Fernanda de Oliveira Bello Corrêa

Transcrição

1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARARAQUARA Fernanda de Oliveira Bello Corrêa Influência do diltiazem sobre o tecido gengival. Estudo histológico e histométrico em ratos. Orientador: Prof a Dr a Silvana Regina Perez Orrico ARARAQUARA 2004

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARARAQUARA Fernanda de Oliveira Bello Corrêa Influência do diltiazem sobre o tecido gengival. Estudo histológico e histométrico em ratos. Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Araraquara da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Periodontia. Orientador: Prof a Dr a Silvana Regina Perez Orrico Co-orientador: Prof Dr Luís Carlos Spolidorio ARARAQUARA 2004

3 Corrêa, Fernanda de Oliveira Bello Influência do diltiazem sobre o tecido gengival. Estudo histológico e histométrico em ratos / Fernanda de Oliveira Bello Corrêa Araraquara: [s.n.], f.; 30 cm. Dissertação (Mestrado) Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia. Orientador: Profa. Dra. Silvana Regina Perez Orrico. Co-orientador: Prof. Dr. Luís Carlos Spolidorio. 1. Diltiazem 2. Anti-hipertensivos 3. Crescimento excessivo da gengiva 4. Ratos I. Título. Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Ceres Maria Carvalho Galvão de Freitas CRB 8/4612 Serviço de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP

4 Fernanda de Oliveira Bello Corrêa NASCIMENTO Ipatinga MG FILIAÇÃO Gerson Corrêa Filho Maria Cândida de Oliveira Bello Corrêa 1997/2000 Curso de Graduação em Odontologia Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP - Araraquara, São Paulo, Brasil. 2001/2002 Especialização em Periodontia Associação Paulista dos Cirurgiões Dentistas, APCD Araraquara, São Paulo, Brasil. 2002/2004 Curso de Pós-Graduação em Odontologia Área de Periodontia, Nível Mestrado, na Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP - Araraquara, São Paulo, Brasil.

5 FILOSOFIA DO SUCESSO Napoleon Hill Se você pensa que é um derrotado, você será derrotado. Se não pensar, quero intensamente, não conseguirá nada. Mesmo que você queira vencer, mas acha que não vai conseguir, a vitória não sorrirá para você. Se você fizer as coisas pela metade, você será um fracassado. Nós descobrimos, neste mundo, que o sucesso começa pela intenção da gente e tudo se determina pelo nosso espírito. Se você pensa que é um malogrado, Se torna como tal. Se você almeja atingir uma posição mais elevada deve, Antes de obter a vitória, Dotar-se da convicção de que conseguirá infalivelmente. A luta pela vida nem sempre é vantajosa aos fortes, nem aos espertos. Mais cedo ou mais tarde, Quem cativa a vitória é aquele que crê plenamente: EU CONSEGUIREI!

6 Dedico este trabalho Aos meu pais, Gerson e Cândida meus grandes mestres, exemplos de coragem e dedicação, presentes em todos os momentos de minha vida, sempre com muito amor, apoio e incentivo.... Ao meu namorado Romeu meu grande amor, por estar sempre do meu lado, me apoiando e incentivando, sempre com muito carinho e dedicação.... Às minhas irmãs, Renata e Roberta pelo amor, amizade e carinho que nos une.... À minha avó Izaltina minha querida e doce avó, pela magia que ela representa.

7 Agradecimentos especiais À Deus por todos os momentos de minha vida.... À minha orientadora Profª. Drª. Silvana R. Perez Orrico pela amizade, confiança, dedicação e segura orientação deste estudo.... Ao meu co-orientador Prof. Dr. Luiz Carlos Spolidório por oportunas sugestões e realização da análise histológica.... Ao Prof. Dr. José Eduardo Cezar Sampaio pelos conselhos e orientação nos meus primeiros passos na Periodontia, por toda sua dedicação, amizade e conhecimentos transmitidos.

8 Agradecimentos À Faculdade de Odontologia de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho UNESP, nas pessoas de seu Diretor Prof. Dr. Ricardo Samih Georges Abi Rached e seu Vice-Diretor, Prof. Dr. Roberto Mirando Esberard; À Coordenadora do curso de Pós-Graduação em Periodontia, Prof.ª Dr.ª Rosimary Adriana Chiérici Marcantonio, pela dedicação, competência e esforço empreendidos na realização deste curso; Aos Professores do Departamento de Periodontia da Faculdade de Odontologia de Araraquara: Silvana Regina Perez Orrico, José Eduardo Cezar Sampaio, Rosimary Adriana Chiérici Marcantonio, Élcio Marcantonio Júnior, Carlos Rossa Júnior, Joni Augusto Cirelli, Benedito Egbert Corrêa de Toledo e Ricardo Georges Abi Rached, pela amizade e conhecimentos trasmitidos; Aos Professores do Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Araraquara UNESP, pela atenção dedicada; À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, pela concessão da bolsa de estudos.

9 Aos meus colegas de turma: Dani, Jorge, Bia, Vanessa, Jú Moraes, Jú Ricco, Elizangela, Ishi, Andréa, Patrícia, Fernando e Samy pelo carinho, amizade e ajuda em todos os momentos. Aos Funcionários do Departamento de Diagnóstico e Cirurgia: Regina Lúcia, Cláudia, Zezé, Dona Maria do Rosário, Dona Tereza pelo agradável convívio diário, dedicação e respeito. Aos Funcionários da Seção de Pós-Graduação, pela dedicação e eficiência com que sempre me atenderam; Aos Funcionários da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Araraquara UNESP, pela dedicação e gentileza em todos os momentos. Em especial, a Maria José Peron, pela análise das referências bibliográficas deste estudo; À Daniela Gonçalves, Gabriela Giro e Patrícia de Fátima L. Fogaça, pela amizade e por todos os momentos que passamos juntas durante a fase experimental deste trabalho. À Dona Maria do Carmo Clemente da Cruz por ter cuidado dos animais com muito amor e dedicação.

10 À Ana Cláudia G. C. Miranda, pelo carinho, competência e importante contribuição na elaboração dos cortes histológicos. estudo; À Prof.ª Dr.ª Adriana Barbosa Santos pela análise estatística deste estudo; À minha tia Adriana Souza Santos Corrêa pelo auxílio na redação deste Às minhas irmazinhas Andreza e Carol, pela sincera amizade, apoio e por todos os momentos que passamos juntas. morar. Á Neide, pela dedicação em proporcionar um ambiente agradável de se À toda minha Família e Amigos que, mesmo distante, estiveram sempre me apoiando, incentivando e torcendo por mim. MUITO OBRIGADA!!!!!!

11 CORRÊA, F.O.B. Influência do Diltiazem sobre o tecido gengival. Análise histológica e histométrica em ratos. Araraquara, 2004, 129 p. Tese (Mestrado em Periodontia) Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista. RESUMO O diltiazem é um bloqueador dos canais de cálcio indicado para o tratamento da hipertensão e diversos tipos de angina. Esse medicamento pode provocar aumento gengival, embora apresente baixa prevalência. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da dosagem e do período de administração do diltiazem na indução ou não de aumento gengival em ratos. Quarenta ratos machos jovens foram distribuídos aleatoriamente em oito grupos de acordo com a dosagem e o período de aplicação. Os animais receberam 0 (controle), 5, 20 e 50 mg/kg de peso corporal/dia do diltiazem e foram sacrificados após 20 e 40 dias. Posteriormente, foram realizadas análises macroscópica, histológica e histométrica do tecido gengival. Macro e microscopicamente o tecido gengival de todos os animais dos grupos controle e experimentais apresentou características de normalidade. A análise histométrica da gengiva livre vestibular do primeiro molar inferior demonstrou que não houve influência da dosagem para cada período de aplicação, sendo que somente o grupo de 20 mg/kg mantido 40 dias apresentou uma redução significativa de área de tecido epitelial (teste de Kruskall- Wallis, p=0,010) em relação ao grupo controle/40 dias. Ao analisar a influência do período, por meio do teste de Mann-Whitney, foi verificado que somente o grupo de 20mg/kg apresentou redução significativa tanto de área de tecido conjuntivo (p=0,0367) quanto de tecido epitelial (p=0,0122) comparando-se o período de 20 e 40 dias. Os autores concluíram que o diltiazem não induziu aumento gengival em ratos. Estudos posteriores são necessários para avaliar a influência da dosagem de 20 mg/kg e de dosagens superiores às empregadas neste estudo. PALAVRAS-CHAVE: diltiazem, anti-hipertensivos; crescimento excessivo da gengiva; rato.

12 CORRÊA, F.O.B. Diltiazem influence on gingival tissue. A histological and histometric analysis in rats. Araraquara, 2004, 129 p. Tese (Mestrado em Periodontia) Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista. ABSTRACT Diltiazem is a calcium channel blocker for treatment of hypertension and various types of angina. It may also, however, provoke gingival overgrowth although this is not frequent. This study evaluated the influence of dosage and duration of diltiazem administration on inducing gingival overgrowth in rats. Forty young male rats were separated into eight groups according to the dosage and duration of administration. The animals received 0 (control), 5, 20 or 50 mg of diltiazem daily per kilogram of bodyweight. They were sacrificed after 20 or 40 day periods for macroscopic, histologic and histometric analysis of the gingiva. Macro and microscopic characteristics of the gingival tissue of all animals studied were found to be normal. Histometric analyses of the free buccal gingiva of the first lower molars showed that regarding the dosage for each period only the group of 20 mg/kg administered for 40 days presented a significant reduction in the area of the epithelial tissue in relation to the control group (p=0,010). Analyses of the time periods indicated that only the 20mg/kg group presented a significant reduction in both the connective (p=0.0367) and epithelial tissues (p=0.0122) when the 20 and 40 day durations were compared. The authors concluded that diltiazem did not induce gingival overgrowth in rats or influence their weight gain. Studies are now necessary to evaluate the influence of the 20 mg/kg and of the larger dosages administered in this study. KEY WORDS: diltiazem; antihypertensive agents; gingival overgrowth; rats.

13 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA 17 Diidropiridinas 21 Verapamil 49 Diltiazem PROPOSIÇÃO MATERIAL E MÉTODO 61 Animais 61 Descrição do protocolo experimental 62 Observações macroscópica 62 Processamento histológico 63 Análise microscópica 64 Análise histométrica RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICE ANEXOS 112

14 INTRODUÇÃO Diante do número de óbitos anuais causados por doenças cardiovasculares (mais de 300 mil/ano) torna-se necessário investir na prevenção e no controle da doença cardiovascular que é atualmente considerado um problema de saúde pública (PRAXEDES et al. 54, 1998). A hipertensão arterial ou "pressão alta" é a elevação da pressão arterial para números acima dos valores considerados normais (120/80 mmhg). Esta elevação anormal pode causar lesões em diferentes órgãos do corpo humano, tais como cérebro, coração, rins e olhos. Outro tipo de hipertensão menos comum é chamada de hipertensão arterial secundária e poderá ser controlada por meio de tratamento médico específico (PRAXEDES et al. 54, 1998). O diagnóstico da hipertensão arterial é basicamente estabelecido pelo encontro de níveis tensionais permanentemente elevados, acima dos limites de normalidade, quando a pressão arterial é determinada por meio de métodos e condições apropriados (PRAXEDES et al. 54, 1998). O objetivo primordial do tratamento da hipertensão arterial é a redução da morbidade e da mortalidade cardiovasculares do paciente hipertenso. O tratamento consiste tanto em medidas não-medicamentosas isoladas, representadas por redução do peso corporal, da ingestão do sal e do consumo de bebidas alcóolicas bem como prática de exercícios

15 13 físicos com regularidade, até aquelas associadas a medicamentos antihipertensivos (PRAXEDES et al. 54, 1998). Os medicamentos utilizados para o controle da hipertensão pertencem a diferentes classes como: bloqueadores dos canais de cálcio, diuréticos, beta-bloqueadores e inibidores da enzima conversora da angiotensina ECA (BUTLER et al. 12, 1987; PRAXEDES et al. 54, 1998). Os bloqueadores de canais de cálcio são classificados em fenilalquilamina (verapamil), diidropiridinas (nifedipina, nicardipina, isradipina, amlodipina, nitrendipina, felodipina) e benzodiazepínico (diltiazem). O mecanismo farmacológico de ação dos bloqueadores de canais de cálcio está baseado na inibição da entrada de íons cálcio através dos canais de íons da membrana plasmática e da mobilização de cálcio nos depósitos intracelulares, o qual restabelece a concentração citosólica de cálcio (Ca 2+ ) para níveis normais (MURAD 45, 1990). Nifedipina e diltiazem seletivamente bloqueiam o fluxo de cálcio através de seus canais específicos nas células do miocárdio, artéria coronária e musculatura lisa vascular, produzindo vasodilatação (HOCKINGS 27, 1993). O diltiazem, especificamente, apresenta um efeito inotrópico insignificante ou ligeiramente negativo sobre o músculo cardíaco, sendo usado primariamente para controle dos diversos tipos de

16 14 angina, com efeito vasodilatador menor e maior efeito antiarrítmico (MURAD 45, 1990). Muitos autores têm demonstrado que as drogas utilizadas no tratamento da hipertensão têm um importante efeito na cavidade bucal, descrito como crescimento gengival (BARCLAY et al. 2, 1992; BOWMAN et al. 5, 1988; BULLON et al. 7, 1994; NERY et al. 47, 1995; NISHIKAWA et al. 48, 1991). O aumento gengival representa uma resposta exuberante do organismo frente a uma variedade de condições locais e sistêmicas, podendo ser de natureza hereditária, inflamatória, hormonal, neoplásica ou devido à ação de drogas (ROSTOCK et al. 57, 1986). A patogênese do aumento gengival induzido por drogas é incerto e conflitante, tendo sido relacionado a fatores como idade, sexo, tempo do tratamento, concentração plasmática e salivar da droga, presença de placa bacteriana, inflamação do tecido, origem sócioecomômica do paciente e o sinergismo com outros medicamentos (SPOLIDORIO et al. 64, 1997). Manifesta-se clinicamente como hiperplasia generalizada, lobulada, com provável origem nas papilas interdentais, acometendo inclusive gengiva inserida, principalmente na região anterior vestibular e lingual dos maxilares (BUTLER et al. 12, 1987; NISHIKAWA et al. 48, 1991; SEYMOUR 58, 1991).

17 15 A prevalência de crescimento gengival induzido pela ingestão crônica de medicamentos tipo bloqueadores de canais de cálcio é baixa, com a nifedipina causando as mais significativas alterações gengivais (BARCLAY et al. 2, 1992; MORISAKI et al. 43, 2000; NERY et al. 47, 1995; NISHIKAWA et al. 48, 1991). Embora tenham sido desenvolvidos estudos examinando essa questão, os resultados são conflitantes, estimando-se uma variação na prevalência do crescimento gengival de 20% a 83% frente ao uso crônico da nifedipina (BARCLAY et al. 2, 1992; BENNETT; PULLIAM 3, 1983; NERY et al. 47, 1995; SEYMOUR 58, 1991). Em ratos, fatores como idade, concentração da droga administrada na dieta, nível da droga no soro, tempo de administração da droga e sexo podem influenciar no crescimento gengival induzido pela nifedipina (ISHIDA et al. 28, 1995). Uma explicação para o crescimento gengival induzido pela nifedipina e fenitoína pode ser o aumento nas secreções de grânulos do citoplasma de fibroblastos, levando um aumento da quantidade de glicosaminoglicanas na substância fundamental. (LUCAS et al. 36, 1985). Entretanto, há poucos estudos na literatura que relatam crescimento gengival induzido por outros bloqueadores de canais de cálcio, como o diltiazem. A avaliação de pacientes com cardiopatia isquêmica, tratados com diltiazem e comparados à pacientes tratados com outros

18 16 medicamentos anti-hipertensivos, demonstrou um crescimento gengival significativamente maior no grupo do diltiazem (BULLON et al. 8, 1995). Porém, no estudo de Ellis et al. 19 (1999) foi verificado que o crescimento gengival induzido pelo diltiazem foi estatisticamente menor que o desencadeado pela nifedipina. Já em animais, a avaliação do crescimento gengival frente a diferentes drogas (ciclosporina, nifedipina e diltiazem) isoladas ou em associações, demonstrou menor indução de crescimento gengival pelo diltiazem quando comparado à ciclosporina ou associações ciclosporina / bloqueadores dos canais de cálcio (MORISAKI et al. 43, 2000). Devido à ausência de estudos na literatura avaliando a influência desses fatores no crescimento gengival induzido pelo diltiazem em ratos, e de acordo com os achados descritos por Ishida et al. 28 (1995) e Tavassoli et al. 68 (1998) quanto à influência da idade, sexo e tempo de administração da droga sobre o crescimento gengival, achou-se oportuno avaliar a influência da dosagem e duração do tratamento para o desencadeamento do crescimento gengival em ratos machos jovens.

19 17 REVISÃO DE LITERATURA A hipertensão é o principal fator de risco para doenças cardiovasculares, as quais lideram as principais causas de morte na população em geral (GHANNEM; HADJ FREDJ 22, 1997; PRAXEDES et al. 54, 1998). É caracterizada pela elevação da pressão sanguínea arterial sistólica e/ou diastólica e pode ser tanto primária quanto secundária (RILEY; TEREZHALMY 56, 2001). A etiologia da hipertensão primária ou essencial ainda é pouco esclarecida, porém parece estar relacionada a fatores hereditários e ambientais, como dieta rica em sódio, obesidade e estresse. Clinicamente, apresenta-se assintomática até o aparecimento de complicações em órgãos alvo, particularmente rins, olhos e sistemas cardiovascular, cérebro-vascular e vascular-periférico. Entretanto, para o diagnóstico é preciso considerar a elevação da pressão sanguínea e a ausência de causas secundárias (RILEY; TEREZHALMY 56, 2001; McKNIGHT; MOORE 42, 1994). Já a hipertensão secundária pode estar associada com estenose da artéria renal, feocromocitoma, hiperaldosteronismo e o uso de drogas, como álcool, contraceptivo oral, simpatomiméticos, corticosteróide, cocaína e outros (RILEY; TEREZHALMY 56, 2001; CAMPESE; NOSRATI 13, 1999).

20 18 Existem alguns fatores de risco para o desenvolvimento da hipertensão já estabelecidos na literatura como: tabagismo, dislipidemia, diabetes mellitus, idade acima de 60 anos, sexo (mulheres pós-menopausa e homens) e história familiar de doença cardiovascular (RILEY; TEREZHALMY 56, 2001; McKNIGHT; MOORE 42, 1994; JOINT NATIONAL COMMITTEE 30, 1997; PRAXEDES et al. 54, 1998). A pressão arterial, consistentemente, aumenta com a idade e estudos epidemiológicos têm demonstrado que a pressão sanguínea ideal deve ser menor que 120/80mmHg (JOINT NATIONAL COMMITTEE 30, 1997; NEATON et al. 46, 1993; RILEY; TEREZHALMY 56, 2001; STAMLER et al. 66, 1993). O objetivo primordial do tratamento da hipertensão arterial é a redução da morbidade e da mortalidade cardiovasculares do paciente hipertenso, aumentadas em decorrência dos altos níveis tensionais, sendo utilizadas tanto medidas não-medicamentosas isoladas como associadas a medicamentos anti-hipertensivos (PRAXEDES et al. 54, 1998). Na prática clínica, está indicado para todos os pacientes hipertensos e aos indivíduos normotensos, mas de alto risco cardiovascular, o tratamento não-medicamentoso. Este consiste na modificação no estilo de vida do paciente hipertenso: redução do peso corporal, da ingestão de sal e do consumo de bebidas alcoólicas, prática de exercícios físicos com regularidade e não-utilização de drogas que

21 19 elevam a pressão arterial (PRAXEDES et al. 54, 1998; NEATON et al. 46, 1993; RILEY; TEREZHALMY 56, 2001). Ghannem e Hadj Fredj 22 (1997) desenvolveram um estudo para avaliar a distribuição da hipertensão na comunidade da Tunísia utilizando uma amostra de novecentos e cinqüenta e sete adultos com mais de 20 anos. A prevalência da hipertensão foi de 28,9%, e esta foi significantemente maior nos casos de obesidade e em pessoas com mais de 40 anos, história de diabetes em 10,2% dos casos, obesidade em 56,7%, obesidade andróide em 36% e tabagismo em 61,4% dos homens e 4,2% das mulheres. O objetivo da utilização de agentes anti-hipertensivos é permitir não somente a redução dos níveis tensionais, mas também a redução da taxa de eventos mórbidos cardiovasculares fatais e não-fatais (PRAXEDES et al. 54, 1998). Os medicamentos anti-hipertensivos podem ser divididos em seis grupos: diuréticos, inibidores adrenérgicos, vasodilatadores diretos, inibidores da enzima conversora de angiotensina, antagonistas do receptor de angiotensina II e bloqueadores dos canais de cálcio (PRAXEDES et al. 54, 1998). Especificamente em relação aos bloqueadores dos canais de cálcio, introduzido no mercado terapêutico em 1978, a ação antihipertensiva decorre da inibição do influxo de íons cálcio através dos canais presentes nas células da musculatura lisa vascular e cardíaca,

22 20 promovendo redução da contratibilidade do miocárdio e consumo de oxigênio, além de ter efeito vasodilatador e espasmolítico significante (BULLON et al. 7, 1994; NISHIKAWA et al. 48, 1991; HOCKINGS 27, 1993; MURAD 45, 1990; PRAXEDES et al. 54, 1998). Não obstante o mecanismo final comum, os bloqueadores dos canais de cálcio são divididos em quatro subgrupos, com características químicas e farmacológicas diferentes: diidropiridinas (nifedipina, isradipina, nitrendipina, felodipina, amlodipina, nisoldipina, lacidipina), fenilalquilaminas (verapamil), antagonistas do canal T (mibefradil) e benzotiazepinas (diltiazem) (PRAXEDES et al. 54, 1998). Em 1980, Henry 26 desenvolveu um estudo comparativo da farmacologia dos bloqueadores dos canais de cálcio, dentre eles: nifedipina, verapamil e diltiazem. A nifedipina é um potente vasodilatador, utilizada com bastante freqüência e eficácia no alívio dos sintomas da angina, causada pelo vasoespasmo coronário. In vivo, a droga não apresenta efeito depressivo do miocárdio e nem propriedade antiarrítmica. O tratamento com a nifedipina pode ser seguramente associado à administração de agentes bloqueadores do receptor beta. O verapamil prolonga a condução átrio-ventricular de maneira dose-dependente, sendo o medicamento de escolha no tratamento de arritmia supraventricular reentrante, tendo efeito moderado como agente antianginal. Já o diltiazem é mais utilizado para o tratamento de angina angioplástica. Como o verapamil, e

23 21 diferente da nifedipina, o diltiazem possui efeito antiarrítmico. Esse vasodilatador apresenta a propriedade incomum de não produzir taquicardia e mínima bradicardia. Esses medicamentos bloqueadores dos canais de cálcio apresentam efeito adverso semelhante na cavidade bucal, descrito como crescimento gengival. A revisão cronológica de estudos que avaliaram essa alteração gengival induzida por diidropiridinas, verapamil e diltiazem, será mostrada a seguir. DIIDROPIRIDINAS Lederman et al. 34 (1984) avaliaram um caso clínico de uma paciente, 58 anos, que apresentava angina pectoris tratada com nifedipina (90 mg/dia). Dois meses após o início do tratamento, a paciente apresentou hiperplasia gengival generalizada, que iniciava pela região interproximal e se estendia por todas as faces do dente. Foram realizadas três biópsias de diferentes áreas com a alteração gengival e o resultado demonstrou a presença de epitélio escamoso estratificado com paraqueratose e acantose, cristas epiteliais estreitas e alongadas, e tecido conjuntivo com densas fibras colágenas, rico em fibroblastos e com agregado de linfócitos, plasmócitos e mastócitos. O tratamento com nifedipina foi substituído pelo verapamil e o paciente apresentou regressão da hiperplasia. Entretanto, o retorno ao tratamento com a droga

24 22 resultou em recidiva necessitando, posteriormente, de remoção cirúrgica do crescimento gengival. Este foi o primeiro relato de caso de tecido hiperplasiado associado ao uso da nifedipina descrito na literatura. Os autores concluíram que as características clínicas e histológicas deste tecido se assemelharam aos achados de estudos prévios com fenitoína. Em 1984, Ramon et al. 55 relataram a presença de hiperplasia gengival em cinco pacientes tratados com nifedipina por um período de, no mínimo, dezoito meses. A análise histológica da biópsia excisionada durante o tratamento cirúrgico de gengivectomia mostrou a presença de epitélio acantótico com aumento na largura e comprimento do mesmo, principalmente apresentando cristas epiteliais alongadas. A lâmina própria apresentava-se fibrosa, com proliferação de fibroblastos, aumento do número de capilares sanguíneos e presença de processo inflamatório. Avaliando uma paciente jovem (32 anos) em terapia com nifedipina por quatro meses, cuja principal queixa era presença de sangramento e crescimento gengival gradativo, Van Der Wall et al. 71 (1985) observaram hiperplasia gengival tipo nodular, principalmente na face vestibular dos dentes anteriores superiores. A avaliação histológica do tecido excisado demonstrou a presença de paraqueratose epitelial com variação na largura, comprimento, proliferação e alongamento das cristas epiteliais. Em relação ao tecido conjuntivo, foi observada reação

25 23 inflamatória moderada, com edema e proliferação de plasmócitos e linfócitos. Lucas et al. 36 (1985) avaliaram quatro pacientes que apresentavam hiperplasia gengival, sendo que dois faziam uso de medicamento sistêmico (nifedipina, fenitoína) e os outros tinham história negativa de medicação. Os autores constataram, pela análise do tecido excisado, que a hiperplasia gengival induzida pela nifedipina e fenitoína exibia um aumento de substância extracelular como também, um aumento do número de fibroblastos contendo mucopolissacarídeos sulfatados nos grânulos secretores, com similaridade também na morfologia epitelial e no padrão inflamatório presente. Para os pacientes que não utilizavam medicamento, esse padrão não foi observado. Em resumo, a hiperplasia gengival induzida pela nifedipina assemelha-se àquela induzida pela fenitoína, tanto no aspecto clínico como histopatológico. Shaftic et al. 59 (1986) após avaliação de um paciente sob terapia com nifedipina, cuja queixa principal era sangramento gengival e dificuldade na mastigação dos alimentos, constataram clinicamente a presença de leve hiperplasia. A medicação foi substituída e houve regressão do crescimento gengival, sugerindo aos autores que a droga deve ser suspensa ou substituída quando desencadear esse tipo de alteração em pacientes que utilizam nifedipina. Slavin e Taylor 61 (1987) acompanharam cento e sete pacientes transplantados que utilizavam apenas ciclosporina ou a droga

26 24 em associação com nifedipina. A terapia associada com nifedipina foi significativamente associada com hiperplasia gengival, sendo que 51% dos pacientes que apresentaram esse quadro clínico eram tratados também com nifedipina e 8% não tratados com esse medicamento. Assim, os autores concluíram que, a administração da combinação ciclosporina/nifedipina potencializa o crescimento gengival em comparação com o uso apenas da ciclosporina. Heijl e Sundin 25 (1988) avaliaram a influência da nitrendipina na indução de crecimento gengival em cães beagle machos, com dez meses de idade, apresentando gengivite induzida previamente ao início do experimento. O grupo teste (seis animais) recebeu nitrendipina duas vezes por dia (total de dose diária 30 µmol/kg), enquanto o grupo controle (três animais) recebeu cápsulas de placebo da mesma maneira. A avaliação clínica consistiu de índice de placa, índice de crescimento gengival e grau de gengivite, tendo sido realizada no dia zero, dez (10) e vinte (20) semanas após, quando os animais foram sacrificados. Após dez (10) semanas de administração da droga, os animais do grupo teste apresentaram alterações no tamanho da gengiva e na vigésima semana este crescimento era visivelmente maior. O grupo controle não apresentou alteração gengival. No exame histopatológico, o grupo teste apresentou áreas com aumento na vascularização e tecido conjuntivo mais frouxo em comparação com o denso tecido conjuntivo presente no grupo controle. A análise morfométrica entre os grupos

27 25 apresentou pequenas diferenças, porém não-significantes. Assim, os resultados demonstraram que a nitrendipina administrada em cães beagle por vinte (20) semanas causou um significante crescimento de tecido gengival embora com composição tecidual aparentemente normal. Lundergan 37 (1989) comparou, através de uma revisão de literatura, os estudos sobre alterações gengivais desencadeadas por fenitoína, ciclosporina e nifedipina, concluindo que as três drogas podem estar associadas ao crescimento gengival. O conhecimento sobre a história médica de cada paciente e sobre o atual tratamento medicamentoso instituído é crucial para o estabelecimento do diagnóstico precoce, bem como para a prevenção ou limitação do desenvolvimento desta alteração tecidual. Tagawa et al. 67 (1990) relataram, após a avaliação clínica de uma paciente hipertensa sob terapia com nifedipina, que embora a paciente apresentasse hiperplasia gengival nodular em ambas as arcadas, a área edêntula não tinha sido afetada. A análise histológica do tecido excisado demonstrou características semelhantes a outras descritas para esse tipo de medicamento, entretanto a análise em microscopia eletrônica mostrou que o colágeno encontrava-se disperso e irregular. Não houve recidiva do crescimento gengival após sua excisão, em acompanhamento de quatro meses.

28 26 Brown et al. 6 (1990) avaliaram a condição clínica e histológica do crescimento gengival induzido pela nitrendipina, num relato de caso de um paciente de 68 anos, hipertenso e diabético tipo 2, tratado com nitrendipina. O tecido excisado durante a cirurgia de gengivectomia foi submetido à análise histológica, revelando a presença de epitélio escamoso estratificado, paraqueratinizado ou ortoqueratinizado, cristas epiteliais alongadas e conjuntivo com numerosos vasos sanguíneos e um moderado infiltrado de células inflamatórias crônicas. Sooriyamoorthy et al. 62 (1990) avaliaram três pacientes tratados com ciclosporina, nifedipina ou associação de ambas com crescimento gengival. Os autores investigaram se o tecido gengival desses pacientes apresentava aumento do metabolismo de andrógeno, especificamente testosterona, e conseqüente aumento na formação de 5α-diidrotestosterona (5α-DHT). Foi verificado um significante aumento na metabolização de andrógeno no tecido gengival hiperplásico induzido por nifedipina e ciclosporina quando comparado a achados prévios em tecido não-hiperplásico. Apesar do tecido gengival de mulheres saudáveis não metabolizar a testosterona significativamente, na presença de inflamação tecidual a formação de 5α-DHT é semelhante àquela encontrada em tecido gengival de homens. O aumento da metabolização de andrógeno é um fator causal para o crescimento gengival induzido por drogas. Essas drogas

29 27 ou seus metabólitos podem ser citotóxicos para fibroblastos gengivais de baixa atividade, facilitando assim, o aumento de fibroblastos com alta atividade, o que é relevante na formação da matriz. Nyska et al. 51 (1990) avaliaram em ratos a hiperplasia gengival induzida pela oxodipina. Foram utilizados seiscentos ratos Fischer, com quatro semanas de vida, distribuídos em seis grupos que receberam: 0, 2, 25, 75 e 225 mg/kg de oxodipina por dia, administrada na dieta. Os ratos foram sacrificados após cento e vinte e oito semanas e foram obtidos cortes histológicos da região lingual dos incisivos inferiores de cada animal. Os resultados demonstraram a influência da dose no aumento das alterações gengivais. Microscopicamente, observaram no epitélio, acantose, cristas epiteliais alongadas e, em alguns casos, ilhas de epitélio escamoso estratificado dentro do estroma. No conjuntivo foi observado um moderado aumento de fibroblastos adjacentes às células da camada basal e ausência de células inflamatórias. Lombardi et al. 35 (1991) avaliaram clínica e histologicamente a influência da felodipina na indução de hiperplasia gengival em um paciente hipertenso. Os autores observaram um tecido fibroso, firme e hiperplásico, com coloração normal e presença de falsas bolsas com aumento do acúmulo de placa. A terapêutica instituída foi tratamento periodontal básico e gengivectomia, sendo o tecido removido submetido aos procedimentos laboratoriais de rotina

30 28 e os cortes histológicos obtidos corados com hematoxilina/eosina, alcian blue (ph 2,5) e tricrômico de Masson. O epitélio gengival demonstrou aumento de espessura com características de acantose e paraqueratose e cristas epiteliais alongadas. O tecido conjuntivo apresentou infiltrado inflamatório rico em plasmócitos, linfócitos e principalmente fibroblastos, com aumento da quantidade de colágeno. Já a substância extracelular, corada intensamente pela técnica de alcian blue, demonstrou a presença de glicosaminoglicanas. Nishikawa et al. 48 (1991) avaliaram dois casos de hiperplasia gengival associada com o uso crônico de nifedipina. Em ambos os casos, a inflamação gengival estava presente antes do início da administração da droga. No primeiro caso, um controle rigoroso de placa bacteriana, associado com a remoção cirúrgica do tecido hiperplasiado, demonstrou resultados satisfatórios, não havendo necessidade de substituição da droga. Entretanto, no segundo caso, houve apenas a substituição da nifedipina por um agente hipotensivo diurético, e após dois meses ocorreu regressão espontânea da hiperplasia gengival, sem a necessidade de qualquer intervenção periodontal. A análise histológica do tecido removido demonstrou a presença de paraqueratose epitelial com cristas epiteliais alongadas e tecido conjuntivo com abundância de células inflamatórias. Fibroblastos gengivais obtidos do tecido removido do primeiro paciente foram isolados e cultivados, tendo sido demonstrado

31 29 que a nifedipina não teve efeito direto, in vitro, na proliferação ou síntese de colágeno. Deste modo, sugere-se que tanto a inflamação local, quanto a administração contínua da droga foram responsáveis pelas alterações gengivais observadas. Akimoto et al. 1 (1991) avaliaram quatro casos de hiperplasia gengival induzida por nifedipina evidenciando clinicamente hiperplasia gengival generalizada, principalmente associada às áreas de papilas interdentais. A avaliação histológica demonstrou a presença de paraqueratose epitelial, com variação na largura, proliferação, reticularização e alongamento das cristas epiteliais. A regressão da hiperplasia sem remoção cirúrgica foi observada quando houve interrupção do tratamento com nifedipina. Os autores concluíram que a substituição da nifedipina por outra droga e a modificação dos hábitos de higiene bucal são fatores essenciais para o tratamento da hiperplasia gengival induzida por esse medicamento. Hancock e Swan 24 (1992) após avaliarem a resposta ao tratamento periodontal em paciente com crescimento gengival induzido por nifedipina, sugeriram que a redução e o controle dessa manifestação clínica pode ser alcançado através de raspagem e alisamento radicular juntamente com controle meticuloso de placa bacteriana. Barclay et al. 2 (1992) examinaram as características gengivais de pacientes com problemas cardiovasculares tratados com

32 30 nifedipina (n=19) ou atenolol (n=9) comparados a pacientes saudáveis sistemicamente (n=19), estando os pacientes cardíacos em tratamento com a respectiva medicação, por no mínimo seis meses. Os índices de placa foram similares para todos os grupos. Entretanto, o grupo de pacientes medicados com nifedipina apresentou, significativamente, os maiores índices gengivais (p<0.005), escores de crescimento gengival (p<0.02) e sítios com profundidade de sondagem maiores que 3mm (p<0.005), quando comparado aos demais grupo, sendo que quatro pacientes necessitaram de cirurgia para remoção do crescimento gengival. Deve ser ressaltado que, as alterações gengivais dos pacientes tratados com nifedipina não foram correlacionadas com a dosagem da droga ou índice de placa. Ellis et al. 17 (1992) através de uma avaliação ultrasensível, mensuraram a farmacocinética da nifedipina no plasma e no fluido sulcular gengival de nove pacientes medicados com nifedipina (40-80 mg/dia) por, no mínimo, seis meses. Foram selecionados dois sítios anteriores com profundidade maiores que 4mm. As amostras de sangue e do fluido sulcular gengival foram coletadas simultaneamente no dia zero, meia hora, uma, duas, quatro e oito horas após a ingestão da droga. Em sete pacientes, a concentração máxima de nifedipina no fluido sulcular foi em média quinze (15) a trezentos e dezesseis (316) vezes maior que no plasma sanguíneo. Portanto, os autores sugeriram haver um seqüestro de

33 31 nifedipina para o tecido gengival e que, esta concentração muita elevada no fluido pode predispor o tecido ao crescimento gengival. Thomason et al. 70 (1993) avaliaram a prevalência e severidade do crescimento gengival induzido por ciclosporina e associação, em dois grupos: transplantados renais tratados com ciclosporina (n=32) ou com ciclosporina e nifedipina (n=23), por, no mínimo, três meses. O grupo medicado com ciclosporina e nifedipina apresentou maior grau de crescimento gengival (p=0.046) quando comparado com grupo que só recebeu ciclosporina. Porém, a incidência de pacientes com crescimento gengival que necessitava de intervenção cirúrgica foi estatisticamente similar para ambos os grupos. O crescimento gengival não foi relacionado com a dose de ciclosporina, concluindo que os níveis de placa e de inflamação gengival parecem ser os fatores mais associados a este fenômeno. Morisaki et al. 44 (1993) desenvolveram um estudo em ratos para avaliar o crescimento gengival induzido pela nifedipina, na presença ou ausência de inflamação gengival. Foram utilizados trezentos e quarenta e quatro ratos Fischer, machos, com quatorze dias de vida, divididos em quatro grupos: A, B, C e D. Os ratos dos grupos B e D foram oralmente infectados com 0.1 ml de Streptococcus mutans MT8148R, duas vezes por dia, durante dois dias, para indução de gengivite experimental. O animais dos grupos C e D (experimental) foram alimentados com dieta cariogênica, associada à nifedipina, e os dos

34 32 grupos A e B (controle) receberam da mesma forma a dieta sem nifedipina. Nenhuma diferença significante foi encontrada na média de peso corporal ganho pelos animais entre os grupos experimentais e controles, porém, nos grupos infectados, submetidos ou não à terapia com nifedipina, houve um decréscimo significativo do peso. Portanto, a nifedipina não afetou o crescimento dos animais, mas o S. mutans causou supressão do crescimento. A infecção por S. mutans causou expressivo acúmulo de placa nas superfícies dentais, mas a nifedipina não afetou o índice de placa ou a colonização deste microrganismo na cavidade bucal dos ratos. O tratamento com nifedipina foi capaz de induzir crescimento gengival mesmo na ausência de acúmulo de placa bacteriana, porém a inflamação presente devido ao acúmulo de placa, influenciou na severidade do crescimento gengival. Dongari et al. 15 (1993) desenvolveram uma revisão de literatura para avaliar a forma de ação de três diferentes tipos de drogas indutoras de crescimento gengival: fenitoína, ciclosporina e bloqueadores dos canais de cálcio. As reações teciduais podem envolver um distúrbio no influxo de íons cálcio para o interior de células específicas, resultando na alteração do metabolismo de colágeno com aumento do número de fibras colágenas e proteínas não-colagenosas e redução na síntese e secreção de colagenase. Quanto ao tratamento para o crescimento gengival induzido por droga este deve enfatizar o controle de placa bacteriana, a descontaminação radicular realizada pelo profissional e

35 33 procedimentos cirúrgicos ressectivos para melhorar a função, estética e o acesso aos cuidados com a higiene bucal caseira. Ellis et al. 16 (1993) investigaram a relação entre as variáveis farmacocinéticas da nifedipina e a incidência e severidade do crescimento gengival em nove pacientes medicados com essa droga por, pelo menos, seis meses. Cinco desses pacientes apresentaram crescimento gengival significante e os outros quatros não, atuando como controles. Foram realizados o exame periodontal (índice de placa, índice de sangramento e avaliação do crescimento gengival) e coleta de amostras de sangue e de fluido sulcular gengival de cada paciente. Nenhuma diferença significante foi observada entre os pacientes que utilizavam a droga quanto aos parâmetros periodontais ou da farmacocinética da nifedipina no plasma. A droga foi detectada no fluido de sete pacientes, sendo sua concentração no fluido aproximadamente de quinze (15) a noventa (90) vezes maior que no plasma. Bullon et al. 7 (1994) avaliaram histologicamente a gengiva de dezoito pacientes cardíacos tratados com nifedipina, dez pacientes cardíacos não tratados com bloqueador dos canais de cálcio e doze pacientes saudáveis (grupo controle). O grupo da nifedipina apresentou, significativamente, os maiores escores de hiperplasia gengival, enquanto os outros pacientes cardíacos também apresentaram leve hiperplasia. O crescimento foi observado, inicialmente, na região interproximal, estando

36 34 diretamente relacionado ao índice de placa, porém, sem correlação com a concentração e/ou tempo de administração da droga. Fujii et al. 21 (1994) avaliaram culturas de fibroblastos gengivais de onze pacientes tratados com nifedipina, sendo seis com hiperplasia gengival e cinco sem essa manifestação clínica. Os autores avaliaram o efeito dos bloqueadores dos canais de cálcio (nifedipina, diltiazem, verapamil e nicardipina) como também da fenitoína (controle positivo) na proliferação celular, síntese de DNA e de fibroblastos. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos quanto ao tamanho, características superficiais ou citoplasmáticas dos fibroblastos. Porém, fibroblastos gengivais de pacientes tratados com nifedipina, proveniente de tecido hiperplasiado, cultivados na presença de 1µM de cada bloqueador dos canais de cálcio ou fenitoína, demonstraram maior proliferação celular, síntese de DNA e de colágeno do que fibroblastos de tecidos não-hiperplasiadas. Bonnaure-Mallet et al. 4 (1995) observaram as alterações de macromoléculas na matriz extracelular da gengiva de humanos após o tratamento com drogas indutoras de crescimento gengival. Foram avaliadas vinte biópsias de diferentes pacientes, sendo quatro pacientes tratados com ciclosporina, quatro com hidantoína e quatro com nifedipina comparados a quatro pacientes com gengiva saudável (controle) e quatro com gengivite marginal

37 35 crônica. A área ocupada pelo total de colágeno tipo III e IV, vasos sanguíneos, fibroblastos, fibronectina e fibras elásticas foi estimada e comparada utilizando um programa de análise morfométrica computadorizada (BFM 186). O aspecto histológico do crescimento gengival induzido por drogas foi similar para todos os grupos (nifedipina, ciclosporina e hidantoína), porém a quantificação dos diferentes componentes da matriz extracelular apresentou diferenças. Nos grupos da nifedipina e ciclosporina, a área ocupada pelos fibroblastos foi significativamente maior que no grupo controle e com gengivite crônica. A área ocupada pelo colágeno foi significativamente maior no grupo da nifedipina comparado com os demais grupos com alterações patológicas. O grupo da nifedipina também apresentou uma grande quantidade de fibronectina, e as fibras elásticas encontravam-se preservadas. Ishida et al. 28 (1995) estudaram fatores como idade, dose da nifedipina administrada na dieta e sexo que poderiam estar influenciando o crescimento gengival em ratos Fischer, com vinte dias de idade. Para avaliar o efeito da duração da administração da droga os animais foram divididos em sete grupos alimentados com 250 mg/kg de nifedipina e sacrificados nos dias: 0, 10, 20, 30, 45, 55, 70. Com o objetivo de avaliar o efeito da dosagem, os ratos foram divididos em cinco grupos que receberam: 50, 100, 150, 200 e 250 mg/kg de nifedipina na dieta, por cinqüenta e cinco dias. Para avaliar o efeito da retirada da droga no

38 36 crescimento gengival, a dieta contendo nifedipina (250 mg/kg) foi substituída por uma dieta sem a droga no dia 30, e os animais foram sacrificados nos dias 55 e 70. A influência da idade foi mensurada administrando uma dieta com 250 mg/kg de nifedipina para animais com diferentes idades: vinte, cinqüenta e noventa dias por um período máximo de cinqüenta e cinco dias. A concentração da droga no plasma sanguíneo foi avaliada no momento do sacrifício e mostrou-se diretamente dependente da concentração desta na dieta, sendo que, nos ratos machos a dose mínima necessária para desencadear alteração gengival (100mg/kg) foi menor que nos ratos fêmeas (150 mg/kg). A administração da nifedipina (250 mg/kg) durante vinte dias foi suficiente para induzir o máximo de crescimento gengival, entretanto, esta indução só ocorreu nos ratos que começaram a receber a dieta com nifedipina com vinte dias de idade, diferente daqueles que iniciaram a dieta com a droga com cinqüenta ou noventa dias. A regressão total do crescimento gengival ocorreu após quarenta dias da interrupção da administração do medicamento. Em resumo, os resultados demonstram que o crescimento gengival induzido por nifedipina ocorre em concordância com a concentração da droga na dieta e no soro, e em ratos jovens do sexo masculino. Nery et al. 47 (1995) investigaram a prevalência da hiperplasia gengival induzida pela nifedipina e sua relação com outras variáveis como duração do tratamento, dose, idade, índice de higiene

39 37 bucal e número de dentes, em cento e oitenta e um indivíduos hipertensos, dentados ou não, tratados com nifedipina por, no mínimo, quatro meses comparados com setenta e um pacientes sadios. O resultado demonstrou que a porcentagem de indivíduos com hiperplasia gengival foi muito maior no grupo tratado com nifedipina do que no controle (p<0,05), sendo estatisticamente mais evidente nos indivíduos dentados. A hiperplasia gengival apresentou uma significante associação com a higiene bucal e o número de dentes, porém não foi observada essa associação com a dose e a duração do tratamento com a droga. O achado histológico do tecido hiperplasiado demonstrou a presença de paraqueratose e acantose irregular. Em algumas áreas, o epitélio apresentou hiperplasia pseudoepiteliomatosa caracterizada por crescimento irregular com leves alterações nos núcleos celulares e no tecido conjuntivo foi constatado aumento de fibras colágenas com infiltrado de células inflamatórias. Os autores concluíram que, esses achados se assemelham àqueles previamente descritos nos estudos de hiperplasia gengival induzida por nifedipina. McKevitt e Irwin 41 (1995) desenvolveram um estudo para avaliar o mecanismo celular envolvido no crescimento gengival induzido por nifedipina, através da técnica de cultura de fibroblastos, sendo analisados o crescimento celular e a produção de proteínas e colágenos. As linhagens de fibroblastos gengivais foram obtidas a partir de biópsia gengival de dois grupos distintos: o primeiro composto por dois pacientes

40 38 sob terapia com nifedipina e que apresentaram crescimento gengival e o segundo, dois pacientes também medicados com nifedipina, porém com gengiva clinicamente saudável. A nifedipina foi adicionada às culturas de fibroblastos em três concentrações: 10, 100 ng/ml (respectivamente, menor e maior concentração da droga encontrada no plasma sanguíneo) e 1000 ng/ml (concentração encontrada nos tecidos gengivais). Os estudos comparativos demonstraram diferenças fenotípicas entre ambos os tipos celulares, sendo que no primeiro grupo, o potencial de crescimento dos fibroblastos e o nível de produção de proteínas e colágeno foram estatisticamente maiores que no segundo grupo. A adição da nifedipina exógena, nas diferentes concentrações, não apresentou efeito no grupo sem hiperplasia, porém induziu uma inibição significativa da resposta celular para o grupo com hiperplasia. Esses achados sugerem que o efeito direto da nifedipina na proliferação de fibroblastos não é o único fator determinante para a progressão da lesão. Thomason et al. 69 (1995) avaliaram a condição gengival de noventa e quatro pacientes transplantados renais, sendo trinta e um medicados apenas com cicloporina e sessenta e três com ciclosporina/ nifedipina, por, no mínimo, três meses. Os pacientes tratados com ciclosporina / nifedipina apresentaram os maiores escores de crescimento gengival e profundidade de sondagem, como também foram os que mais apresentaram necessidade de cirurgia gengival para remoção do tecido (62% dos casos). A idade do paciente, sexo, duração da terapia, índice de

41 39 sangramento gengival e a terapia com nifedipina foram determinantes importantes tanto para a expressão do crescimento gengival quanto para a necessidade de cirurgia. A concentração da droga no fluido gengival não correlacionou com a concentração da mesma no plasma ou com as alterações gengivais presentes. Logo, os autores concluíram que a terapia de ciclosporina associada com nifedipina aumenta o risco de desenvolver crescimento gengival em pacientes transplantados renais. O Valle et al. 52 (1995) desenvolveram um estudo clínico e morfométrico com análise de imagens digitais para avaliar o crescimento gengival induzido pela nifedipina e ciclosporina A. Trinta pacientes selecionados foram divididos nos seguintes grupos: vinte e um pacientes que receberam transplante renal há, no mínimo, seis meses, medicados com ciclosporina A (CsA); oito pacientes com mesmo tipo de transplante porém tratados com CsA / nifedipina e trinta pacientes saudáveis (controle). Foram realizadas análises do índice de placa, sangramento à sondagem e avaliação do grau de hiperplasia gengival. Para a análise morfométrica, fotografias preto-e-branco foram tiradas da região anterior de ambas as arcadas de cada paciente, digitalizadas e analisadas no programa Visilog. Os achados mostraram diferenças significativas no índice de placa, índice de sangramento e no grau de crescimento gengival, observado nas áreas de papila e margem gengival, entre o grupo controle e os grupos de pacientes transplantados. A administração da nifedipina associada com a ciclosporina potencializou o efeito adverso

42 40 desta, pois o índice de crescimento gengival também apresentou diferenças significativas entre o grupo tratado com CsA e o tratado com CsA / nifedipina (p<0,01). Assim, os autores concluíram que o método de análise de imagens digitais foi útil para avaliação do grau de crescimento gengival. Ellis et al. 18 (1995) avaliaram dez pacientes com angina e/ou hipertensão que apresentavam crescimento gengival como resultado da terapia com nifedipina (20 mg duas vezes ao dia). Os pacientes foram examinados quanto ao índice de placa, índice de sangramento e profundidade de sondagem. Quatro sítios anteriores de cada paciente foram selecionados para coleta das amostras do fluido sulcular gengival (dois sítios com profundidade sondagem maior ou igual a 4mm e com sangramento e dois sítios com profundidade menor que 4mm e com ausência de sangramento) e a concentração da nifedipina foi determinada usando cromatografia a gás. As amostras do fluido bem como do sangue de cada paciente foram coletadas após quatro horas da ingestão da droga pelo paciente. A concentração da droga no fluido esteve significativamente aumentada na presença de inflamação (p=0.04) e placa (p=0,029), porém, não apresentou correlação com o aumento da profundidade de sondagem e o grau de crescimento gengival. Os autores concluíram que alterações inflamatórias no tecido gengival parecem ser um determinante significante para o seqüestro da nifedipina no fluido sulcular gengival.

43 41 Margiotta et al. 38 (1996) investigaram cento e treze pacientes transplantados renais, em tratamento por, no mínimo, três meses, que foram divididos em grupos distintos de acordo com o tratamento recebido: grupo 1 ciclosporina (n=61); grupo 2 ciclosporina / nifedipina (n=28) e grupo 3 azitromicina (controle) (n=24). Todos os indivíduos foram avaliados quanto aos parâmetros periodontais (índice de placa, índice de cálculo, índice gengival e profundidade de sondagem), índice de crescimento gengival e parâmetros farmacológicos (coleta de sangue e saliva). O crescimento gengival ocorreu em 33,7% dos pacientes do grupo 1 e 2, sendo que 60% dos pacientes que apresentaram maior escore de crescimento eram do grupo que utilizavam a associação ciclosporina / nifedipina. Não foi observada correlação entre índice de crescimento gengival e os parâmetros farmacológicos. Apesar de haver uma tendência de aumentar a presença do antígeno HLA-A19 (p=0,04; RR=2,86), nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os diferentes escores de crescimento gengival. Os autores concluíram que a prevalência e severidade do crescimento gengival foram maiores no grupo ciclosporina / nifedipina, e que em virtude do crescimento gengival não ter apresentado correlação com os irritantes locais, a inflamação gengival ou os parâmetros farmacológicos, este parece estar relacionado com a suscetibilidade individual do hospedeiro. Nishikawa et al. 49 (1996) realizaram uma revisão de estudos em ratos que avaliaram a patogênese do crescimento gengival

44 42 induzido por drogas (fenitoína, ciclosporina e nifedipina). Segundo os estudos, os autores estabeleceram os seguintes postulados: o crescimento gengival é mais prevalente na região vestibular do que na região lingual e é menos severo na maxila que na mandíbula; uma vez atingido um nível sanguíneo da droga como resultado do aumento da dose, a incidência do crescimento gengival é de 100% e sua severidade é dependente do nível sanguíneo desta, sendo que a ciclosporina é a responsável pelas alterações mais severas; a duração da administração da droga para que ocorra o máximo de crescimento gengival é de quarenta dias; há regressão espontânea após interrupção do tratamento com a droga; o acúmulo de placa não é essencial para o estabelecimento do crescimento, porém atua no grau de severidade do mesmo; e o crescimento gengival é mais severo em ratos jovens do que em senis, sendo os machos mais atingidos. Esses resultados sugerem que o crescimento gengival induzido por drogas em ratos é dependente da concentração da droga ingerida, do nível desta no sangue, da idade e do sexo e que a pré-existência de inflamação gengival é um fator relevante na severidade desta alteração. Jorgensen et al. 31 (1997) observaram a prevalência de hiperplasia gengival induzida por amlodipina. Para o estudo, foram avaliados cento e cinqüenta pacientes dentados, sob tratamento com amlodipina (5 mg/dia) por, no mínimo, seis meses. Após a avaliação periodontal, foram encontrados cinco casos de hiperplasia leve (3,3%)

45 43 com índice de placa médio de 38% (variando de 10% à 85%). Assim, os autores concluíram que os resultados demonstram que a amlodipina, administrada nesta concentração diária, não induz hiperplasia gengival. Westbrook et al. 72 (1997) examinaram quatorze pacientes com hiperplasia gengival induzida por nifedipina. Os parâmetros avaliados foram: profundidade de sondagem, margem e espessura gengival, índice de placa e índice gengival. Foram realizadas fotografias intrabucais, modelos de estudo e biópsia da área com alteração gengival. Posteriormente, os pacientes foram randomizados e divididos em dois grupos: continuação do tratamento com nifedipina ou substituição por uma dose equivalente de isradipina, durante oito semanas. O tratamento com isradipina demonstrou significante diminuição na profundidade de sondagem, não alterando nenhum outro parâmetro periodontal. Clinicamente, 60% dos pacientes tratados com isradipina demonstraram diminuição da hiperplasia, enquanto que 66% daqueles tratados com nifedipina demonstraram aumento da hiperplasia. Portanto, nos casos de pacientes hipertensos com crescimento gengival induzido pela nifedipina, a substituição desta por isradipina pode resultar na regressão da alteração. Fu et al. 20 (1998) avaliaram o potencial da nifedipina em induzir crescimento gengival em modelos animais estabelecidos. Foram utilizados quarenta e cinco ratos machos Sprague-Dawley de seis semanas divididos em três grupos, submetidos a uma dieta com nifidipina

46 44 na dosagem de 0 (controle), 30 mg/kg e 50 mg/kg de peso. A morfologia gengival foi mensurada a cada três semanas através de modelos de gesso obtidos de impressões da região incisal da mandíbula. Os animais foram sacrificados após nove semanas para avaliação histopatológica e histométrica. Para as análises histométricas cinco níveis teciduais foram escolhidos baseados em demarcações anatômicas. Dimensões gengivais (largura vestíbulo-lingual e mesio-distal e altura vertical) aumentaram significativamente de acordo com a administração da droga, tanto em relação à dosagem quanto à duração do tratamento. Apesar de ter sido observado um tecido fibrovascular na interface gengiva-dente de todos os grupos, este tecido apareceu primeiro e era mais espesso nos animais tratados com nifedipina. Logo, o crescimento gengival pode ser induzido pela nifedipina em ratos e este parece ser dose-dependente. Tavassoli et al. 68 (1998) avaliaram noventa e sete pacientes tratados com nifedipina, divididos em subgrupos distintos de acordo com a idade, sexo, tempo de administração da droga, presença/ausência de placa bacteriana e inflamação e severidade do crescimento gengival. O crescimento gengival foi encontrado em 29% dos casos, sendo a duração do tratamento com a droga, presença / severidade de inflamação gengival e sexo dos pacientes os fatores de maior influência no desenvolvimento deste. Pacientes do sexo masculino, com alto grau de inflamação gengival, tratados com nifedipina por mais de quatro meses eram os mais propensos a apresentar crescimento gengival

47 45 excessivo. Esses achados sugerem que certos fatores locais estão envolvidos na patogênese do crescimento gengival induzido por drogas. James et al. 29 (2000) desenvolveram um estudo coorte em cento e trinta e cinco pacientes transplantados renais, há no mínimo doze anos, tratados com ciclosporina em associação com nifedipina (n=89) ou amlodipina (n=46). Os pacientes foram avaliados quanto à idade, sexo, duração do tratamento e dosagem da droga. A presença de crescimento gengival foi avaliada por meio de modelos de gesso, tendo o grupo ciclosporina / nifedipina apresentado menor prevalência (53%) do que o grupo ciclosporina / amlodipina (72%). Porém, o escore médio de crescimento gengival entre ambos os grupos não apresentou diferença estatisticamente significante. A idade parece ser um fator determinante do crescimento gengival, sendo os pacientes jovens os mais acometidos. Nurmenniemi et al. 50 (2001) compararam a atividade mitótica de células da camada basal de pacientes saudáveis e com crescimento gengival induzido por drogas. Para o estudo foram coletadas amostras de dezenove pacientes saudáveis, doze cardíacos tratados com nifedipina e vinte e dois imunossuprimidos tratados com azitromicina, prednisolona e ciclosporina-a. A atividade mitótica no epitélio oral de todos os pacientes com alterações sistêmicas foi significativamente maior que no controle (p=0,003), enquanto no epitélio sulcular, apenas o grupo dos imunossuprimidos apresentou diferença significativa (p=0,032). Os resultados sugerem que, o aumento de espessura epitelial observada no

48 46 crescimento gengival induzido pela nifedipina ou ciclosporina está associado com o aumento da atividade mitótica, especialmente no epitélio oral. Chiu et al. 14 (2001) desenvolveram um experimento em ratos para avaliar a influência da nifedipina (Nif) no crescimento gengival induzido pela ciclosporina (CsA). Ratos machos, Sprague-Dawley, com seis semanas de vida (cento e cinqüenta a duzentos e cinqüenta gramas), foram divididos em seis grupos distintos, variando a concentração dessas drogas na dieta e a forma de administração, isoladas ou associadas. Foram feitas análises histológicas e histométricas da região de papila incisal. As dimensões gengivais aumentaram após terapia com CsA ou Nif, apesar de ter sido mais prevalente com CsA. Entretanto, o aumento na morfologia gengival observado com a terapia de CsA diminuiu quando os animais receberam nifedipina adicional. Portanto, esses autores, ao contrário da maioria dos estudos desenvolvidos até o momento, questionam se a nifedipina é um fator crucial no agravamento do crescimento gengival induzido pela CsA. Shimizu et al. 60 (2002) estudaram a influência da nifedipina na indução de hiperplasia epitelial em ratos através da inibição da apoptose. Para o estudo foram utilizados trezentos e quarenta e quatro ratos Fischer de vinte dias de idade. Os ratos receberam uma dieta suplementada com nifedipina a 125 mg/kg na primeira semana e, posteriormente, a 250 mg/kg. O grupo controle recebeu a mesma dieta,

49 47 porém sem a nifedipina. Os animais foram sacrificados com oito, quinze e trinta dias. Foram feitas análises histológicas da gengiva do primeiro molar inferior e da mucosa do centro do palato para avaliar hiperplasia epitelial, análise TUNEL para detectar morte celular in situ e avaliação histoquímica para detecção do BrdU incorporado no DNA celular com o objetivo de examinar o efeito da nifedipina na atividade proliferativa de queratinócitos e duração da vida celular. A nifedipina induziu uma hiperplasia epitelial que ocorreu a partir do décimo quinto dia, inibiu a apoptose dos queratinócitos no epitélio gengival, sendo mais severa no oitavo dia, e prolongou o tempo de vida celular não afetando a atividade proliferativa. A mucosa do palato não apresentou alterações da normalidade para nenhuma das análises. Portanto, o crescimento gengival dos animais sob terapia com nifedipina é induzido não pelo aumento da proliferação dos queratinócitos, mas sim pelo prolongamento da duração da vida através da inibição da apoptose destas células. Spolidorio et al. 65 (2002) desenvolveram um estudo para avaliar morfologicamente o efeito da ciclosporina e nifedipina no crescimento gengival em ratos. Foram utilizados quarenta ratos Wistar, machos, de cinqüenta gramas, distribuídos em quatro grupos: controle, ciclosporina, nifedipina, ciclosporina / nifedipina. A ciclosporina era injetada diariamente na dose de 10 mg/kg de peso do animal, a nifedipina foi adicionada na ração numa dose de 240 µg/g e o grupo controle recebeu uma dieta padrão e injeções subcutâneas de solução salina

50 48 diariamente. Os ratos foram sacrificados após sessenta dias e foram feitas análise macroscópica, morfológica, histométrica e estereológica da gengiva vestibular do primeiro molar inferior de cada animal. Os autores observaram epitélio hiperplásico, com aprofundamento das digitações papilar e tecido conjuntivo denso com fibras colágenas espessas interpostas por delicados vasos e fibroblastos. Os resultados do presente estudo confirmaram que a ciclosporina e a nifedipina causam crescimento gengival em ratos, sendo este mais severo para a ciclosporina. Entretanto, foi comprovado neste estudo que a nifedipina aumenta a severidade do crescimento gengival quando associada a ciclosporina. Martins et al. 39 (2003) avaliaram biópsias teciduais de três pacientes com crescimento gengival severo, sendo dois tratados com ciclosporina e o outro com nifedipina, comparados com tecidos normais. Glicosaminoglicanas gengivais purificadas foram analisadas através de gel de agarose em eletroforese e a distribuição do tamanho molecular foi avaliada pelos métodos de cromatografia em gel de filtração e gel de poliacrilamida em eletroforese. Os componentes das glicosaminoglicanas encontrados em todos os tecidos gengivais foram: sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de heparano e ácido hialurônico. O padrão de distribuição do tamanho molecular das glicosaminoglicanas no crescimento gengival induzido pela nifedipina ou ciclosporina é similar àquele encontrado nas gengivas saudáveis.

51 49 Spolidorio et al. 63 (2003) compararam o crescimento gengival em ratos de diferentes idades tratados com ciclosporina, nifedipina ou associações. Ratos Wistar de quinze, trinta, sessenta e noventa dias de vida foram tratados com 10 mg/kg de ciclosporina-a e/ou 50 mg/kg de nifedipina injetada no subcutâneo. Os ratos de quinze e trinta dias apresentaram crescimento gengival evidente em todos os grupos (ciclosporina, nifedipina ou ciclosporina / nifedipina); já os ratos de sessenta e noventa dias apresentaram essa alteração gengival apenas quando tratados com ciclosporina associada a nifedipina. Assim, os autores concluíram que o efeito da combinação ciclosporina / nifedipina sobre o crescimento gengival, em ratos, não é idade-dependente. VERAPAMIL Pernu et al. 53 (1989) avaliaram um caso clínico de uma paciente, trinta e um anos, portadora de arritmia cardíaca tratada com verapamil, digoxina e nitroglicerina por dois anos. A paciente apresentava crescimento gengival proeminente na região anterior e interproximal, associado à inflamação gengival, retenção de placa e lesões cariosas. Foram instituídos o tratamento periodontal básico e gengivectomia. Fibroblastos removidos da biópsia foram cultivados e comparados com fibroblastos obtidos de paciente sistemicamente normal e com gengiva saudável. O total de proteína e colágeno produzido a partir dos

52 50 fibroblastos da paciente medicada com verapamil foi menor que dos fibroblastos controle. A incubação de fibroblastos com verapamil (10-4 M. por 48horas) reduziu a síntese total de proteínas e colágenos em ambas as culturas de fibroblastos. Microscopicamente, o tecido excisionado apresentou-se com acantose, paraqueratose e alongamento das cristas epiteliais. No tecido conjuntivo, observou-se migração de células inflamatórias, principalmente plasmócitos, através do epitélio juncional, vasos sanguíneos dilatados e quantidade de colágeno reduzida nas áreas com inflamação pronunciada. Miller e Damm 40 (1992), a partir de cinco mil pacientes com história de uso de verapamil entre 1987 a 1990, selecionaram vinte e quatro pacientes que apresentavam, no mínimo, dez dentes anteriores, idade entre vinte e quatro e setenta e seis anos e história de uso do medicamento por mais de um ano. Após o exame clínico, observaram a presença de hiperplasia gengival em apenas um paciente, sendo que a alteração apareceu após o terceiro mês de uso contínuo da droga, sendo que a dosagem recebida excedia duas vezes mais a dosagem média diária dos outros pacientes. Clinicamente, o tecido hiperplásico estava localizado na região vestibular dos dentes anteriores inferiores, apresentava consistência firme e bulbosa, com margem gengival eritematosa. Microscopicamente, este tecido mostrou acantose, paraqueratose, epitélio escamoso estratificado com finas e alongadas cristas

53 51 epiteliais, tecido conjuntivo fibroso, grande quantidade de colágeno, com pequenos e dispersos canais vasculares e agregado de linfócitos e plasmócitos. Em resumo, os autores concluíram que a hiperplasia gengival causada pelo verapamil ocorre com menos freqüência que a hiperplasia induzida pela nifedipina. DILTIAZEM Giustiniani et al. 23 (1987) reportaram um caso de um paciente, cinqüenta e oito anos, que tinha sido tratado, inicialmente, com verapamil. O paciente desenvolveu gengivite hiperplásica e a medicação foi cancelada. Houve regressão do quadro clínico em quinze dias sem a ingestão da droga, mas, vinte e quatro dias após iniciar a terapia com outro bloqueador dos canais de cálcio, o diltiazem (240 mg/dia), o paciente demonstrou evidências de recidiva da gengivite hiperplásica. A avaliação histológica do tecido removido demonstrou a presença de leve acantose, hiperplasia irregular de epitélio e moderado infiltrado inflamatório linfoplasmocitário no tecido conjuntivo. Como conclusão, os autores sugeriram que, apesar dos fatores locais, como higiene bucal inadequada, desempenharem um papel importante para o desenvolvimento da hiperplasia, é o mecanismo de ação dos bloqueadores dos canais de cálcio o responsável pelas alterações gengivais.

54 52 Bowman et al. 5 (1988) avaliaram o crescimento gengival induzido pelo diltiazem, em uma paciente de setenta e dois anos, tratada com o medicamento, dinidrato de isosorbite e digoxina por dois anos e meio. Clinicamente, foi verificado crescimento gengival localizado, com superfície irregular. A análise histológica do tecido removido demonstrou hiperplasia epitelial com acantose e paraqueratose, cristas epiteliais alongadas, tecido conjuntivo com densas fibras colágenas e moderado aumento de fibroblastos. Adicionalmente, havia uma reação inflamatória com linfócitos e plasmócitos localizados perivascularmente e vasos sanguíneos dilatados. King et al. 33 (1993) avaliaram setenta e dois pacientes transplantados renais, com mais de vinte anos e que apresentavam todos os dentes anteriores superiores e inferiores, dividindo-os em quatro grupos: grupo 1 pacientes medicados com ciclosporina por, no mínimo, três meses (n=18); grupo 2 - ciclosporina / nifedipina (n=15); grupo 3 - ciclosporina / diltiazem (n=12) e grupo 4 pacientes medicados com azitromicina (controle negativo, n=21). Foi realizado exame periodontal completo e índice de hiperplasia para avaliar o grau de crescimento gengival em todos os dentes anteriores dos pacientes. O perfil farmacológico da concentração da droga no sangue e na saliva foi mensurado através de imunoensaio fluorescente. O crescimento gengival foi encontrado em 47% dos casos, em todos dos grupos testes, com diferenças estatisticamente significativas quanto ao índice de hiperplasia

55 53 entre o grupo controle e todos os demais. A hiperplasia gengival estava associada ao acúmulo de placa e cálculo, mas não à dose da ciclosporina, duração da terapia, concentração da droga no soro e na saliva e associação ciclosporina / nifedipina ou diltiazem. Os autores concluíram que a ciclosporina isolada ou em associação com bloqueador dos canais de cálcio causou uma alteração gengival significante comparada com o grupo controle; entretanto, o efeito da ciclosporina na indução de crescimento gengival não foi potencializado com a adição de um antagonista de cálcio. Bullon et al. 8 (1995) avaliaram treze pacientes cardíacos, tratados com diltiazem (120 a 360 mg/dia) por pelo menos, seis meses, comparados com dois grupos controle: dez pacientes cardíacos, porém não tratados com bloqueador dos canais de cálcio e doze pacientes sistemicamente saudáveis. Foram obtidos os índices de sangramento à sondagem e os índices de placa para cada paciente, e mensurado o tamanho da gengiva ao redor dos seis dentes anteriores utilizando modelos superiores e inferiores. Não foi observada diferença significativa quanto ao índice de placa entre os grupos, porém o índice de sangramento à sondagem foi estatisticamente diferente entre o grupo do diltiazem e os demais. Os maiores escores de crescimento gengival foram encontrados no grupo do diltiazem, apresentando diferenças significativas em relação aos outros grupos.

56 54 Bullon et al. 9 (1996) desenvolveram um estudo longitudinal por um ano para avaliação da condição gengival e periodontal de pacientes tratados com nifedipina e diltiazem, após a realização do tratamento periodontal. Foram comparados pacientes tratados com nifedipina (NG, n=18) e pacientes tratados com diltiazem (DG, n=13) com pacientes cardíacos, porém não tratados com bloqueador dos canais de cálcio (CG, n=12) e pacientes sistemicamente saudáveis com periodontite moderada (HG, n= 12). Todos os pacientes foram submetidos ao tratamento periodontal básico e às consultas de manutenção após quatro e oito meses, quando as instruções de higiene bucal foram reforçadas, sendo reexaminados após doze meses. No exame inicial os grupos NG e DG apresentaram um tecido gengival mais espesso que os grupos CG e HG, sendo esta diferença significante. Entretanto, após doze meses, essa diferença permaneceu apenas a nível interproximal. O número de pacientes com crescimento gengival foi muito maior nos grupos CG (92%), DG (100%) e NG (89%) na primeira visita, enquanto na última visita as diferenças permaneceram apenas nos grupos DG (85%) e NG (83%). A profundidade de sondagem apresentou uma redução muito maior nos grupos HG e CG em comparação aos grupos DG e NG, devido a um maior ganho no nível de inserção clínica. A quantidade de placa e sangramento à sondagem diminuiu significativamente nos grupos HG e CG entre os dois períodos de

57 55 avaliação. Assim, os achados demonstram que os pacientes medicados com diltiazem e nifedipina apresentam crescimento gengival e sua resposta ao tratamento periodontal básico é menos eficaz quando comparada com pacientes saudáveis sistemicamente ou cardíacos não tratados com bloqueador dos canais de cálcio. Ellis et al. 19 (1999) desenvolveram um estudo populacional no nordeste da Inglaterra para determinar a prevalência e severidade do crescimento gengival em pacientes que estavam sob acompanhamento médico, utilizando nifedipina, diltiazem ou amlodipina; como também para identificar os fatores de risco nesse grupo de pacientes em relação ao desenvolvimento de crescimento gengival. Foram selecionados oitocentos e nove pacientes que estavam utilizando uma das drogas (quatrocentos e quarenta e dois - nifedipina, cento e oitenta e um - amlodipina, cento e oitenta e seis - diltiazem) por no mínimo seis meses, que apresentavam pelo menos seis dentes anteriores e não estavam utilizando outro medicamento. O grupo controle era formado por cento e dois pacientes que eram hipertensos tratados por outro medicamento a não ser bloqueador dos canais de cálcio. A higiene bucal foi avaliada através do índice de placa, a inflamação gengival pelo índice de sangramento marginal (nas papilas) e a severidade do crescimento gengival através de fotografias da região anterior. O sexo, idade, duração do tratamento, dosagem da droga e classe social foram analisados e

58 56 correlacionados. Mais de 6,3% dos pacientes tratados com nifedipina apresentaram significante crescimento gengival, sem diferença estatística entre os grupos diltiazem e amlodipina quando comparados com o controle. Não houve diferença significante entre os grupos teste quanto à idade, sexo ou duração do tratamento, mas para o grupo de nifedipina, o índice de sangramento papilar e o gênero foram fatores de risco identificados. Portanto, os achados deste estudo confirmaram que a prevalência do crescimento gengival induzido pelos bloqueadores de canais de cálcio é baixa, sendo a nifedipina responsável pelas maiores alterações gengivais, e que a presença de inflamação gengival é um importante cofator para a expressão desta alteração. Morisaki et al. 43 (2000) estudaram os efeitos combinados do tratamento oral com ciclosporina A e nifedipina ou diltiazem, no crescimento gengival em ratos. Os animais foram alimentados com uma dieta contendo só ciclosporina (CsA), nifedipina, ou diltiazem, ou CsA misturada com um dos bloqueadores de canais de cálcio, totalizando seis grupos incluindo o grupo controle que recebeu a mesma dieta padrão porém sem a droga. Foram utilizados trinta ratos machos Fischer jovens que foram observados por quarenta dias e examinados quanto aos efeitos da administração da droga sozinha ou em combinação na indução do crescimento gengival, crescimento do animal e concentração da droga no sangue. Como resultado, os autores demonstraram que o ganho de peso

59 57 dos ratos tratados com CsA (sozinha ou combinada) foi significativamente menor quando comparado aos demais grupos. Porém, os grupos tratados apenas com bloqueadores dos canais de cálcio não apresentaram diferença estatística significativa em relação ao grupo controle. O tratamento oral com nifedipina, CsA ou diltiazem induziu um significante crescimento gengival, sendo a ciclosporina o mais potente indutor, mas a combinação da CsA com um bloqueador de canal de cálcio induziu um crescimento gengival ainda mais severo do que apenas a CsA. A concentração sangüínea de nifedipina foi aumentada com a combinação de CsA / nifedipina, enquanto que o nível do diltiazem no sangue foi reduzido quando combinado CsA / diltiazem, sendo que o nível de CsA foi significativamente reduzido em ambos os tratamentos de combinação. Bullon et al. 10 (2001) desenvolveram um estudo para analisar o infiltrado inflamatório periodontal presente em pacientes com doença cardíaca, tratados com bloqueadores dos canais de cálcio (nifedipina e diltiazem) ou não tratados com essas drogas, comparando-os a um grupo sadio, e avaliar as alterações apresentadas neste infiltrado após a terapia periodontal. Exame periodontal, índice de placa, sangramento à sondagem e a medida da gengiva na região anterior foram registrados antes e após quatro, oito e doze meses do tratamento. Foram retiradas biópsias da região dos dentes e 32-33, entre dois a três milímetros abaixo da parte superior da papila interproximal, no exame inicial e após doze meses.

60 58 Usando hematoxilina-eosina foram contados os plasmócitos, linfócitos, histiócitos e neutrófilos. Linfócitos T e B foram avaliados usando anticorpos monoclonais anti-cd20 e anti-cd45ro. Nenhuma diferença significante foi encontrada entre os grupos quanto ao sexo e a idade dos pacientes em relação ao número de células encontradas. As biópsias dos diferentes grupos demonstraram características histológicas similares com pequenas variações, moderado infiltrado inflamatório, aumento dos capilares sanguíneos com endotélio proeminente, aumento das fibras colágenas no tecido conjuntivo e epitélio com alongamento das papilas epiteliais, paraqueratose e acantose. Diferenças estatísticas foram notadas quanto ao número de linfócitos na biópsia inicial e após o tratamento. O grupo sadio demonstrou significante redução de plasmócitos, linfócitos e histiócitos enquanto que no grupo da nifedipina houve redução dos linfócitos B. Os autores concluíram que, a nifedipina afeta o infiltrado inflamatório com maior número de linfócitos B, sendo que essas células diminuem significantemente após o tratamento periodontal. Bullon et al. 11 (2003) estudaram a morfologia estrutural da gengiva de pacientes cardíacos tratados com nifedipina (NG, n=18) e tratados com diltiazem (DG, n=13), comparados a pacientes cardíacos, porém não tratados com bloqueador dos canais de cálcio (CG, n=12) e pacientes sistemicamente saudáveis com, no mínimo, duas bolsas periodontais entre 3 a 5 milímetros (HG, n=18). Após a

61 59 realização do exame periodontal e da mensuração do tamanho gengival nos dentes anteriores de todos os pacientes, uma biópsia foi removida de todos os casos, através de punção na região de papila entre ou O número de pacientes com crescimento gengival foi maior nos grupos DG (100%), CG (92%) e NG (89%). O estudo ultraestrutural no grupo CG mostrou células inflamatórias, fibras colágenas dilaceradas e maior ampliação de mitocôndrias dos fibroblastos, morfologicamente comprometidas. Estudo morfométrico neste mesmo grupo mostrou que as mitocôndrias estavam em número reduzido, mas aumentadas em volume, sugerindo um sofrimento metabólico celular. Nos grupo DG e NG os dados morfométricos foram similares ao HG. A presença de miofibroblastos e neosíntese de colágeno foi detectada nos grupos DG e NG. Assim, a administração de nifedipina e diltiazem afeta o influxo de cálcio e parece restaurar o metabolismo celular, com conseqüente processo de diferenciação para síntese de fibras e neodeposição de fibronectina. Em vista do exposto acima ficou constatado a relativa ausência de estudos em animais avaliando a influência dos diferentes fatores de risco na indução ou não de crescimento gengival pelo diltiazem.

62 60 PROPOSIÇÃO O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do diltiazem, um medicamento anti-hipertensivo tipo bloqueador dos canais de cálcio, em diferentes dosagens e tempos de aplicação, na indução de crescimento gengival em ratos.

63 61 MATERIAL E MÉTODO Este protocolo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Odontologia de Araraquara-UNESP (nº 09/2002, em anexo). Animais No presente trabalho foram utilizados ratos (Rattus norvegicus albinus, Holtzman), machos, pesando inicialmente entre sessenta a oitenta gramas, com aproximadamente vinte e oito dias de vida, provenientes do biotério central da UNESP, Campus de Araraquara. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas, separados de acordo com o grupo experimental e alimentados com ração sólida e água ad libitum. A temperatura ambiente foi controlada a 25 C e a umidade em 55%. O tempo de exposição ao claro foi de doze horas e trinta minutos e ao escuro de onze horas e trinta minutos. A pesagem dos animais foi realizada três vezes por semana, sendo o peso anotado em uma planilha, que foi utilizada para o acompanhamento do crescimento e desenvolvimento do animal e para definição da quantidade da droga a ser usada.

64 62 Descrição do protocolo experimental Quarenta (40) ratos foram aleatoriamente distribuídos em oito grupos de cinco animais, sendo que três grupos receberam 5, 20 e 50 mg/kg de peso corporal/dia respectivamente de diltiazem por vinte (20) dias. Outros três grupos receberam as mesmas dosagens por um período de quarenta (40) dias. Os grupos controle receberam solução de NaCl a 0,9% por vinte e quarenta dias. O diltiazem cloridrato (sal) C 22 H 26 N 2 O 4 S.HCl foi pesado diariamente de acordo com o peso corporal do animal e acondicionado em eppendorfs devidamente identificados. No momento da aplicação, a droga foi diluída em 0,2mL de água destilada estéril e a solução aplicada, por meio de uma seringa hipodérmica no dorso do animal, por via subcutânea, uma vez ao dia, mantendo-se constante o horário da aplicação. Observações macroscópica Finalizadas as aplicações, os animais foram mortos com injeção intraperitoneal de hidrato de cloral a 20%, na dosagem letal de 2 ml/100g de peso corporal. Logo após a morte, a mandíbula e o fígado de cada animal foram removidos e avaliados quantos as características macroscópicas presentes. Posteriormente, os

65 63 espécimes foram colocados em frascos codificados contendo formol tamponado a 10% e enviados ao laboratório para tramitação de rotina. Processamento histológico Após a fixação em formol tamponado a 10%, durante sete dias, as mandíbulas foram lavadas em água corrente por vinte e quatro horas e desmineralizadas em solução Morse (50 ml de ácido fórmico a 50% e 50 ml de citrato de sódio a 20%), durante dois meses, sendo a solução de descalcificação trocada a cada três dias. As hemimandíbulas direita e esquerda foram reduzidas e a região de primeiro molar inferior foi submetida à desidratação em ordem crescente de álcool, diafanização em xilol (processador automático - Leica Reichert & Jung products, Germany), e inclusão em parafina (inclusora automática.- Leica Reichert & Jung products, Germany). A microtomia foi realizada em micrótomo automático JUNG SUPERCUT 2065 (Leica Reichert & Jung products, Germany), no qual foram obtidos cortes histológicos seriados com espessura de 5µm da região do primeiro molar inferior da hemimandíbula direita. Esses cortes foram realizados no plano longitudinal dos dentes, no sentido vestíbulo-lingual, sendo então corados com hematoxilina / eosina (H/E), azul de toluidina e tricrômico de Masson.

66 64 Os fígados foram fixados em formol tamponado a 10%, lavados em água corrente por vinte e quatro horas, reduzidos a uma amostra transversal única para cada peça, desidratados em ordem crescente de álcool, diafanizados em xilol (processamento automático - Leica Reichert & Jung products, Germany) e incluídos em parafina (inclusora automática.- Leica Reichert & Jung products, Germany). Posteriormente, a microtomia foi realizada da mesma forma que para as hemimandíbulas e as lâminas foram coradas com hematoxilina / eosina. Análise microscópica Com auxílio de um microscópio de luz transmitida, as lâminas coradas foram submetidas à análise histológica para observações quanto às características morfológicas do tecido epitelial e conjuntivo da gengiva marginal. Foram observadas: A. Morfologia do epitélio do sulco gengival e epitélio bucal. B. Morfologia do tecido conjuntivo: fibras colágenas, vasos sanguíneos e elementos celulares. C. Substância amorfa. As lâminas com as amostras dos fígados coradas com H/E foram avaliadas quanto à presença de alterações morfológicas nos hepatócitos.

67 65 Análise Histométrica Para a análise histométrica foram selecionadas quatro lâminas de cada animal coradas em H/E representando as porções iniciais, intermediária e final da gengiva marginal de cada animal, para posterior avaliação, na face vestibular do primeiro molar inferior direito, das seguintes medidas de área: 1) área do tecido conjuntivo área total correspondente à largura do tecido conjuntivo delimitado apicalmente pelo término do epitélio juncional; 2) área do epitélio - área total compreendendo epitélio juncional, epitélio do sulco e epitélio externo delimitada apicalmente pela medida linear da largura do tecido conjuntivo. 1 2 Figura 1 - Identificação dos locais de mensuração de área do tecido conjuntivo e epitelial para cada corte histológico.

68 66 Para realização das medidas de área foram utilizados os seguintes equipamentos: um microscópio óptico DIASTAR (Leica Reichert & Jung products, Germany) com objetiva para aumento de 10/0.25; uma câmera de vídeo DXC-107AP (SONY Electronics Inc., Japan) adaptada ao microscópio; um microcomputador 486DX - 66Mhz e um software analisador de imagens (SigmaScan Pro, Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA). Para a análise histométrica foram avaliadas todas as lâminas coradas em H/E, sendo quatro lâminas por animal, selecionadas de forma padronizada, representando as porções inicial, intermediária e final da gengiva marginal de cada animal. Cada lâmina apresentava 10 cortes histológicos e a medida de área do epitélio e conjuntivo foi adquirida do primeiro e quinto corte, na região de gengiva marginal da face vestibular (SPOLIDORIO et al 65, 2002). As medidas de área de tecido conjuntivo e tecido epitelial, obtidas no computador através do programa SigmaScan Pro, eram fornecidas em pixels. Para transformação de pixel em milímetros utilizou-se uma escala padrão que correlacionava as unidades. Desta forma, por ter sido utilizado um aumento de dez vezes, um (1) milímetro equivalia à setecentos e noventa (790) pixels.

69 67 RESULTADOS Aspectos macroscópicos A análise macroscópica da gengiva dos molares inferiores dos ratos dos grupos controle e experimentais, tanto nas regiões vestibulares como nas regiões linguais, apresentavam aspectos clínicos semelhantes. A gengiva era firme, rósea, contornava a porção cervical dos dentes, terminando em forma afilada como borda de faca, com papilas interdentais nítidas assumindo formas triangulares em todos os molares inferiores. Os fígados apresentavam-se sem alteração de volume tecidual. Análise microscópica Nos ratos controle a gengiva marginal ou livre das superfícies vestibular e lingual possuía forma piramidal com sua vertente externa voltada para a cavidade oral, que era compreendida entre o vértice na margem gengival e a depressão que se seguia ao contorno do dente. A face voltada para o dente era constituída de dois segmentos: o sulco gengival e o epitélio juncional e apresentavam-se

70 68 com organização estrutural dos seus componentes dentro da normalidade. O epitélio bucal era coberto por epitélio pavimentoso estratificado queratinizado. Devido à disposição em camadas, o epitélio bucal era composto pelo estrato basal (formado por uma ou duas camadas de células), estrato espinhoso (formado por células poliédricas) e pelo estrato granuloso (formado por células achatadas com seu longo eixo paralelo à superfície do epitélio, apresentando citoplasma com grande quantidade de grânulos de queratohialina). A interface entre o epitélio gengival e o conjuntivo subjacente era composta por pequenas cristas epiteliais para o interior do tecido conjuntivo denso. O epitélio sulcular era pavimentoso estratificado, com a porção próxima à borda livre da gengiva queratinizada. Era delgado e penetrava lateralmente em direção apical até epitélio juncional. O epitélio juncional na sua porção mais apical era formado por 2-3 camadas de células. Porém, em direção coronária, o epitélio juncional aumentava gradualmente chegando a ter 8-10 camadas de células. As células cúbicas estavam próximas à lâmina própria ou quando achatadas, tinham seu longo eixo voltado para a superfície dentária, estando frouxamente arranjadas. Esta porção do epitélio não apresentava queratinização e estava infiltrada por alguns neutrófilos. O tecido conjuntivo que constitui a lâmina própria da gengiva marginal mostrava densos feixes de fibras colágenas à semelhança das fibras principais do ligamento periodontal. Tais fibras eram entremeadas por

71 69 delicadas figuras vasculares de diversos calibres, com numerosos fibroblastos estrelados ou fusiformes com núcleo elíptico. Na regiâo apical, subjacente ao epitélio juncional, observava-se discreto infiltrado inflamatório de células mononucleares (figuras 2 e 3). A organização estrutural dos componentes da gengiva nas faces vestibular e lingual do primeiro molar inferior direito dos ratos tratados com diltiazem mantinham aspectos normais. Os tecidos e células tanto do epitélio quanto do tecido conjuntivo (corio) eram normais à semelhança da gengiva marginal dos ratos controle, independente da dose utilizada e do período de administração da droga (figuras 4 e 5). Análise histométrica Ferramentas estatísticas utilizadas: 1. Cálculos de estatísticas descritivas (ZAR 73, 1999); 2. Testes não paramétricos (ZAR 73, 1999): a. teste de Kruskal-Wallis: comparação de medianas para mais de dois grupos amostrais; b. teste de Mann-Whitney: comparação de medianas para amostras independentes; c. teste de comparação múltipla: comparações entre grupos dois a dois.

72 70 Comparação de área de tecido conjuntivo (A1) e de tecido epitelial (A2) entre as diferentes dosagens do diltiazem, durante 20 dias de aplicação. Os cálculos das estatísticas descritivas apresentadas na tabela 1 dão indicativos de não existir diferenças entre os grupos (controle, 5 mg/kg, 20 mg/kg e 50 mg/kg). Houve uma pequena variação entre eles, porém esta não foi significativa. Tabela 1- Estatísticas descritivas calculadas para área mediana (mm 2 ) do tecido conjuntivo (A1) e área do tecido epitelial (A2). Resultado da comparação entre as diferentes dosagens do diltiazem para o período de 20 dias. Valores apresentados segundo a ordem de grandeza da mediana. ÁREA DOSAGEM n Mediana Extremos Quartis (25%-75%) A1 50 mg/kg 5 22,16 17,47-32,73 19,42-28,44 5 mg/kg 5 22,93 13,64-36,72 15,99-31,37 20 mg/kg 5 27,59 16,59-37,41 19,18-35,18 Controle 5 31,75 18,84-34,74 21,63-34,11 A2 5 mg/kg 5 35,25 25,21-39,17 27,30-38,06 50 mg/kg 5 36,14 33,19-40,51 34,35-38,33 Controle 5 39,92 36,05-44,45 37,50-42,82 20 mg/kg 5 40,35 34,82-47,81 35,44-44,08 Comparação de área de tecido conjuntivo e de tecido epitelial entre as diferentes dosagens do diltiazem, durante quarenta dias de aplicação.

73 71 Os cálculos das estatísticas descritivas apresentadas na tabela 2 dão indicativos de não existir diferenças entre os grupos. Houve uma pequena variação entre os grupos, porém esta não foi significativa. Tabela 2 - Estatísticas descritivas calculadas para área mediana (mm 2 ) do tecido conjuntivo (A1) e área do tecido epitelial (A2). Resultado da comparação entre as diferentes dosagens do diltiazem para o período de quarenta dias. Valores apresentados segundo a ordem de grandeza da mediana. ÁREA DOSAGEM N Mediana Extremos Quartis (25%-75%) A1 20 mg/kg 5 14,04 9,81-21,88 11,90-18,41 5 mg/kg 5 14,20 13,91-19,08 13,97-17,34 controle 5 16,94 13,79-38,07 15,20-28,34 50 mg/kg 5 20,62 11,92-32,03 16,11-28,66 A2 20 mg/kg 5 28,16 25,95-31,46 26,12-30,20 5 mg/kg 5 28,74 26,91-33,16 27,35-31,28 50 mg/kg 5 35,85 28,96-45,49 30,05-42,56 controle 5 36,73 32,41-41,35 33,94-40,38 A aplicação dos testes comparativos possibilitou reunir evidências mais contundentes sobre as diferenças entre os grupos. A tabela 3 traz resultados da aplicação do teste de Kruskal-Wallis e das comparações múltiplas efetuadas quando a diferença entre os grupos foi estatisticamente significante. Na verdade, o teste de Kruskal-Wallis confirmou os indicativos da análise exploratória feita com base nas estatísticas descritivas mostradas na tabela 1. A análise dos resultados dá evidências de que não há uma diferença estatisticamente significante entre os valores medianos de

74 72 A1 e A2 no período de vinte dias. De um modo geral, as diferenças não foram estatisticamente significantes (p>0,05), sendo os valores de área de tecido conjuntivo e epitelial mais elevados que nos demais grupos estudados. Tabela 3 Comparação entre os grupos de diferentes dosagens quanto à mediana de área (mm 2 ) de tecido conjuntivo (A1) e epitelial (A2) para o período de vinte dias. ÁREA DOSAGEM N Mediana Teste de Comparações Kruskal-Wallis múltiplas 50 mg/kg 5 22,16 - A1 5 mg/kg 5 22,93 p=0, mg/kg 5 27,59 - Controle 5 31,75-5 mg/kg 5 35,25 - A2 50 mg/kg 5 36,14 p=0,161 - Controle 5 39,92-20 mg/kg 5 40,35 - Para as áreas de tecido epitelial nas diferentes dosagens do diltiazem, no período de quarenta dias, o teste de Kruskal-Wallis resultou em p=0,01 (Tabela 4). Isto significa que há evidências de que existe pelo menos dois grupos que diferem entre si. As comparações múltiplas evidenciam estatísticas importantes sobre as diferenças encontradas. No caso da comparação de área do tecido conjuntivo, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p=0,300), sendo que nesta região os valores de A1 foram muito próximos para todos os grupos.

75 73 Tabela 4 - Comparação entre os grupos de diferentes dosagens quanto à mediana de área (mm 2 ) de tecido conjuntivo (A1) e epitelial (A2) para o período de quarenta dias. ÁREA DOSAGEM n Mediana Teste de Comparações Kruskal-Wallis múltiplas* 20 mg/kg 5 14,04 - A1 5 mg/kg 5 14,20 p=0,300 - controle 5 16,94-50 mg/kg 5 20,62-20 mg/kg 5 28,16 A A2 5 mg/kg 5 28,74 p=0,010 A,B 50 mg/kg 5 35,85 A,B controle 5 36,73 B * letras diferentes indicam grupos com características distintas. Comparação de área de tecido conjuntivo (A1) e de tecido epitelial (A2) entre os períodos de vinte e quarenta dias, para cada dosagem do diltiazem. A comparação das áreas A1 e A2 entre os dois períodos de aplicação do diltiazem, vinte e quarenta dias, para cada dosagem do medicamento revelou evidências de igualdade das áreas A1 e A2 nos diferentes períodos de aplicação nos grupos controle, 5 e 50 mg/kg (p>0,05). Entretanto, a dosagem de 20 mg/kg revelou diferença estatisticamente significante tanto para a área A1 quanto para a área A2 nos dois períodos de aplicação. Em ambas as áreas,

76 74 A1 (p=0,0367) e A2 (p=0,0122) houve uma redução na mediana quando comparados os períodos de vinte e quarenta dias. Tabela 5 - Estatísticas descritivas e valor p associado ao teste de Mann-Whitney para comparação entre as áreas de tecido conjuntivo (A1) e de tecido epitelial (A2), para cada dosagem nos diferentes períodos de aplicação. DOSAGEM ÁREA PERÍODO (dias) n Mediana Teste de Mann-Whitney A ,75 Controle ,94 p=0,1437 A , ,73 p=0,2963 A ,93 5 mg/kg ,20 p=0,2101 A , ,74 p=0,2963 A ,59 20 mg/kg ,93 p=0,0367* A , ,16 p=0,0122* A ,58 50 mg/kg ,03 p=0,6761 A , ,21 p=0,8345 Comparação do peso dos ratos do início para o final do experimento entre os diferentes períodos de observação. Um total de quarenta ratos foi estudado em dois períodos de observação nas diferentes dosagens de diltiazem. Os pesos dos ratos foram registrados no início e no final de cada um dos

77 75 períodos de observação e comparados. Como resultado da comparação estatística verificou-se que após vinte dias, houve um aumento significativo no peso dos ratos. A aplicação do teste de comparação de médias para amostras emparelhadas resultou num valor p<0,001, revelando uma diferença altamente significativa entre os pesos inicial e final para todos os grupos. A análise dos dados de peso indicou ainda que após vinte dias os pesos dos ratos sofreu um aumento mediano acima de 100g. Os valores das medianas de ganho de peso para o período de vinte e quarenta dias estão mostrados na tabela 6. Tabela 6 Valores de ganho de peso: medianas estimadas para os períodos de vinte dias e de quarenta dias. PERÍODO DOSE n Mediana de Teste de Ganho de peso Kruskal-Wallis Controle dias 5 mg/kg p=0, mg/kg mg/kg Controle dias 5 mg/kg p=0, mg/kg mg/kg Ao avaliar os valores de p resultantes do teste de Kruskal-Wallis (tabela 6), verifica-se que não há sinais que evidenciam a existência de influência da droga ou mesmo da dosagem no ganho de peso dos ratos para vinte e quarenta dias (p>0,05).

78 76 Figura 2 Gengiva marginal da face vestibular da região do primeiro molar inferior de rato controle no período de vinte dias. O epitélio gengival oral apresenta poucas interdigitações, sendo mais freqüentes na região de gengiva inserida e o conjuntivo é denso. H/E 10x. Figura 3 Gengiva marginal da face vestibular da região do primeiro molar inferior de rato controle no período de quarenta dias. O epitélio gengival oral apresenta poucas interdigitações, sendo mais freqüentes na região de gengiva inserida e o conjuntivo é denso. H/E 10x.

79 77 a b c Figura 4 Gengiva marginal da face vestibular da região de primeiro molar inferior após tratamento com 20 mg/kg/dia de diltiazem no período de vinte dias. Observa-se normalidade dos tecidos analisados, com manutenção das estruturas celulares e teciduais quando comparado ao grupo controle. (a) H/E; (b) Azul de Toluidina e (c) Tricrômico de Masson; 10x.

80 78 a b c Figura 5 Gengiva marginal da face vestibular da região de primeiro molar inferior após tratamento com 20 mg/kg/dia de diltiazem no período de quarenta dias. Observa-se normalidade dos tecidos analisados, com manutenção das estruturas celulares e teciduais quando comparado ao grupo controle. (a) H/E; (b) Azul de Toluidina e (c) Tricrômico de Masson; 10x.

81 79 DISCUSSÃO O diltiazem é um medicamento anti-hipertensivo, tipo bloqueador dos canais de cálcio, utilizado primariamente para o controle de diversos tipos de angina, com menor efeito vasodilatador e maior efeito antiarrítmico (BULLON et al. 7, 1994; SEYMOUR 58, 1991). Essa droga atua inibindo a entrada de íons cálcio para o interior das células, bem como mobilizando o cálcio nos espaços extracelulares (MURAD 45, 1990). Desta forma, ao inibir o influxo de íons cálcio através dos canais presentes nas células da musculatura lisa vascular e cardíaca, promove a redução da contratibilidade do miocárdio e o consumo de oxigênio (BULLON et al. 7, 1994; HANOCK; SWAN 24, 1992; LEDERMAN et al. 34, 1984, NISHIKAWA et al. 48, 1991). O efeito adverso da droga mais freqüentemente observado na cavidade bucal é o crescimento gengival (BOWMAN et al. 5, 1988; BULLON et al. 8, 1995; BULLON et al. 9, 1996; BULLON et al. 10, 2001; BULLON et al. 11, 2003; ELLIS et al. 19, 1999; GIUSTINIANI et al. 23, 1987; KING et al. 33 ; 1993; MORISAKI et al. 43, 2000). Entretanto, é importante ressaltar que ao analisar a saúde geral do paciente, este é um dos efeitos indesejáveis menos prejudiciais, comparativamente à vertigem, dor de cabeça, rubor

82 80 facial, edema e queixas gastrintestinais, como náusea e dispepsia (LEDERMAN et al. 34, 1984; SEYMOUR 58, 1991). A partir do primeiro relato de crescimento gengival induzido por fenitoína, descrito por Kimbal 32 em 1939, outros estudos têm sido desenvolvidos na tentativa de compreender os fatores que atuam nesse processo. Muitos autores observaram que fatores como tempo de tratamento, idade, sexo, concentração plasmática e salivar da droga, presença de placa bacteriana, inflamação tecidual e sinergismo com outros medicamentos podem influenciar o desenvolvimento do crescimento gengival induzido por drogas (BARCLAY et al. 2, 1992; BULLON et al. 7, 1994; ELLIS et al. 16, 1993; ISHIDA et al. 28, 1995; MILLER; DAMM 40, 1992; NISHIKAWA et al. 49, 1996; VAN DER WALL et al. 71, 1985) Ishida et al. 28 (1995) avaliaram em ratos a influência isolada de fatores como idade, sexo, concentração da droga na dieta e no plasma sobre o crescimento gengival induzido pela nifedipina. Esses autores concluíram que essa alteração ocorre em concordância com a concentração plasmática e a quantidade de droga administrada na dieta, em ratos jovens do sexo masculino. Adicionalmente, Tavassoli et al. 68 (1998) avaliaram fatores como idade, sexo, tempo de administração da droga, presença/ausência de placa bacteriana e inflamação em noventa e sete pacientes tratados com nifedipina. Esses autores demonstraram

83 81 que pacientes do sexo masculino, com alto grau de inflamação e tratados com nifedipina por mais de quatro meses eram os mais propensos a apresentar crescimento gengival excessivo. Portanto, no presente estudo foram utilizados ratos machos e jovens para a avaliação da influência do tempo de tratamento e da concentração da droga administrada. A análise do peso dos animais não demonstrou diferença significativa entre os grupos experimentais (administração do diltiazem) e controle quanto à mediana de peso corporal ganho, em ambos os períodos de observação (tabela 6), concordando com os achados de Fu et al. 20 (1998), Ishida et al. 28 (1995), Morisaki et al. 44 (1993) e Morisaki et al. 43 (2000). Esses autores demonstraram que a nifedipina e/ou diltiazem não afetaram o crescimento dos animais. Quanto ao aspecto clínico sabe-se que o crescimento gengival em humanos manifesta-se como aumento gengival generalizado, lobulado, com provável origem interdental, acometendo inclusive gengiva inserida, sendo mais marcante na região anterior, vestibular e lingual. O tecido apresenta-se denso e fibroso, com coloração normal, observando-se, entretanto edema, ulceração e sangramento quando há um processo inflamatório associado (AKIMOTO et al. 1, 1991; BOWMAN et al. 5, 1988; BULLON et al. 8, 1995; BULLON et al. 9, 1996; BUTLER et al. 12, 1987; ELLIS et al. 19, 1999; GIUSTINIANI et al. 23, 1987; HANCOCK; SWAN 24, 1992; JAMES

84 82 et al. 29, 2000; LOMBARDI et al. 35, 1991; McKEVITT; IRWIN 41, 1995; O VALLE et al. 52, 1995; SEYMOUR 58, 1991). Já em animais, Fu et al. 20 (1998) constataram que a administração de nifedipina resultou em aumento significante das dimensões gengivais (largura vestibulo-lingual, mesio-distal e altura vertical), dependente da dosagem e tempo de tratamento. Da mesma forma, Spolidorio et al. 65 (2002) avaliando macroscopicamente e microscopicamente a morfologia gengival em ratos tratados com nifedipina e/ou ciclosporina observaram evidente crescimento gengival. Entretanto, no presente estudo, utilizando o diltiazem, não foi observado, macroscopicamente, crescimento gengival evidente em nenhum dos animais. O fígado dos animais foram avaliados para a comprovação de que a concentração da droga administrada não provocou hepatotoxicidade. Os resultados demonstraram que não houve alteração morfológica nos hepatócitos dos animais, confirmando que a dose estava dentro dos limites toleráveis pelo animal. A avaliação histológica, no presente estudo, revelou que o tecido gengival dos grupos experimentais (tratados com diltiazem) apresentou características de normalidade, semelhante ao grupo controle (figuras 2, 3, 4 e 5). Entretanto, outros autores (BOWMAN et al. 5, 1988; BULLON et al. 10, 2001; BULLON et al. 11, 2003; GIUSTINIANI et al. 23, 1987) avaliaram o tecido gengival de humanos tratados com diltiazem e

85 83 observaram a presença de características histológicas similares ao crescimento gengival induzido por outras drogas como nifedipina, ciclosporina e fenitoína, como presença de espessamento epitelial com paraqueratose, acantose e projeções epiteliais alongadas que se anastomosam. Em relação ao tecido conjuntivo os estudos evidenciaram feixes de fibras colágenas e substância fundamental apresentando grande quantidade de glicosaminoglicanas, aumento do número de fibroblastos e da vascularização e reação inflamatória moderada com presença de linfócitos e plasmócitos localizados perivascularmente (AKIMOTO et al. 1, 1991; BROWN et al. 6, 1990; LEDERMAN et al. 34, 1984; LOMBARDI et al. 35, 1991; MILLER; DAMM 40, 1992; NISHIKAWA et al. 48, 1991; NYSKA et al. 51, 1990; RAMON et al. 55, 1984, SEYMOUR 58, 1991; VAN DER WALL et al. 71, 1985). Quanto ao tempo de administração da droga, de acordo com Nishikawa et al. 49 (1996), o tempo mínimo de administração da droga para a visualização de crescimento gengival em ratos induzido por fenitoína, ciclosporina ou nifedipina é de vinte dias, sendo que em quarenta dias esse crescimento tende a se estabilizar. Portanto, no presente estudo foi avaliado a influência das diversas concentrações do diltiazem durante vinte e quarenta dias de aplicação. O resultado da análise histométrica demonstrou que o período de vinte dias não foi suficiente para induzir crescimento

86 84 gengival para nenhuma das concentrações do diltiazem (tabelas 1 e 3). Do mesmo modo, o período de quarenta dias também não provocou essa alteração (tabelas 2 e 4). Entretanto, a concentração de 20 mg/kg apresentou redução significativa da área de tecido conjuntivo e epitelial quando comparado ao período de vinte e quarenta dias (figuras 4 e 5). Para as demais dosagens e grupo controle não foram verificadas diferenças significativas (tabela 5) na comparação entre os períodos. Já, Morisaki et al. 43 (2000) observaram crescimento gengival significativo em ratos que receberam na sua dieta µg/g por dez dias µg/g por trinta dias de diltiazem, alcançando uma concentração plásmatica da droga de 19.8 ng/ml. Os achados de Morisaki et al. 43 (2000) contradizem os resultados do presente estudo, porém deve-se ressaltar que a via de administração utilizada para aplicação da droga bem como a concentração do diltiazem foram diferentes para ambos os estudos. Uma explicação pode ser que a droga injetada no subcutâneo dos ratos não tenha atingido a concentração plasmática próxima dos resultados alcançados pela administração do diltiazem na dieta. Outro possível fator pode ser a dosagem do diltiazem administrado na dieta no estudo destes autores, sendo muito maior que as dosagens utilizadas no presente estudo.

87 85 Além disso, o tempo de administração da droga necessário para visualização macroscópica de alteração no tecido gengival é muito variável de acordo com a espécie e a medicação. Em ratos, Nishikawa et al. 49 (1996) demonstraram que o tempo mínimo para visualização de crescimento gengival induzido por nifedipina, fenitoína ou ciclosporina é de vinte dias. Nyska et al. 51 (1990) estabeleceram como tempo mínimo para indução dessa alteração gengival em ratos tratados com oxodipina um período de oito a nove meses. Já em humanos, Bullon et al. 8 (1995) avaliaram 13 pacientes cardíacos tratados com diltiazem, numa concentração diária variando de 120 a 360 mg/kg, por pelo menos seis meses, e verificaram que estes apresentaram maiores escores de crescimento gengival em relação ao grupo controle. Para a avaliação do efeito das diferentes concentrações do diltiazem, os animais foram distribuídos em quatro grupos (0, 5, 20 e 50 mg/kg). Partindo do pressuposto que a dosagem de 5 mg/kg é correspondente à média de ingestão diária de um adulto hipertenso, dosagens maiores foram utilizadas para avaliação da influência do aumento da dosagem sobre o tecido gengival, seguindo protocolos experimentais que utilizaram outras drogas anti-hipertensivas em animais, como os estudos que avaliaram a indução de crescimento gengival com o uso de nifedipina (CHIU et al. 14, 2001; FU et al. 20, 1998; HEIJL;

88 86 SUNDIN 25, 1988; ISHIDA et al. 28, 1995; MORISAKI et al. 43, 2000; MORISAKI et al. 44, 1993; SPOLIDORIO et al ; SPOLIDORIO et al. 65, 2002). O presente estudo não demonstrou diferença estatisticamente significante para área de tecido conjuntivo e epitelial entre as diferentes dosagens do diltiazem e grupo controle no período de vinte dias (tabelas 1 e 3), sugerindo que neste período o fator concentração da droga não influenciou na indução dessa alteração gengival. Para o período de quarenta dias, os resultados foram similares, exceto para área de tecido epitelial (p=0,01) (tabelas 2), sendo que neste caso, o teste de comparação múltipla revelou que o grupo de 20 mg/kg foi significativamente diferente do controle, porém ambos não foram diferentes dos demais grupos (tabela 4). Entretanto, Fu et al. 20 (1998) demonstraram que o crescimento gengival induzido pela nifedipina foi influenciado pela concentração da droga administrada na dieta, sendo que para o grupo que recebeu 50 mg/kg, as dimensões gengivais aumentaram em relação ao grupo que recebeu 30 mg/kg ou controie. Além disso, Ishida et al. 28 (1995) avaliaram a influência da concentração da nifedipina administrada na dieta sobre a concentração da droga encontrada no plasma sangüíneo. Na dieta, a concentração variou de 50 a 250 mg/kg, enquanto no sangue esta variou de 300 a 1100 ng/ml nos ratos machos e 600 a 2100 ng/ml nas fêmeas. A concentração da droga no plasma influenciou

89 87 na profundidade de sondagem em ratos machos e fêmeas sendo significativamente maior que no controle quando esta atingiu 800 ng/ml para machos e 1100 ng/ml para fêmeas. Portanto, não só a via de administração da droga, como também a concentração desta no plasma sangüíneo podem ser fatores importantes para o desencadeamento de alterações gengivais. Desta forma, embora não tenha sido observado no presente estudo crescimento gengival induzido pelo diltiazem em ratos, outros estudos devem ser realizados com o objetivo de elucidar se concentrações maiores da droga, outras vias de administração ou tempo mais prolongados de utilização da droga poderiam causar essa alteração gengival. É muito importante ressaltar que atualmente a hipertensão é considerada um problema de saúde pública, e que a incidência de pacientes jovens com essa alteração está aumentando vertiginosamente em todo o mundo. Portanto, o uso de medicamentos anti-hipertensivos é e será cada vez mais empregado. Devido à ausência de estudos com outros medicamentos bloqueadores dos canais de cálcio amplamente utilizados, estes são necessários para uma possível detecção de efeitos adversos na cavidade bucal, visto que apenas para a nifedipina a literatura específica enfatiza a possibilidade de ocorrência dessa alteração gengival.

90 88 CONCLUSÃO De acordo com os objetivos deste estudo e em vista dos resultados obtidos, pode-se concluir que: 1. A utilização do diltiazem não influenciou no crescimento dos animais, quando administrado por vinte e quarenta dias; 2. O diltiazem não induziu crescimento gengival em ratos tratados por um período de vinte e quarenta dias, sugerindo que o fator tempo de administração da droga não influenciou na indução dessa alteração gengival; 3. Não houve influência das diferentes dosagens do diltiazem na indução de crescimento gengival, nos períodos de vinte e quarenta dias de observação.

91 89 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1) AKIMOTO, Y. et al. Gingival hyperplasia induced by nifedipine. J. Nihon. Univ. Sc. Dent., Tokyo, v.33, n.3, p , Sept ) BARCLAY, S. et al. The incidence and severity of nifedipineinduced gingival overgrowth. J. Clin. Periodontol., Copenhagem, v.19, n.5, p , May ) BENNETT, W.M.; PULLIAM, J.P. Ciclosporin nephrotoxicity. Ann. Intern. Med., Philadelphia, v.99, n.6, p , Dec ) BONNAURE-MALLET, M.; TRICOT-DOLEUX, S.; GODEAU, G.J. Changes in extracellular matrix macromolecules in human gingiva after treatment with drugs inducing gingival overgrowth. Arch. Oral Biol., Oxford, v.40, n.5, p , May ) BOWMAN, J.M.; LEVY, B.A.; GRUBB, R.V. Gingival overgrowth induced by diltiazem. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., St Louis, v.65, n.2, p , Feb ) BROWN, R.S. et al. Nitrendipine-induced gingival hyperplasia. First case report. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., St Louis, v.70, n.5, p , Nov

92 90 7) BULLON, P.et al. Clinical assassment of gingival hyperplasia in patients treated with nifedipine. J. Clin. Periodontol., Copenhagem, v.21, n.4, p , Apr ) BULLON, P. et al. Clinical assessment of gingival size among patients treated with diltiazem. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., St Louis, v.79, n.3, p , Mar ) BULLON, P. et al. Evaluation of gingival and periodontal conditions following causal periodontal treatment in patients treated with nifedipine and diltiazem. J. Clin. Periodontol., Copenhagem, v.23, n.7, p , July ) BULLON, P. et al. The gingival inflammatory infiltrate in cardiac patients treated with calcium antagonists. J. Clin. Periodontol., Copenhagem, v.29, p , ) BULLON, P. et al. Ultrastructure of the gingival in cardiac patients treated with or without calcium channel blockers. J. Clin. Periodontol., Copenhagem, v.30, n.8, p , Aug ) BUTLER, R.T.; KALKWARF, K.L.; KALDAHL, W.B. Druginduced gingival hyperplasia phenytoin, cyclosporine and nifedipine. J Am. Dent. Assoc., Chicago, v.114, p.56-60, Jan 1987.

93 91 13) CAMPESE, V.M.; NOSRATI, S. Diagnosis and evaluation of secondary hypertension. Clin. Cornerstone, Belle Mead, v.2, n.1, p.27-39, ) CHIU, H.C. et al. Does nifedipine aggravate cyclosporin-induced gingival overgrowth? An experiment in rats. J. Periodontol., Chicago, v.72, n.4, p , Apr ) DONGARI, A.; McDONNELL, H.T.; LONGLAIS, R.P. Druginduced gingival overgrowth. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., St Louis, v.76, n.4, p , Oct ) ELLIS, J.S. et al. Disposition of nifedipine in plasma and gingival crevicular fluid in relation to drug-induced gingival overgrowth. J. Periodontal Res., Copenhagem, v.28, n.5, p , Sept ) ELLIS, J.S. et al. Gingival sequestration of nifedipine-induced gingival overgrowth. Lancet, London, v.339, n.8806, p , June ) ELLIS, J.S. et al. Periodontal variables affecting nifedipine sequestration in gingival crevicular fluid. J. Periodontal Res., Copenhagem, v.30, n.4, p , July ) ELLIS, J.S. et al. Prevalence of gingival overgrowth induced by calcium channel blockers: a community based study. J. Periodontol., Chicago, v.70, n.1, p.63-67, Jan 1999.

94 92 20) FU, E. et al. Nifedipine-Induced gingival overgrowth in rats: brief review and experimental study. J. Periodontol., Chicago, v.69, n. 7, p , July ) FUJII, A. et al. Effect of calcium-channel blockers on cell proliferation, DNA synthesis and collagen synthesis of cultured gingival fibroblasts derived from human nifedipine responders and non-responders. Arch. Oral Biol., Oxford, v.39, n.2, p , Feb ) GHANNEM, H.; HADJ FREDJ, A. Prevalence of cardiovascular risk factors in the urban population of Soussa in Tunisia. J. Public Health Med., Oxford, v.19, n.4, p , Dec ) GIUSTINIANI, S.; DELLA CUNA, F.R.; MARIENI, F. Hyperplastic gingivitis during diltiazem therapy. Int. J. Cardiol., Amsterdam, v.15, n.2, p , May ) HANCOCK, R.H.; SWAN, R.H. Nifedipine-induced gingival overgrowth. J. Clin. Periodontol., Copenhagem, v.19, n.1, p.12-14, Jan ) HEIJL, L.; SUNDIN, Y. Nitrendipine-induced gingival overgrowth in dogs. J. Periodontol., Chicago, v.60, n.2, p , Feb ) HENRY, P.D. Comparative pharmacology of calcium antagonists: nifedipine, verapamil and diltiazem. Am. J. Cardiol., New York, v.46, n.6, p , Dec

95 93 27) HOCKINGS, G.I. Altered hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in myotonic dystrophy: in vivo evidence for abnormal dihydropyridine-insensitive calcium transport. J. Clin. Endocrinol. Metab., Springfield, v.76, n.6, p , June ) ISHIDA, H. et al. Factors influencing nifedipine induced gingival overgrowth in rats. J. Periodontol., Chicago, v.66, n.5, p , May ) JAMES, J.A. et al. The calcium channel blocker used with ciclosporin has an effect on gingival overgrowth. J. Clin. Periodontol., Copenhagem, v.27, n.2, p , Feb ) JOINT NATIONAL COMMITTEE ON PREVENTION, DETECTION, EVALUATION, AND TREATMENT OF HIGH BLOOD PRESSURE. The sixth report of the Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure. Arch. Intern. Med., Chicago, v.157, n.21, p , Nov ) JORGENSEN, M.G. et al. Prevalence of amlodipina-related gingival hyperplasia. J. Periodontol., Chicago, v.68, n.7, p , July ) KIMBAL, O.P. The treatment of epilepsy with sodium diphenylhydantoin. J. Am. Med. Assoc., Chicago, v.112, p , 1939.

96 94 33) KING, G.N. et al. Gingival hyperplasia in renal allograft recipients receiving cycloporin-a and calcium antagonists. J. Clin. Periodontol., Copenhagem, v.20, n.4, p , Apr ) LEDERMAN, D. et al. Gingival hyperplasia associated with nifedipine therapy. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., St Louis, v.57, n.6, p , June ) LOMBARDI, T. et al. Felodipine-induced gingival hyperplasia: a clinical and histologic study. J. Oral Pathol. Med., Copenhagem, v.20, n.2, p.89-92, Feb ) LUCAS, R.M., HOWELL, L.P., WALL, B.A., Nifedipine-induced gingival hyperplasia. A histochemical and ultrastructural study. J. Periodontol., Chicago, v.56, n.4, p , Apr ) LUNDERGAN, W.P. Drug-induced gingival enlargements. CDA J., Los Angeles, v.17, n.6, June ) MARGIOTTA, V. et al. Cyclosporin- and nifedipine-induced gingival overgrowth in renal trasplant patients: correlations with periodontal and pharmacological parameters, and HLAantigens. J. Oral Pathol. Med., Copenhagem, v.25, n.3, p , Mar ) MARTINS, R.C.L. et al. Molecular size distribution analysis of human gingival glycosaminoglycans in ciclosporin- and

97 95 nifedipine-induced overgrowths. J. Periodontal Res., Copenhagem, v.38, n.2, p , Apr ) MILLER, C.S.; DAMM, D.D. Incidence of verapamil-induced gingival hyperplasia in a dental population. J. Periodontol., Chicago, v.63, n.5, p , May ) McKEVITT, K.M.B.; IRWIN, C.R. Phenotypic differences in growth, matrix synthesis and response to nifedipine between fibroblasts derived from clinically healthy and overgrown gingival tissue. J. Oral Pathol. Med., Copenhagem, v.24, n.2, p.66-71, Feb ) McKNIGHT, J.A.; MOORE, T.J. The effect of dietary factors on blood pressure. Compr. Ther., Harvard, v.20, n.9, p , ) MORISAKI, I. et al. Effects of combined oral treatments with ciclosporine A and nifedipine or diltiazem on drug-induced gingival overgrowth in rats. J. Periodontol., Chicago, v.71, n.3, p , Mar ) MORISAKI, I. et al. Nifedipine-induced gingival overgrowth in the presence or absence of gingival inflammation in rats. J. Periodontal Res., Copenhagem, v.28, n.6, p , Nov ) MURAD, F. Drugs used for the treatment of angina: organic nitrate, calcium channel blockers and beta-adrenergic

98 96 antagonists. In: GIMAN, A.G. et al. The pharmacological basis of therapeutics. 8 th ed, Oxford: Pergamon Press, 1990, p ) NEATON, J.D. et al. Treatment of mild hypertension study. Final results. Treatment of mild hypertension study. Research group. JAMA, Chicago, v.270, n.6, p , Aug ) NERY, E.B. et al. Prevalence of nifedipine-induced gingival hyperplasia, J. Periodontol., Chicago, v.66, n.7, p , July ) NISHIKAWA, S. et al. Nifedipine-induced gingival hyperplasia. A clinical and in vitro study. J. Periodontol, Chicago, v.62, n.1, p.30-35, Jan ) NISHIKAWA, S. et al. Pathogenesis of drug-induced gingival overgrowth. A review of studies in rat model. J. Periodontol., Chicago, v.67, n.5, p , May ) NURMENNIEMI, P.K.; PERNU, H.E.; KNUUTTILA, M.L.E. Mitotic activity of keratinocytes in nifedipine- and immunosuppressive medication-induced gingival overgrowth. J. Periodontol., Chicago, v.72, n.2, p , Feb ) NYSKA, A. et al. Gingival hyperplasia in rats induced by oxodipine a calcium channel blocker. J. Periodontolal Res., Copenhagem, v.25, n.2, p.65-68, Mar

99 97 52) O`VALLE, F. et al. Gingival overgrowth induced by nifedipine and ciclosporin A. Clinical and morphometric study with image analysis. J. Clin. Periodontol., Copenhagem, v.22, n.8, p , Aug ) PERNU, H.E. et al. Verapamil-induced gingival overgrowth: a clinical, histologic, and biochemic approach. J. Oral Pathol. Med., Copenhagem, v.18, n.7, p , Aug ) PRAXEDES, J.N. et al. Hipertensão arterial. Tratamento em grupos especiais. III Consenso Brasileiro de hipertensão Arterial, 1 a ed. Campos do Jordão: BG Cultural ) RAMON, Y. et al. Gingival hyperplasia caused by nifedipine a preliminary report. Int. J. Cardiol., Amsterdam, v.5, n.2, p , Feb ) RILEY, C.K.; TEREZHALMY, G.T. The patient with hypertension. Quitessence Int., Illinois, v.32, n.9, p , Oct ) ROSTOCK, M.H.; FRY, H.R.; TURNER, J.E. Severe gingival overgrowth associated with cyclosporine therapy. J Periodontol, Chicago, v.57, n.5, p , May ) SEYMOUR, R.A. Calcium channel blockers and gingival overgrowth. Br. Dent. J., London, v.170, n.10, p , May 1991.

100 98 59) SHAFTIC, A.A. et al. Nifedipine-induced gingival hyperplasia. Drug Intell. Clin. Pharm., Hamilton, v.20, n.7-8, p , July/Aug ) SHIMIZU, Y. et al. Nifedipine induces gingival epithelial hyperplasia in rats through inhibition of apoptosis. J. Periodontol., Chicago, v.73, n.8, p , Aug ) SLAVIN, J.; TAYLOR, J. Cyclosporin, nifedipine and gingival hyperplasia. Lancet, London, v.26, n.2, p.739, Sept ) SOORIYAMOORTHY, M.; GOWER, D.B.; ELEY, B.M. Androgen metabolism in gingival hyperplasia induced by nifedipine and cyclosporin. J. Periodontal Res., Copenhagem, v.25, n.1, p.25-30, Jan ) SPOLIDORIO, L.C. et al. Combined effects of cyclosporin and nifedipine on gingival overgrowth in rats is not age dependent. J. Periodontal Res., Copenhagem, v.38, n.4, p , Aug ) SPOLIDORIO, L.C. et al. Fatores coadjuvantes no desenvolvimento do aumento gengival induzido por drogas. Odontol. Clin., São Paulo, v.7, n.2, p.17-20, julho/dez ) SPOLIDORIO, L.C. et al. Morphological evaluation of combined effects of cyclosporin and nifedipine on gingival overgrowth in rats. J. Periodontol. Res., Copenhagem, v.37, p , 2002.

101 99 66) STAMLER, J.; STAMLER, R.; NEATON, J.D.; Blood pressure, systolic and diastolic, and cardiovascular risk. US population data. Arch. Intern. Med.,Chicago, v.153, n.5, p , Mar ) TAGAWA, T.; NAKAMURA, H.; MURATA, M. Marked gingival hyperplasia induced by nifedipine. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., Copenhagem, v.19, n.2, p.72-73, Apr ) TAVASSOLI, S. et al. The clinical effects of nifedipine on periodontal status. J. Periodontol., Chicago, v.69, n.2, p , Feb ) THOMASON, J.M. et al. Iatrogenic gingival overgrowth in cardiac transplantation. J. Periodontol., Chicago, v.66, n.8, p , Aug ) THOMASON, J.M.; SEYMOUR, R.A.; RICE, N. The prevalence and severity of cyclosporin and nifedipine-induced gingival overgrowth. J. Clin. Periodontol., Copenhagem, v.20, n.1, p.37-40, Jan ) VAN DER WALL, E.E.; TUINZING, D.B.; HES, J. Gingival hyperplasia induced by nifedipine, an arterial vasodilating drug. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., St Louis, v.60, n.1, p.38-40, July ) WESTBROOK, P. et al. Regression of nifedipine-induced gingival hyperplasia following switch to a same class calcium

102 100 channel blocker, isradipina. J. Periodontol., Chicago, v.68, n.7, p , July ) ZAR, J. H. Biostatistical analysis. 4th Ed. New Jersey: Prentice Hall, p.

103 101 APÊNDICE Apêndice 1 Pesagem dos animais no início e no final do experimento. rato Dose Período peso inicial peso final (mg/kg) (dias) (gramas) (gramas)

104 102 Apêndice 2 Dados obtidos através da análise histométrica das lâminas: valores para cada corte histológico analisado. Rato Dose Período Área conjuntivo Área epitélio Lâmina Corte (mg/kg) (dias) (mm) (mm) , , , , , , , , , , , , , , ,881 40, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,6 36, , , , , , , ,262 46, , , , , , ,7937

105 103 Rato Dose Período Área conjuntivo Área epitélio Lâmina Corte (mg/kg) (dias) (mm) (mm) , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,42152

106 104 Rato Dose (mg/kg) Período (dias) Lâmina Corte Área conjuntivo (mm) Área epitélio (mm) , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,8 52, ,443 58, ,381 33, , , , , , , , , , , , , ,343 36, , , , ,53038

107 105 Rato Dose (mg/kg) Período (dias) Lâmina Corte Área conjuntivo (mm) Área epitélio (mm) , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,481 38, , , , , , , , ,4658

108 106 Rato Dose (mg/kg) Período (dias) Lâmina Corte Área conjuntivo (mm) Área epitélio (mm) ,181 34, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,443 38, , , , , , , , , , , ,343 39, , , , , ,143 34, , , ,118 44, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,8873

109 107 Rato Dose (mg/kg) Período (dias) Lâmina Corte Área conjuntivo (mm) Área epitélio (mm) , , , , , , , , , , , , , , ,281 45, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,45316

110 108 Rato Dose (mg/kg) Período (dias) Lâmina Corte Área conjuntivo (mm) Área epitélio (mm) , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,52152

111 109 Rato Dose (mg/kg) Período (dias) Lâmina Corte Área conjuntivo (mm) Área epitélio (mm) , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,678 36, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,7519

112 110 Rato Dose (mg/kg) Período (dias) Lâmina Corte Área conjuntivo (mm) Área epitélio (mm) , , ,438 48, , , , , , , , , , , , ,4684

113 111 Apêndice 3 - Dados obtidos através da análise histométrica das lâminas: média dos valores obtidos para cada animal. Rato Dose (mg/kg) Período (dias) Área conjuntivo (mm) Área epitélio (mm) , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,587 40, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,62549

114 113 DILTIAZEM DID NOT INDUCE GINGIVAL OVERGROWTH IN RATS. A HISTOLOGICAL AND HISTOMETRIC ANALYSIS. Fernanda de Oliveira Bello Corrêa, D.D.S., M.S.* Silvana Regina Perez Orrico, D.D.S., M.S., Ph.D, Assistant Professor* Luís Carlos Spolidorio, D.D.S., M.S., Ph.D, Assistant Professor + Daniela Gonçalves, D.D.S., M.S.* Gabriela Giro, D.D.S.* Patrícia de Fátima Leite Fogaça, D.D.S.* * Department of Diagnostics and Surgery, Division of Periodontics, School of Dentistry at Araraquara, State University of São Paulo (UNESP), Araraquara, SP, Brazil. + Department of Oral Pathology, School of Dentistry at Araraquara, State University of São Paulo (UNESP), Araraquara, SP, Brazil. This work was done by the Department of Diagnostics and Surgery, Division of Periodontics, School of Dentistry at Araraquara, State University of São Paulo (UNESP), Araraquara, SP, Brazil. Correspondence should be addressed to: Silvana Regina Perez Orrico D.D.S., M.S., Ph.D, Departamento de Cirurgia e Diagnóstico, Disciplina de Periodontia, Faculdade de Odontologia de Araraquara, UNESP. Rua Humaitá, 1680, Centro, caixa postal 331, CEP: , Araraquara, SP, Brasil. Phone/Fax: 55(16) , s-orrico@foar.unesp.br

115 114 ABSTRACT Background: Diltiazem is a calcium channel blocker for treatment of hypertension and various types of angina. It may also, however, provoke gingival overgrowth although this is not frequent. This study evaluated the influence of dosage and duration of diltiazem administration on inducing gingival overgrowth in rats. Methods: Forty young male rats were separated into eight groups according to the dosage and duration of administration. The animals received 0 (control), 5, 20 or 50 mg of diltiazem daily per kilogram of bodyweight. They were sacrificed after 20 or 40 day periods for macroscopic, histologic and histometric analysis of the gingiva. Results: Macro and microscopic characteristics of the gingival tissue of all animals studied were found to be normal. Histometric analyses of the free buccal gingiva of the first lower molars showed that regarding the dosage for each period only the group of 20 mg/kg administered for 40 days presented a significant reduction in the area of the epithelial tissue in relation to the control group. Analyses of the time periods indicated that only the 20mg/kg group presented a significant reduction in both the connective (p=0.0367) and epithelial tissues (p=0.0122) when the 20 and 40 day durations were compared. Conclusions: The authors concluded that diltiazem did not induce gingival overgrowth in rats or influence their weight gain. Studies are now necessary to evaluate the influence of the 20 mg/kg and of the larger dosages administered in this study. KEY WORDS: diltiazem; antihypertensive; gingival overgrowth.

116 115 INTRODUCTION Gingival overgrowth may be of a hereditary, inflammatory, hormonal, neoplastic nature or due to secondary effects of drugs such as phenytoin, immunosupressors or calcium channel blockers. 1 Calcium channel blockers are anti-hypertensive drugs that embrace three classes: phenylalkilamin (verapamil), didropyridins (nifedipine, nicardipine, isradipine, amlodipine, nitrendipine, felodipine) and benzodiazepine (diltiazem). Diltiazem specifically inhibits penetration of calcium ions into the smooth vascular and cardiac muscle cells promoting a decrease of the myocardial contraction force. 2-5 Treatment with calcium channel blockers may induce undesirable side effects such as: edemas, headaches, nausea, dizziness, facial blushing, gastrointestinal disturbances 4,6 and gingival overgrowth The prevalence of gingival growth induced by calcium channel blockers ranges from 20 to 83% and in these cases, nifedipine 5,6,14-16 is the drug most cited. In view of changes in the treatment strategies for coronary and cardiac diseases, nifedipine is being replaced by phenylalkilamin (verapamil) and benzodiazepine (diltiazem). Factors such as age, gender, drug concentration in plasma and saliva, presence of dental biofilm, tissue inflammation and treatment time are considered risk factors for drug induced gingival overgrowth. 2,15,17-21 However, few studies with humans or animals that evaluate the effect of diltiazem on gingival tissues including or not risk factors eventually involved in the etiopathogenicity of this lesion. 10,12,14,22 This study evaluated the effect of various dosages and different administration periods of diltiazem on the induction or not of gingival overgrowth in young rats.

117 116 MATERIALS AND METHODS Forty normal male Wistar rats (Norvegicus albinus), each weighing approximately 70g, were bred in a clean room at 25 C in the animal facility of the School of Dentistry at Araraquara- UNESP. These rats were randomly separated into eight groups of five animals each. Two groups were for control and six were given 5, 20 or 50 mg of diltiazem daily per kilogram of body weight for 20 or 40 days. Diltiazem was injected subcutaneously once a day while control groups received a daily dose of saline in the same way. The rats were weighed at 3-day intervals and given the diet and tap water ad libitum in wire cages where they remained throughout the experimental period. All animal care and study protocols were in compliance with guidelines approved by Animal Experiment Committee of Araraquara School of Dentistry - UNESP. After the experimental periods the rats were sacrificed. Each mandible was carefully removed together with the surrounding gingival and soft tissue and soaked in a 10% formalin solution. After macroscopic observations the mandible was demineralized in Morse solution (50 ml of formic acid at 50% and 50 ml of sodium citrate at 20%) which was changed every week. Five micrometer serial paraffin sections were made on the buccolingual aspects of the first right molars and stained with haematoxylin and eosin. Morphological and histometric studies were performed on the buccal gingiva. Histometry Gingival epithelium and connective tissue areas were studied with a Sigma Scan computer program (Mocha, Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA). For each first molar

118 117 ten measurements were made in sections of 60 µm intervals. Statistical analyses were based on the mean value from each animal. Figure 1 shows the areas measured. 1 2 Figure 1 - Identification of the sites for measurement of connective tissue (1) and epithelial areas (2) for each histological section. Statistical analysis Statistical evaluation of the histometric analyses was performed by nonparametric tests: the Kruskal-Wallis test (comparison of medians for more than two groups of samples), the Mann-Whitney test (comparison of medians for independent samples) and the multiple comparison test (comparison between groups of two by two). Differences of p<0.05 were considered significant. RESULTS All animals survived the experiment periods. Analyses of the animals weights by the Kruskal-Wallis test showed no significant difference between the experiment groups (administration of diltiazem) and control groups in terms of median body weight gain for 20 days (p=0.287) as well as for 40 days (p=0.331). Macroscopic analyses of the lower molar gingiva of rats in both control and experiment groups, in the buccal as well as the lingual regions, presented similar clinical aspects. The gingiva was firm, rose-colored and surrounded the cervical