, uma nova espécie do gênero Ehrlichia foi relatada em onças (Phantera onca), apresentando 98% de similaridade à E. ruminantium (WIDMER et al., 2011), o que reforça a necessidade de mais

18 18 estudos na região para esclarecer a possibilidade desta nova espécie estar circulando entre outros animais da região como bovinos, cães e gatos domésticos Patogenia A patogenia da erliquiose felina permanece desconhecida. Baseado em achados clínicos, laboratoriais e radiográficos, acredita-se que a patogenia da doença se comporte como em cães (BREITSCHWERDT, 2004). A EMC envolve um período de incubação de 8-20 dias, seguida pela fase aguda, subclínica (assintomática) e às vezes, crônica (HARRUS et al., 1997). A fase aguda da E. canis dura de 2 a 4 semanas, quando o parasita é inoculado pelo vetor na corrente sanguínea e linfática e penetra em macrófagos do sistema fagocítico monocitário presentes em gânglios do fígado, baço e linfonodos, onde se replica por fissão binária. (HARRUS et al., 1997). Nas células infectadas, erliquia inibe a união do lisossomo com o vacúolo nos macrófagos impedindo a ativação dos mesmos, não induzindo a liberação de mediadores químicos, como a interleucina 1 e o fator de necrose tumoral. No entanto, os macrófagos podem ser ativados por estímulo exógenos, como aumento intracelular de íons cálcio e interferon gama (RIKIHISA, 1991). As células mononucleares infectadas disseminam a infecção para outros sistemas orgânicos, onde aparentemente interagem com as células endoteliais dos vasos de menor calibre, induzindo vasculite, ou resposta celular inflamatória perivascular, após a migração para o tecido subendotelial (HARRUS et al., 1997). A gravidade dos sinais clínicos variam na fase aguda, mas tendem a desaparecer espontaneamente, embora alguns cães possam permanecer com infecção subclínica, sendo o agente albergado no baço (HARRUS et al.,1997). A fase subclínica da erliquiose é associada com a persistência do organismo e aumento do título de anticorpos séricos, que começam a aparecer após 7 a 21 dias a infecção inicial, refletindo a ineficácia do sistema na eliminação do organismo intracelular (HOSKINS, 1991). Os achados hematológicos são

19 19 similares aos da fase aguda, associados à ausência de sinais clínicos (TROY & FORRESTER, 1999). Alguns cães imunocompetentes são capazes de eliminar a bactéria durante esta fase. Outros persistem com infecção crônica e podem desenvolver a forma mais grave da doença (HARRUS et al.,1997). De acordo com Codner e Farris-Smith (1986) a persistência da E. canis no interior da célula hospedeira conduz a uma reação de hipersensibilidade e resposta imunomediada, podendo acarretar em pancitopenia. A estimulação antigênica crônica produzida contra a infecção persistente pode também direcionar para doença glomerular imunomediada Sinais clinico-laboratoriais Alguns traços característicos da EMC, como febre, apatia, emagrecimento, anorexia, dores articulares e disfunções hematológicas (anemia normocítica e normocrômica, leucopenia, trombocitopenia) têm sido observados em casos de erliquiose felina (BUORO et al.,1989; ALMOSNY, 1999; BOULOY et al., 1994; BEAUFILS et al., 1995; OLIVEIRA et al., 2009). Entretanto, ainda não se sabe se a infecção por E. canis em gatos se comporta idêntica a EMC. Não há conhecimento de que gatos tornaram-se persistentemente infectados ou se desenvolveram implicações imunopatológicas como resultados de infecção crônica (SHAW et al., 2001) Transmissão e Ciclo Biológico Acredita-se que a maioria das espécies de Ehrlichia sp. sejam transmitidas por vetores artrópodes, porém em gatos, a rota de transmissão não foi estabelecida. Sabe-se que alguns agentes pertencentes à família Rickettsiaceae e Coxiella burnettii têm transmissão oral em gatos. Contudo, Peavy et al. (1997), discutiu a hipótese de que rotas orais de transmissão e

20 20 vetores artrópodes deveriam ser considerados na infecção por Ehrlichia sp. em felinos. Infestações por R. sanguineus em felinos domésticos já foram descritas no Brasil, nos municípios de Mossoró-RN (FERREIRA et al., 2009) e João Pessoa-PB (FERREIRA et al., 2010). Porém, a ausência de estudos que elucidam a transmissão de Ehrlichia spp. em felinos, nos limita a inferirr o carrapato R. sanguineus como vetor do agente em gatos. Os cães são considerados reservatórios para E. canis bem como para a manutenção do carrapato vetor primário, R. sanguineus. Grandes populações de R. sanguineus podem se estabelecer e sobreviver dentro das casas e canis, fornecendo uma fonte quase constante de infecção para os cães em ambientes com grande infestação (DANTAS-TORRES, 2008). Estágios imaturos dos carrapatos são infectados quando se alimentam em cães em fase bacteriêmica, as bactérias ingeridas são capazes de se multiplicar nos hemócitos e nas células das glândulas salivares e do intestino (SMITH et al., 1976). As erliquias são transmitidas transestadialmente, não havendo transmissão transovariana, consequentemente, larvas não podem transmitir a infecção (GROVES et al.,1975). A transmissão a partir do carrapato para cães susceptíveis pode ser realizada pelo menos por 155 dias após a infecção do carrapato. Outra importante forma de transmissão é a transfusão sanguínea (LEWIS et al., 1977). O ciclo de desenvolvimento da Ehrlichia sp. na célula hospedeira iniciase com a adesão de pequenas células densamente coradas, as quais penetram na célula. Dentro do vacúolo da célula hospedeira, as células densas se transformam rapidamente em células reticuladas. Estas se multiplicam por divisão binária, aproximadamente em 48 horas e, após 72 horas de infecção, maturam e transformam-se em células densas novamente. Em seguida, são liberadas da célula hospedeira e recomeçam um novo ciclo de infecção (ZHANG et al. 2006).

21 Diagnóstico Bonnard & Dralez (1990) afirmaram que os sintomas clínicos indicam a suspeita de Erliquiose, no entanto, o diagnóstico da infecção se torna impraticável sem o auxílio laboratorial, já que os sintomas são similares a diversas outras doenças infecciosas (OLIVEIRA et al., 2009). Segundo Swango et al. (1989), o diagnóstico é baseado na combinação do histórico, anamnese, achados clínicos, análises laboratoriais e exames post mortem. Contudo, diversas técnicas de diagnóstico estão disponíveis, tais como detecção direta (microscopia) do agente nas células hematopoiéticas infectadas ou em tecidos, isolamento em cultura celular, técnicas sorológicas como Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), Western immunoblot e Ensaio de Imunoabsorção por Ligação Enzimática (ELISA). A técnica molecular de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) demonstra elevada eficácia, sensibilidade e especificidade para diagnóstico da erliquiose (IQBAL et al., 1994; HARRUS e WANER, 2011). A citologia de esfregaço de sangue periférico baseia-se na identificação das mórulas nas células mononucleares infectadas, embora esta técnica ofereça o método mais rápido de diagnóstico, ela é considerada pouco sensível e raramente confirmatória na clínica prática (PADDOCK & CHILDS, 2003). A E. canis pode ser cultivada in vitro em células DH82 (dog histiocytosis), provenientes de monócitos caninos a partir de um caso de histiocitoma (WELLMAN et al., 1988). Entretanto, embora o isolamento do agente em cultura celular seja sensível e específico, este método é demorado e requer um nível de experiência técnica, dificultando o seu uso como diagnóstico de rotina. Quanto ao uso do ELISA e do western immunoblot, ambos apresentam elevada sensibilidade, sendo que este último tem sido utilizado para caracterizar e distinguir os diferentes agentes no caso de reação cruzada entre os patógenos da família Anaplasmataceae (HARRUS e WANER, 2011). A RIFI é considerada o teste padrão ouro para identificação e quantificação de anticorpos da classe IgG anti-e.canis, na qual títulos 40 indicam soropositividade (AGUIAR et al. 2007b; HARRUS e WANER, 2011). A RIFI é indicada para a detecção de casos mais crônicos, uma vez que a formação de

22 22 anticorpos inicia somente entre 1 a 3 semanas após a infecção (MCBRIDE et al., 1996). A PCR e o sequenciamento têm sido também utilizados para a detecção do agente, haja visto que torna possível a identificação de DNA de bactérias mesmo em amostras de culturas cito-negativas, e mesmo antes da formação de mórulas e da soroconversão (MCBRIDE et al., 1996). Harrus e Waner (2011) apontam várias vantagens na utilização dos métodos moleculares tanto pela PCR convencional quanto em tempo real, entre elas a detecção anterior à soroconversão, a maior sensibilidade do teste e a detecção do material genético do agente ao invés dos anticorpos, o que é fundamental para estabelecer a diferenciação entre infecção ativa e exposição. 2.2 Erliquiose Humana A Erliquiose Monocítica Humana (HME) e Erliquiose Granulocítica Humana (EGH) têm sido amplamente relatadas (OLANO e WALKER, 2002). Casos de HME causadas por E. chaffeensis foram descritas na América do Norte, Ásia, Europa e em alguns países da América Latina, incluindo Argentina (RIPOLL et al., 1999), Chile (LÓPEZ et al., 2003) e Peru (MORO et al., 2009). No Brasil evidências sorológicas têm sido relatadas no estado de Minas Gerais (CALIC et al, 2004). A ocorrência de infecção por E. chaffeensis foi descrita pela primeira vez em humanos por Anderson et al. (1991), a partir do isolamento e PCR de amostras de sangue de pacientes com histórico clínico compatível com erliquiose. HME geralmente manifesta como doença moderada a severa e aproximadamente 60 a 70% dos pacientes com casos sérios têm sido hospitalizados. Em alguns pacientes, a doença não tratada pode progredir rapidamente até a morte (PADDOCK & CHILDS, 2003). A. phagocytophilum, antes classificado como E. phagocytophila, é o agente causador da HGE. E. ewingii foi reconhecida como agente de infecção humana em 1999 em várias regiões dos Estados Unidos. Esta bactéria é similar sorologicamente a E. chaffeensis, mas semelhante a A.

23 23 phagocytophilum, propagando-se dentro de neutrófilos (BULLER et al., 1999). Pessoas imunodeprimidas possuem maior risco de desenvolver EGH, cujo curso é semelhante ao causado pelas demais espécies do gênero e caracterizada por febre, dor de cabeça, trombocitopenia, com ou sem leucopenia (PADDOCK et al., 2001). Além das espécies supracitadas, Perez et al. (1996) isolaram uma erliquia de um paciente humano aparentemente saudável na Venezuela denominado o isolado de VHE (Venezuela Human Ehrlichia). O isolado apresentou morfologia ultraestrutural compatível com E. canis, E. chaffeensis e E. muris. Entretanto, a sequência do gene 16S rrna deste isolado foi similar (99,9%) às sequências de E. canis Florida e E. canis Oklahoma. Contudo, os pesquisadores sugeriram que VHE é uma nova cepa ou subespécie de E. canis que causava uma infecção subclínica crônica em humanos. Em 2001, estudos realizados na mesma região geográfica compararam as estruturas moleculares e antigênicas do isolado VHE com isolados de E. canis de cães e carrapatos. Baseados na análise da sequência do gene 16S rrna e na análise de Western immunoblot, a E. canis isolada de cães e carrapatos foram idênticas ao isolado VHE, sugerindo que a mesma cepa de E. canis é responsável por ambas EMC e HME na Venezuela (UNVER et al., 2001). Posteriormente, mais seis casos de pacientes humanos infectados com E. canis na Venezuela foram relatados. Nesses casos, os pacientes apresentavam sintomas compatíveis com a HME (PEREZ et al., 2006). Diniz et al. (2007) desenvolveram a primeira investigação epidemiológica em cães como sentinelas para múltiplos organismos vetores, a fim de avaliar a potencial de infecção humana por estes agentes na região sudeste do Brasil, e os resultados apontaram um risco potencial para a exposição humana, nos locais onde há cães infectados.

24 24 3 MATERIAL E MÉTODOS 3. 1 Local de estudo O estudo foi realizado nos municípios de Cuiabá e Várzea Grande, localizados no centro-sul do Estado de Mato Grosso, nas coordenadas geográficas: 15º35'56'' de latitude sul e 56º06'01'' de longitude oeste e de latitude sul e de longitude oeste, respectivamente (Figura 1), e altitude média de 165m. Ambos fazem parte da região metropolitana de Cuiabá, MT. A região apresenta clima tropical quente e subúmido, com precipitação média anual de 1750 mm. A temperatura máxima, nos meses mais quentes, é de aproximadamente 43 C e a mínima varia entre 12 e 14ºC. Os municípios possuem, juntos, uma população estimada de habitantes (IBGE, 2010). BRAZIL Figura 1: Localização dos municípios de Cuiabá e Várzea Grande, MT. Cuiabá, 2013.

25 Amostragem Durante os meses de maio a dezembro de 2011, amostras de sangue de felinos domésticos foram coletadas de um Abrigo de Animais (n=31) e dos Centros de Controle de Zoonoses (CCZ) de Cuiabá (n=23) e Várzea Grande (n=65). Amostras de sangue recebidas para avaliação hematológica no Laboratório de Patologia Clínica do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso (HOVET-UFMT) (n=93) também foram analisadas, totalizando em 212 gatos amostrados. A colheita de sangue foi realizada por meio de venopunção da jugular externa com agulha 0,25 mm x 0,8 mm, sendo em seguida acondicionadas em tubos sem e com EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid). Os tubos foram devidamente identificados, acondicionados em caixas de térmicas sob refrigeração e transportados ao Laboratório de Virologia e Rickettsioses do HOVET-UFMT. Para a obtenção de soro, as amostras foram centrifugadas a 1000g por 5 minutos. O soro e o sangue total foram armazenados em microtubos, identificados, separados em alíquotas e refrigerados a -20 C até a realização dos testes. Os animais foram classificados quanto ao sexo e a faixa etária. Baseados na arcada dentária, animais com massa corpórea inferior a 1,5 kg foram considerados jovens e superiores ou iguais a 1,5 kg foram considerados adultos (SHARIF et al., 2007). Dados como anamnese, e resultados de exames clínicos e laboratoriais foram recolhidos dos prontuários dos animais avaliados do HOVET-UFMT. 3.3 Reação de Imunofluorescência Indireta A Reação de Imunofluorescência Indireta foi realizada a partir de células DH82 infectadas com a cepa São Paulo de E. canis oriundas do Laboratório de Virologia e Rickettsioses da HOVET-UFMT.

26 26 Os soros foram diluídos inicialmente a 1:40 (AGUIRRE et al., 2004) em PBS (ph 7,2) com 1% de soroalbumina bovina, e aplicadas em lâminas contendo antígeno previamente fixado. Em cada lâmina foram incluídos soros controles não reativo (controle negativo) e soro reativo (controle positivo). Após aplicação das amostras, as lâminas foram incubadas por 30 minutos a 37ºC em câmara úmida, seguida por lavagem em solução salina tamponada - PBS (ph 7,2). Depois da secagem em temperatura ambiente, foi adicionado conjugado de cabra anti-igg de felino (Sigma Diagnostics, St. Louis, EUA) na diluição de 1:1000. As lâminas foram novamente incubadas a 37ºC por 30 minutos em câmara úmida, lavadas em PBS (ph 7,2) por 10 minutos e submetidas a secagem. Posteriormente, adicionou-se glicerina nas lâminas (ph 8,5) que foram examinadas em microscópio (objetiva de 40x) de epifluorescência. As amostras consideradas positivas passaram por sucessivas diluições na razão dois com objetivo de obter o título final. 3.4 Extração de DNA A extração de DNA do sangue total foi realizada através do kit comercial Axyprep Blood Genomic DNA Miniprep (Axygen Biosciences, Hangzhou, China) conforme as instruções do fabricante. O DNA extraído foi então identificado e armazenado a -20ºC até a realização da PCR. 3.5 Reação em Cadeia pela Polimerase A técnica de Reação em Cadeia pela Polimerase visou à amplificação de um fragmento de 409-pb do gene dsb de Ehrlichia, utilizando-se uma PCR contendo: ng de DNA; 0,2 mm de cada nucleotídeo datp, dttp, dctp e dgtp (Promega ); 0,4 µm de cada iniciador (primer) dsb: dsb-330 (5 - GAT GAT GTC TGA AGA TAT GAA ACA AAT-3 ) e dsb-728 (5 - CTGCTCGTCTATTTTACTTCTTAAAGT-3 ); 1,25 U de Taq Polimerase

27 27 (Platinum Taq DNA polymerase Invitrogem); solução tampão (ph 8,4) contendo 50 mm de KCl; 20 mm Tris-HCl e 3 mm de MgCl 2 (DOYLE et al., 2005). O volume foi completado com água MilliQ autoclavada para completar 50 µl e a amplificação foi efetuada em termociclador automático (MULTIGENE MINI24 - Labnet International Inc.). Em cada reação foi utilizado controle positivo (DNA extraído a partir de cultivo celulare da cepa E. canis São Paulo) e controle negativo (água MilliQ) a fim de avaliar possíveis contaminações. Inicialmente, as amostras foram desnaturadas a 95ºC por dois minutos, seguida de uma sequência de 50 ciclos repetidos de 15 segundos a 95ºC, 30 segundos a 58ºC e 30 segundos a 72ºC, seguidos de cinco minutos de extensão final a 72ºC. A amplificação resultante das reações foi visualizada em Gel de Agarose a 1,5% com tampão de corrida TBE 1X ph 8,0 (44,58 MTrisbase; 0,44 M ácido bórico; 12,49 mm EDTA) à 120v/60mA. Após a corrida, o gel foi corado com brometo de etídio (0,5µl/ml Invitrogen ) e visualizado sob luz ultravioleta (UV) em câmara escura. 3.6 Purificação e Sequenciamento Os produtos amplificados foram purificados com o kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Bio-Sciences) segundo instruções do fabricante, em seguida, submetidos ao sequenciamento genético utilizando Big Dye (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante, em sequenciador automático de DNA modelo ABI PRISM-310 Genetic Analyzer (Applied Biosystens/Perkin Elmer). As sequências obtidas foram editadas no software BioEdit (Ibis Biosciences, Carlsband, CA) e posteriormente analisada através do programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) a fim de verificar a identidade com demais seqüências correspondentes disponíveis no GenBank.

28 Análise Estatística Dos 212 felinos avaliados, foram realizados estudos de associações entre faixa etária, sexo e origem do animal com a positividade para Ehrlichia spp. constatada pela PCR e RIFI. Dos felinos atendidos no HOVET-UFMT (n=93), além das variáveis obtidas durante anamnese, exames clínicos e laboratoriais também foram submetidas ao estudo de associação Para melhor avaliação dos resultados obtidos no teste sorológico, as mesmas variáveis foram analisadas segundo os títulos de anticorpos apresentados na RIFI: baixos títulos (40 a 640) e altos títulos (1.280 a ). Todas as análises foram realizadas pelo teste do Qui-Quadrado (χ 2 ) ou pelo teste exato de Fischer quando necessário com uso do software estatístico EPIINFO RESULTADOS 4.1 Gatos Um total de 212 felinos foram avaliados neste estudo, os quais 102 (48,1%) se tratavam de fêmeas e 110 de (51,9%) machos. Quanto à faixa etária, 59 (28,6%) eram jovens e 147 (71,4%) eram adultos. Não foi obtida informações a respeito da faixa etária de seis gatos. Durante a coleta de material biológico dos animais, não foram visualizados infestações por carrapatos.

29 Reação de Imunofluorescência Indireta No teste sorológico, 88 (41,5%) gatos foram soro-reagentes para E. canis, dos quais 42 de 93 eram procedentes do HOVET-UFMT, 3 de 23 do CCZ de Cuiabá, 27 de 65 do CCZ de Várzea Grande e 16 de 31 do abrigo de animais. Vinte e seis (30,6%) gatos positivos foram considerados jovens e 59 (69,4%) adultos, 45 (51,1%) eram fêmeas e 43 (48,9%) eram machos. Os títulos de anticorpos reagentes contra E. canis variaram de 40 à (Tabela 1). Tabela 1- Frequência de títulos observados em gatos positivos para Ehrlichia spp. através de Reação de Imunofluorescência Indireta. Cuiabá, MT Títulos Número de gatos % ,2% ,0% Baixos ,2% ,0% ,0% ,3% % Altos % ,1% % ,1%

30 Reação em Cadeia pela Polimerase Vinte (9,4%) gatos foram positivos para Ehrlichia spp. através da PCR. De acordo com a origem dos animais, 8 de 93 eram provenientes do HOVET- UFMT, 1 de 23 do CCZ de Cuiabá e 11 de 65 do CCZ de Várzea Grande. Não foi observada positividade em felinos do abrigo. Relativo à faixa etária dos gatos positivos, 8 (40%) eram jovens e 12 (60%) adultos, quanto ao gênero, ambos foram positivos na mesma proporção (50%). Doze dos vinte gatos positivos pela PCR também foram positivos pela RIFI. 4.4 Sequenciamento Genético Sequências parciais de 300 nucleotídeos de cada uma das 20 amostras geradas neste estudo foram idênticas entre si e entre as sequências de E. canis Uberlândia (GU586135) e E. canis str. Jake (CP000107), depositadas no Genbank. 4.5 Achados Clinico-laboratoriais Nos exames clínico-laboratoriais dos gatos avaliados no HOVET-UFMT, foram observados sinais clínicos e alterações laboratoriais palidez das mucosas, linfadenomegalia, anemia, monocitose, linfopenia e trombocitopenia.

31 Análises estatísticas A positividade para Ehrlichia spp. através dos testes de PCR e RIFI foram avaliadas frente as variáveis: faixa etária, sexo e origem dos gatos amostrados. Não houve associação significativa quando analisados faixa etária e sexo (p>0,05). O resultado das análises estatísticas avaliando origem dos gatos está apresentado na Tabela 2. Tabela 2- Associação entre os locais de origem dos felinos e os resultados da Origem Nº de gatos PCR RIFI testados Gatos positivos %* Gatos positivos %* Hovet/ UFMT ,6 a 42 45,1 a CCZ - Cuiabá CCZ - Várzea Grande ,3 a 3 13,0 b ,9 a,b 27 41,5 a Abrigo a,c 16 51,6 a Total , ,5 Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR). Cuiabá, MT * Letras diferentes na mesma coluna indica P<0,05 Os resultados do testes de associação entre a RIFI e as avaliações clínico laboratoriais estão descritos na Tabela 3. Somente palidez das mucosas foi associada à soropositividade (p<0,05). No entanto, quando os títulos foram classificados em baixos e altos, somente a baixa contagem de eritrócitos foi associada aos baixos títulos de anticorpos (p<0,05).

32 32 Tabela 3 - Associação entre os achados clínico-laboratoriais e os resultados da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) dos animais atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso. Cuiabá, MT Achados clínicos e laboratoriais Mucosas Normais Pálidas Linfadenomegalia Ausente Presente * Eritrócitos < 5.5 x10 6 /mm x10 6 /mm 3 > 10 x10 6 /mm 3 * Leucócitos < 5.5 x10 3 /mm x10 3 /mm 3 > 19.5 x10 3 /mm 3 * Monócitos x 10 3 /mm³ > 0.8 x 10³/mm³ * Plaquetas < 300 x10 3 /mm x10 3 /mm 3 > 800 x10 3 /mm 3 * Linfócitos < 1.1 x10 3 /mm x10 3 /mm 3 > 10.7 x10 3 /mm 3 RIFI n Positivos % Valor de p * Valores de Referências (Jain, 1993) A Tabela 4 apresenta os resultados de testes de associação de acordo com a PCR e as avaliações clínico laboratoriais. Nenhuma das variáveis foi associada com a positividade para Ehrlichia spp. através de PCR, no entanto, houve uma tendência à linfopenia em gatos positivos.

33 33 Tabela 4 - Associação entre achados clínico-laboratoriais e os resultados da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) dos animais atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso. Cuiabá, MT Achados clínicos e PCR laboratoriais n Positivos % Valor de p Mucosas Normais Pálidas Linfadenomegalia Ausente 0.14 Presente * Eritrócitos < 5.5 x10 6 /mm x10 6 /mm 3 > 10 x10 6 /mm 3 * Leucócitos < 5.5 x10 3 /mm x10 3 /mm 3 > 19.5 x10 3 /mm 3 * Monócitos x 10 3 /mm³ > 0.8 x 10³/mm³ * Plaquetas < 300 x10 3 /mm x10 3 /mm 3 > 800 x10 3 /mm * Linfócitos < 1.1 x10 3 /mm x10 3 /mm 3 62 > 10.7 x10 3 /mm 3 0 * Valores de Referências (Jain 1993) DISCUSSÃO O presente estudo relata a primeira detecção molecular e sorológica de E. canis em felinos domésticos da região Centro-Oeste do Brasil, mais precisamente na região metropolitana de Cuiabá, Mato Grosso. De maneira geral, a frequência de anticorpos anti-ehrlichia canis (41,5%) e de DNA erliquial (9,4%) encontrada neste trabalho é a maior já detectada no país.

34 34 A soroprevalência detectada evidencia a exposição da população felina desta região à Ehrlichia spp., no entanto a ocorrência de reação cruzada com outros agentes da família Anaplasmataceae não pode ser descartada (WEN et al., 1997). Mediante ao fato, amostras de DNA amplificado analisadas por reação de sequenciamento foram idênticas às sequencias de E. canis depositadas no GenBank, corroborando com os achados de Oliveira et al. (2009), que também relataram identidade às sequencias de E. canis, inclusive quando comparadas às sequencias obtidas de um estudo realizado em cães, na mesma área (OLIVEIRA, 2009), sugerindo a possibilidade de que uma mesma cepa de E. canis estaria infectando cães e gatos. Em estudo desenvolvido com DNA de Ehrlichia spp. obtido por nested PCR, Braga et al. (2011) demonstrou 98% de similaridade com cepas de E. canis oriundas de cães da Tunísia (EU781695), Taiwan (EU143637) e Itália (EU439944). Outra sequência obtida foi 97% similar à E. chaffeensis (Arkansas - AF416764), Ehrlichia sp. de Rhipicephalus (Boophilus) microplus do Tibet (AF414399) e Ehrlichia sp. de cervídeos do Japão (AB454074). No presente estudo, apenas E. canis foi detectado nos gatos na região metropolitana de Cuiabá, MT. No Brasil, os estudos acerca da erliquiose felina são poucos, apesar das altas taxas de infecção em cães. Silva et al. (2010) demonstraram que a soroprevalência de anticorpos anti-e. canis em cães de Cuiabá foi de 42,5%, a qual se assemelha a do presente estudo. Entretanto, a proporção de gatos positivos para E. canis pela PCR foi inferior à diagnosticada em cães no Laboratório de Virologia e Rickettsioses do HOVET-UFMT, ao redor de 33% (Comunicação pessoal, AGUIAR, 2012). Não obstante, os resultados destacam a infecção por E. canis na população de felinos da região metropolitana de Cuiabá, reconhecida como endêmica para E. canis (SILVA et al., 2010; ALMEIDA et al., 2012; MELO et al., 2011). Segundo Trapp et al. (2002) o parasitismo por R. sanguineus é considerado um fator de risco para a erliquiose canina. Em casos de erliquiose felina desconhece-se essa informação, porém sabe-se que a exposição a carrapatos tem sido reportada em cerca de 30% dos casos da doença (LAPPIN, 2001). Ainda assim, o tempo de exposição a esses vetores é menor

35 35 quando comparado aos cães (BREITSCHWERDT et al., 2002), fato frequente, devido ao hábito felino de se lamber, removendo os carrapatos. Esta característica higiênico-profilática felina pode justificar a ausência de parasitismo por R. sanguineus no presente estudo. Devido à ausência de carrapatos e a alta freqüência de gatos positivos para Ehrlichia spp. pela PCR e RIFI, sugere-se a possibilidade de que outros vetores, como pulgas, atue na transmissão do agente em felinos. Contudo, como a prevalência da infecção por E. canis está intimamente associada à distribuição do vetor R. sanguineus (RODRIGUEZ-VIVAS et al., 2005), e tendo sido constatado DNA de E. canis nesta espécie de carrapato na região do presente estudo (ALMEIDA et al., 2012), a transmissão por essa espécie de ixodídeo não pode ser descartada. A avaliação conduzida nos felinos oriundos do HOVET-UFMT positivos para E. canis pela PCR demonstrou que grande parte da população estudada apresentava trombocitopenia, corroborando o achado de Oliveira et al. (2009). Entretanto, este resultado não foi confirmado estatisticamente. Na EMC, a trombocitopenia é resultado de hipoplasia megacariocítica e de redução do tempo de vida das plaquetas, em consequência de alterações inflamatórias imuno-mediadas e/ou por disfunção dos mecanismos de coagulação (TROY e FORRESTER, 1999). Outros fatores, no entanto, podem ser responsáveis por causar trombocitopenia em felinos como doenças auto-imunes, neoplasias metastáticas ou hematológicas, doenças infecciosas (FeLV e FIV) e infecções por protozoários (Leishmaniose e Babesiose) (FERREIRA NETO et al., 1981). Adicionalmente, observou-se tendência à linfopenia em gatos positivos pela PCR (p = 0,07) e este achado é comumente relatado nos cães durante a fase aguda da infecção (HARRUS et al., 1997). Nesta fase, alteração como linfadenomegalia também é observado frequentemente devido à reativa hiperplasia linfóide induzida pela doença (TROY e FORRESTER, 1999) o que sustenta nosso achado em gatos positivos pela PCR. Uma maior proporção de animais soropositivos apresentou resultados negativos pela PCR, demonstrando ausência de E. canis no sangue periférico naquele momento. Em cães, sabe-se que durante as fases subclínica e crônica da doença, a bactéria pode não ser encontrada no sangue periférico, pelo provável sequestro realizado pelo baço e tecidos linfóides ou mesmo devido

36 36 aos baixos números de cópias de DNA da bactéria circulante (HARRUS et al., 1998; EBERHARDT et al., 2006). Por outro lado, pouco se conhece sobre a dinâmica da infecção por E. canis em gatos, portanto qualquer suposição a cerca de rickettsemia em gatos seria algo meramente especulativo. Com base na anamnese dos felinos proveniente do HOVET-UFMT, observou-se uma maior proporção de gatos sororeativos para E. canis, associados a palidez das mucosas (p = 0,02). Animais soropositivos que apresentaram baixos títulos de anticorpos (40 a 640) foram associados a baixas contagens de eritrócitos, o que justifica a palidez das mucosas. A atuação do sistema fagocítico monocitário, a lise das células pela ação do sistema complemento e a supressão da eritropoiese na medula óssea são identificados como mecanismos responsáveis pela anemia na infecção crônica por E. canis em cães (HARRUS et al., 1999). Ao contrário da EMC, pouco se conhece a cerca da patogênese ou das implicações imunopatológicas resultante de infecção crônica em gatos (SHAW et al., 2001), de modo que não é apropriado inferir que tais animais estavam cursando a fase crônica da infecção. Doze dos vinte gatos positivos pela PCR também se apresentaram sororeativos pela RIFI, apresentando baixos títulos com exceção de um felino, presumindo que esses animais possivelmente estavam cursando a fase aguda ou assintomática paralelamente com o período de soroconversão. Outra possível hipótese seria que esses animais estariam cursando um período de recrudescência, em conseqüência da imunossupressão. Wen et al. (1997) afirma que a combinação dos testes de RIFI e PCR podem ser usados como instrumento diagnóstico da erliquiose, uma vez que fornece um melhor compreensão das fases de infecção. Do total de animais avaliados, nenhuma associação foi estabelecida entre a positividade de ambos os testes e as variáveis referentes à faixa etária e sexo. Resultados similares quanto a faixa etária foram relatados por Stubbs et al. (2000), por outro lado, houve discordância no que se refere a gênero, pois maiores taxas de infecção foram descritas predominantemente em fêmeas. De acordo com os resultados do presente estudo, a infecção por E. canis ocorre na mesma proporção em relação a idade e sexo, minimizando o efeito do comportamento social na epidemiologia da infecção na região estudada.

37 37 Quando analisado a origem dos gatos em relação à infecção, animais oriundos do CCZ de Várzea Grande apresentaram maior frequência de gatos positivos pela PCR e a segunda maior frequência de anticorpos anti-e.canis, revelando possivelmente características peculiares à área, qual expõe esses animais à infecção. Gatos do abrigo apresentaram maior frequência de anticorpos anti-e. canis, supondo que estes animais foram mais expostos ao agente. Ressalta-se que no abrigo, muitas vezes os felinos permaneciam em contato com cães. Em contrapartida, gatos do CCZ de Cuiabá apresentaram frequência de anticorpos anti-e. canis menores que os demais locais avaliados. Este trabalho destaca a presença de E. canis circulando na população de gatos da região metropolitana de Cuiabá, contribuindo com os demais estudos que sugerem a participação do felino doméstico como reservatório da E. canis. Adicionalmente, o presente estudo fornece subsídios clínico médico veterinário, ressaltando a inclusão da erliquiose felina como diagnóstico diferencial em gatos anêmicos, linfopênicos e trombocitopênicos, principalmente em áreas endêmicas para E. canis. Ao mesmo tempo, nossos resultados reforçam a necessidade de novas pesquisas a respeito da epidemiologia e da dinâmica da infecção em felinos domésticos.