Lista de Abreviaturas

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1 i Lista de Abreviaturas aa Aminoácido ABV Adraímicina, bleomicina e vincristina ACTG AIDS Clinical Trial Group Ag Antígeno aids Síndrome da Imunodeficiência Adquirida BC-1 Linhagem celular de fluido ascítico humano duplamente infectada pelo EBV e HHV-8 BC-3 Linhagem celular de fluido ascítico humano infectada pelo HHV-8 BCBL Body Cavity-Based Lymphoma linfoma de células B com efusão em cavidades BCBL-1 Linhagem celular obtida de linfoma de células B com efusão em cavidades Bcl-2 B-cell leukemia/lymphoma-2 BCP-1 Linhagem celular de sangue periférico humano infectada pelo HHV-8 bp Pares de bases nitrogenadas "base pair" CDC Center for Diseases Control and Prevention, Atlanta, EUA CD4+ Linfócito T CD4 positivo CS Grupo controle sadio CMV Citomegalovirus CV Carga viral DEPC Dietilpirocarbonato DMSO Dimetilsufóxido DNA Ácido desoxirribonucléico DNAse Enzima DNAse dntps Deoxinucleosides triphosphates DST Doenças sexualmente transmissíveis EBV Vírus Epstein Barr EBNA-1 Antígeno nuclear de virus Epstein Barr EDTA Etileno diamino tetracético ácido ELISA Ensaios imunoenzimáticos Enzyme Linked Immunosorbent Assay EtBr Brometo de etídio FLICE Fas-associated death domain-like interleukin-1(β) converting enzyme FLIP Proteína inibitória da FLICE FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo g Força centrífuga GPCR Receptor acoplado da proteína G HAART "Highly active antiretroviral therapy", terapia antiretroviral combinada Hae III Haemophilus aegiptius HHV-6 Herpesvirus humano tipo 6 "Human herpesvirus 6" HHV-8 Herpesvírus humano tipo 8 "Human herpesvirus 8" Hinf I Haemophilus influenzae HIV Vírus da Imunodeficiência Humana HIV/aids Grupo de pacientes infectado pelo HIV sem SK HIS Hibridização in situ HSH Homens que fazem sexo com homens HSV Vírus herpes simplex IAL Instituto Adolfo Lutz IF Imunofluorescência IFI- Imunofluorescência indireta ao Ag-LANA de HHV-8 LANA

2 ii IFI-Lítico Imunofluorescência indireta ao Ag-Lítico do HHV-8 IFN Interferon IL-6 Interleucina 6 IP Inibidor de Protease IRD Internal Repeat Domain IIER Instituto de Infectologia Emílio Ribas Kb Quilo pares de bases nitrogenadas KDa Quilo Dalton KS-1 Linhagem celular de fluido ascítico humano infectada pelo HHV-8 KSHV Kaposi s sarcoma herpesvirus LNA-1 Antígeno nuclear relacionado à latência tipo 1 LANA Antígeno nuclear relacionado à latência do vírus HHV-8 LUR long unique region M marker M Molar MCD- Multicentric Castleman s disease associada ao HIV HIV mg Miligrama ml Mililitro mm Milimolar MM Mieloma Múltiplo mn Mononuclear Mse I Micrococcus species N Normal ng Nanograma nm Nanômetro nm Nanomol Nsi I Neisseria sicca OR odds ratio - Razão de chances Nt Nucleotídeo ORF Open reading frame - região aberta de leitura pb Pares de bases p53 Proteína de 53 KDa PBS Solução salina tamponada com fosfato PCR polymerase chain reaction - reação em cadeia da polimerase PEL primary effusion lymphoma - linfoma de efusão em cavidades PH Concentração hidrogênio-iônica PHLS Public Health Laboratory Service of London pm Picomol PM Peso Molecular PMA Phorbol myristate acetate QT Quimioterapia RDA Representational Difference Analysis RFLP restriction fragment length polymorphism RNA Ácido ribonucléico RNAm Acido ribonucléico mensageiro SINAN Sistema de Informações de Agravos de Notificação SDS Dodecil sulfato de sódio SDS- Dodecil sulfato de sódio - Eletroforese em gel de poliacrilamida PAGE SK Sarcoma de Kaposi SK/aids Grupo de pacientes com Sarcoma de Kaposi associado à infecção HIV/aids

3 iii SK Grupo de pacientes com SK Clássico class. SPSS Statistical Package for Social Sciences TAE Tampão TRIS-acetato EDTA Taq I Thermus aquaticus tat Proteína transativadora do HIV TE Tampão TRIS-HCl EDTA Th2 Resposta de célula T tipo 2 TNF-α Fator de necrose tumoral- alfa TR terminal repeat ou regiões repetitivas Tris-HCl Tampão Tris-ácido clorídrico UDI Usuário de droga intravenosa UV Ultra violeta V Volts v/v Volume a volume vbcl-2 viral B-cell leukemia/lymphoma-2 vcyc Ciclina D viral homóloga VEGF vascular endothelial growth factor vflip Proteína viral inibitória da FLICE vgpcr Receptor acoplado a proteína G viral virf-1 Interferon viral vil-6 Interleucina 6 viral vmip- I,II,III Proteínas virais inflamatórias semelhantes às de macrófagos tipos I, II e III vncam Molécula de adesão viral vp 16 Proteína de capsídeo viral de 16 KDa VR1 Região hipervariável 1 VR2 Região hipervariável 2 WB Western blot λ Comprimento de onda lambda g Microgramas L Microlitros M Micromoles

4 iv Lista de Figuras Figura I Representação esquemática do HHV-8 06 Figura II - Aspecto morfológico de partículas completas do HHV-8 07 Figura III - Representação esquemática do genoma do HHV-8 08 Figura IV - A Representação esquemática das proteínas expressas pela célula infectada pelo HHV-8; B Representação esquemática do mecanismo da patogênese do SK (A e B) Figura V- Amostras representativas do rendimento de DNA obtido com a técnica de extração com fenol/clorofórmio, de diferentes espécimes biológicos, quando submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,2% Figura VI - Amostras representativas do padrão eletroforético de produtos de PCR de beta-globina humana (banda de 268 pb) em gel de agarose a 2,0% Figura VII - Localização das ORFs K1, 25, 26, K8.1 e 73 no genoma de HHV-8 Figura VIII - Amostras representativas dos produtos de PCR nested da ORF 26 do genoma do HHV-8 (banda de 211 pb), quando submetidos a eletroforese em gel de agarose a 2%, corado com EtBr Figura IX - Amostras representativas dos produtos de PCR nested da ORF K1 do genoma do HHV-8 (banda de 247 pb), quando submetidos a eletroforese em gel de agarose a 2%, corado com EtBr Figura X - Amostras representativas dos produtos de PCR nested das ORFs K8.1, 73 e 25 do genoma do HHV-8 (bandas de 537, 547 e 213 pb, respectivamente) quando submetidos a eletroforese em gel de agarose a 2%, corado com EtBr Figura XI - Perfil de restrição enzimática obtido com a PCR-RFLP de produtos da ORF K1 (VR1) de HHV-8, subtipos A, B e C, quando submetidos ao SDS-PAGE Figura XII - Perfil de restrição enzimática obtido com a PCR- RFLP de HHV-8, subtipo E, quando submetidos ao SDS-PAGE Figura XIII - Padrão de fluorescência observado no ensaio de imunofluorescência indireta para pesquisa de anticorpos dirigidos a antígenos de fase latente (IFI-LANA) e lítica do HHV-8 (IFI- Lítico) utilizando células BCBL-1 latentemente infectadas (A), estimuladas com forbol éster (B), soro de paciente com sarcoma de Kaposi e controle negativo (C)

5 v Lista de Gráficos Gráfico 1- Gráfico representativo da distribuição de freqüências e proporções dos resultados de PCR positivos em sangue, segundo o Grupo e as ORFs avaliadas Gráfico 2 - Gráfico representativo da distribuição de freqüências e proporções dos resultados de PCR positivos em saliva, segundo Grupo e as ORFs avaliadas Gráfico 3 - Gráfico representativo de freqüências e proporções dos resultados de PCR positivos em Urina, segundo o Grupo e as ORFs avaliadas Gráfico 4 - Gráfico representativo de freqüências e proporções dos resultados positivos em Biópsia, segundo Grupo e as ORFs avaliadas Gráfico 5 - Gráfico representativo do número de cepas de HHV-8 dos subtipos A, B, C e E, detectadas pela técnica de PCR-RFLP da casuística em estudo

6 vi Lista de Tabelas Tabela 1 - Distribuição de freqüência e proporção de algumas variáveis categorizadas como dicotômicas para os casos pertencentes ao grupo SK/aids (n=76) Tabela 2 - Média e desvio padrão de algumas variáveis contínuas do grupo SK/aids (n=76) Tabela 3 - Distribuição das freqüência e proporção de casos para algumas variáveis laboratoriais obtidas no grupo HIV/aids (n=19) Tabela 4 - Média e desvio padrão de algumas variáveis contínuas do grupo HIV/aids (n=19) Tabela 5 - Distribuição das freqüências e proporções dos resultados obtidos com as PCRs em sangue, segundo o Grupo e as Combinações das ORFs Tabela 6 - Distribuição das freqüências e proporções dos resultados obtidos com as PCRs em Saliva, segundo Grupo e as Combinações das ORFs Tabela 7 - Distribuição das freqüências e proporções dos resultados obtidos com as PCRs em Urina, segundo Grupo e as Combinações das ORFs Tabela 8 - Distribuição das freqüências e proporções dos resultados nas PCRs em Biópsia, segundo Grupo e Combinações das ORFs. Tabela 9 - Distribuição das freqüências e proporções de resultados POSITIVOS em sangue, segundo o Grupo e as ORFs avaliadas Tabela 10 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações das ORFs dentro dos GRUPOS SK/aids e HIV/aids para sangue Tabela 11 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações das ORFs entre os GRUPOS SK/aids e HIV/aids para sangue Tabela 12 - Distribuição das freqüências e proporções de resultados POSITIVOS em Saliva, segundo o Grupo e as ORFs avaliadas Tabela 13 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações das ORFs dentro dos GRUPOS SK/aids e HIV/aids para SALIVA Tabela 14 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações das ORFs entre os GRUPOS SK/aids e HIV/aids para SALIVA Tabela 15 - Distribuição de freqüências e proporções dos resultados positivos em Urina, segundo o Grupo e as ORFs avaliadas

7 vii Tabela 16 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações das ORFs dentro dos GRUPOS SK/aids e HIV/aids para URINA Tabela 17 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações das ORFs entre os GRUPOS SK/aids e HIV/aids para URINA Tabela 18 - Distribuição das freqüências e proporções dos resultados positivos em Biópsia, segundo o Grupo e as ORFs avaliadas Tabela 19 - Nível descritivo (p-valor) referente às comparações das ORFs dentro do GRUPO SK/aids para BIÓPSIA Tabela 20 - Distribuição das freqüências e proporções dos casos, segundo o Subtipo de HHV-8 e Cor da pele dos pacientes Tabela 21 - Distribuição das freqüências e proporções dos casos, segundo o Subtipo de HHV-8 e Origem étnica dos pacientes Tabela 22 - Distribuição das freqüências e proporções dos casos, segundo o Subtipo de HHV-8 e Localização do SK Tabela 23 - Níveis descritivos obtidos dos ajustes de regressão logística quando considerado o Grupo e a Cor da pele Tabela 24 - Razão de Chances ("Odds Ratio") avaliadas em Cor da pele Tabela 25 - Níveis descritivos obtidos dos ajustes de regressão logística quando considerado o Grupo e o Risco Tabela 26 - Razão de Chances ("Odds Ratio") avaliadas em Risco Tabela 27 - Níveis descritivos obtidos dos ajustes de regressão logística quando considerado o Grupo e a contagem de células CD4 Tabela 28 - Níveis descritivos obtidos dos ajustes de regressão logística quando considerado o Grupo e reatividade na IFI-LANA Tabela 29 - Razão de Chances ("Odds Ratio") avaliadas em IFI- LANA Tabela 30 - Níveis descritivos obtidos dos ajustes de regressão logística quando considerado o Grupo e a reatividade na IFI-Lítico Tabela 31 - Razão de Chances ("Odds Ratio") avaliadas em IFI- Lítico

8 viii Lista de Quadros Quadro I Alguns genes do HHV-8 semelhantes aos genes presentes em outros vírus e no DNA humano, proteínas codificadas e propriedades funcionais. Quadro II Descrição das proteínas codificadas pelos genes ORF K1, ORF 25, ORF 26, ORF K8.1 e ORF 73 de HHV-8. Quadro III Relação das regiões do genoma de HHV-8 pesquisadas, nome e seqüência dos "primers" e tamanho dos produtos das PCRs Quadro A. Dados epidemiológicos clínicos e laboratoriais do grupo SK/aids (n=76) Quadro B - Resultados obtidos nas PCRs "nested" ORF 26, ORF K1, ORF K8.1, ORF 73 e ORF 25 em sangue periférico, material de biópsia, saliva e urina do grupo SK/aids (n=76) Quadro C. Pacientes do grupo SK/aids que apresentaram codificação NE (não existe), por não ter sido possível a coleta dos espécimes biológicos assinalados Quadro D. Dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais do grupo HIV/aids, sem SK (n=19) Quadro E. Resultados obtidos nas PCRs "nested" ORF 26, ORF K1, ORF K8.1, ORF 73 e ORF 25 em sangue periférico, saliva e urina no grupo HIV/aids sem SK (n=19) Quadro F. Dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais dos pacientes do grupo SK class. (n= 4) Quadro G. Resultados obtidos nas PCRs "nested" ORF 26, ORF K1, ORF K8.1, ORF 73 e ORF 25 em sangue periférico, material de biópsia, saliva e urina no grupo SK class (n=4) Quadro H. Dados epidemiológicos e laboratoriais do grupo controle sadio, HIV soronegativo (n=11) Quadro I - Resultados obtidos nas PCRs "nested" ORF 26, ORF K1, ORF K8.1, ORF 73 e ORF 25 em sangue periférico, saliva e urina de pessoas sadias sem Risco epidemiológico para adquirir viroses, grupo controle sadio CS (n= 11)

9 ix Resumo Desde a descoberta do herpes vírus humano tipo 8 (HHV-8) como o agente etiológico do sarcoma de Kaposi (SK) nas suas diferentes formas clínico-epidemiológicas, vários estudos vêm sendo conduzidos com o intuito de determinar as vias de transmissão desse vírus em populações endêmicas e de risco epidemiológico. Em regiões endêmicas, a transmissão viral foi relacionada à transmissão horizontal de mães para filhos e entre irmãos e a sexual principalmente, nos casos de SK/aids. Com o objetivo de determinar segmentos do genoma viral em fluídos biológicos e consequentemente seu potencial infectante foi conduzido o presente trabalho. Foram avaliados quanto à presença de segmentos localizados em posições estratégicas do genoma do HHV-8 em sangue, saliva e urina de 76 pacientes com SK/aids, 19 pacientes com HIV/aids, 4 casos de SK clássico e 11 indivíduos sadios (HIV-soronegativos, sem SK). Foram utilizadas as técnicas de PCR nested para as ORF K1, ORF 25, ORF 26, ORF K8.1 e ORF 73 em DNA extraído de material de biópsia de lesão de SK (controle positivo), células do sangue periférico, saliva e urina. Os resultados de PCR positivo para o HHV-8 foram analisados quanto a variáveis epidemiológicas, clínicas e laboratoriais. Foram consideradas como variáveis: sexo, cor, origem étnica, tempo de infecção por HIV e de acompanhamento do SK, terapia ARV e para SK, contagem de células CD4+ e sorologia para o HHV-8 (IFI-LANA e IFI-Lítico). Os testes estatísticos de regressão logística e de razão de chances foram usados para detectar as associações estatisticamente significantes entre as PCRs positivas e as variáveis estudadas nos grupos SK/aids e HIV/aids. Os subtipos do HHV-8 foram também determinados pela técnica de PCR-RFLP da ORF K1 (VR1). Os resultados obtidos mostraram a detecção de DNA/HHV-8 em 80,2% do material de biópsia, 69,7% no sangue, 59,2% na saliva e 21,0% na urina de pacientes com SK/aids. No grupo HIV/aids, a PCR para o HHV-8 resultou positiva em 47,4% dos casos no sangue e em 26,3% na saliva e urina. Já no grupo SK clássico 100% das biópsias e salivas resultaram PCR positiva, 67% do sangue e 33% das urinas. A avaliação sorológica revelou 73,3% de reatividade para IFI-LANA e 85,3%

10 x para a IFI-Lítico no grupo SK/aids, enquanto o grupo HIV/aids mostrou reatividade de 15,8% para IFI-LANA e 47,4% para IFI-Lítico; todos os pacientes apresentaram resultados reagentes nas duas sorologias para o HHV-8 no grupo de SK clássico. No grupo controle sadio não houve reatividade na sorologia para o HHV-8, com exceção de um caso, que mostrou ser reagente na IFI-LANA. Foi possível realizar a subtipagem do HHV-8 em amostras de 69 pacientes, sendo detectadas 27 cepas do subtipo A, 13 do subtipo B, 28 do subtipo C e 1 do subtipo E. Após as análises estatísticas foi verificado que as PCRs que identificam as regiões ORF 26, ORF K8.1 e ORF 73 foram as que apresentaram melhor desempenho na identificação de DNA/HHV-8. Houve associação entre a reatividade de IFI- Lítico e a presença do vírus no sangue periférico, assim como a reatividade para IFI-LANA e a detecção de DNA/HHV-8 na saliva. Houve uma tendência dos subtipos B e C de HHV-8 serem detectados em pacientes com infecção profunda ou disseminada de SK. Estes resultados sugerem que a boca pode ser um sítio de latência da infecção por HHV-8 e confirmam a atuação de sangue, saliva e urina como fluídos potencialmente infectantes.

11 xi Abstract Since the discovery of the human herpesvirus 8 (HHV-8) as the etiological agent of Kaposi s sarcoma (KS), several studies have been conducted in order to determine routes of virus transmission, mostly in endemic and at risk populations. The main of the present study was to determine target segments of the HHV-8 genoma and consequently infected bodily fluids. DNA sequences of ORF K1, ORF 25, ORF 26, ORF K8.1 and ORF 73 strategically localized in viral genoma were searched using nested PCR techniques in KS lesions (positive control), blood, saliva, and urine from 76 KS/aids patients, 19 HIV/aids patients, 4 classic KS patients, and among 11 healthy individuals (HIV-1 seronegative, without KS). HHV-8 subtypes were determined by PCR-RFLP of the ORF K1 (VR1), and HHV-8 antibodies by IFA-LANA and IFA-Lytic assays. The results obtained were analyzed according to epidemiological, clinical and laboratorial data, and the χ 2 test, logistic regression and odds ratio were applied to identify statistical association among variables in KS/aids and HIV/aids groups. The results obtained showed HHV-8 DNA in 80.2% of biopsies, 69.7% of blood, 59.2% of saliva, and 21% of urines from KS/aids group. Among HIV/aids patients, 47.4% resulted PCR positive in blood, 26.3% in saliva and urine. In classic KS cases, all biopsies and saliva resulted PCR positive, 67% in blood, and 33% in urine. The serology in KS/aids group showed 73.3% frequency of anti-latent antibodies, and 85.3% frequency of anti-lytic antibodies, while in HIV/aids group the frequencies were 15.8% and 47.4%, respectively. All classic KS cases resulted HHV-8 seroposite, while all individuals from control group resulted HHV-8 seronegative. Molecular characterization of 69 HHV-8 strains disclosed: 27 of subtype A, 13 of subtype B, 28 of subtype C, and 1 of subtype E. The ORF 26, ORF K8.1 and ORF 73 were the best segments for identifying HHV-8 DNA in bodily fluids. It was observed an association between antibodies to lytic antigens and the presence of HHV-8 in blood, and antibodies to latent antigens and the detection of HHV8 DNA in saliva of KS/aids patients. Indeed, HHV-8 subtypes B and C were detected mostly in disseminated KS cases. Taken together, the results obtained suggest that

12 xii the mouth could be one site of HHV-8 latency, and confirm that blood, saliva and urine were potentially infectious bodily fluids.