FACULDADE SÃO LUCAS PRISCILA FERREIRA DA SILVA

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1 FACULDADE SÃO LUCAS PRISCILA FERREIRA DA SILVA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA DAS TÉCNICAS LABORATORIAIS DE MELHORAMENTO GENÉTICO DE BOVINOS DE CORTE NO BRASIL Porto Velho 2016

2 FACULDADE SÃO LUCAS PRISCILA FERREIRA DA SILVA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA DAS TÉCNICAS LABORATORIAIS DE MELHORAMENTO GENÉTICO DE BOVINOS DE CORTE NO BRASIL Monografia apresentada à banca examinadora da Faculdade São Lucas, com requisito de aprovação para obtenção do Título de bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. Dr. Fernando Rodrigues Marques. Porto Velho 2016

3 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação - CIP S586r Silva, Priscila Ferreira da. Revisão bibliográfica das técnicas laboratoriais de melhoramento genético de bovinos de corte no Brasil / Priscila Ferreira da Silva. Porto Velho, p. Monografia (Bacharelado). -Faculdade São Lucas, Orientação Prof. Fernando Marques Rodrigues, Coordenação de Biomedicina. 1. Biomedicina 2. Genética 3. Bovino Melhoramento Genético I. Título II. Rodrigues, Fernando Marques. CDU: 575 Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Leandra Perdigão CRB11/415

4 PRISCILA FERREIRA DA SILVA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA DAS TÉCNICAS LABORATORIAIS DE MELHORAMENTO GENÉTICO DE BOVINOS DE CORTE NO BRASIL Monografia apresentada à banca examinadora da Faculdade São Lucas, com requisito de aprovação para obtenção do Título de bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. Dr. Fernando Rodrigues Marques. Porto Velho 01 de junho de 2016 Avaliação/Nota: BANCA EXAMINADORA Faculdade São Lucas Faculdade São Lucas Faculdade São Lucas

5 RESUMO Tendo em vista que a pecuária é uma das atividades econômicas mais importantes para o Brasil, sendo um dos maiores pilares da economia do país, foi inevitável investir em pesquisas para a melhor utilização das técnicas do melhoramento genético, a fim de cobrir a demanda de importação e exportação e consequentemente, adequar-se as condições sanitárias internacionais. O objetivo foi realizar uma revisão bibliográfica introdutória às principais técnicas utilizadas comercialmente no melhoramento genético de bovinos de corte no Brasil, sendo estas, a inseminação artificial (IA), núcleos MOET, produção de embriões in vitro (PIV), sexagem de embriões e a clonagem através da transferência nuclear, salientando de forma rápida e objetiva a história de todas as técnicas aqui mencionada, bem como expondo pontos positivos e negativos, e ainda, de acordo com o que foi possível obter, um ligeiro relato da forma como cada técnica é mais realizada, e ainda, expor até onde um biomédico capacitado para tal, poderia atuar dentro um programa de melhoramento genético. Foi possível verificar, através de relatos de vários pesquisadores, que por mais, que o Brasil já tenha avançado muito na produção de bovinos melhorados, ainda a muito que evoluir em relação às técnicas, todas elas apresentam, principalmente na parte de manejo em laboratório, limitações, que necessitam serem vencidas, e que sim, um biomédico apto para tais técnicas, pode atuar no melhoramento genético de bovinos. Palavras-chave: Melhoramento genético. Bovinos. Técnicas. Atuação. Biomedicina.

6 ABSTRACT Considering that livestock is one of the most important economic activities in Brazil, one of the major pillars of the economy, it was inevitable to invest in research for the best use of the techniques of genetic improvement in order to cover import demand and export and consequently suit international sanitary conditions. The goal was to conduct an introductory literature review the main techniques used commercially in the genetic improvement of beef cattle in Brazil, which are, artificial insemination (AI), MOET nucleus, in vitro production of embryos (IVP), sexing of embryos and cloning by nuclear transfer, stressing quickly and objectively the history of all the techniques mentioned here, as well as exposing positives and negatives, and yet, according to what was possible to obtain a slight account of how each technique is more fulfilled, and also expose how far a skilled biomedical to do so, could act in a genetic improvement program. It was possible to verify, through reports of many researchers, that however, that Brazil has already made much progress in the production of improved cattle, still long way to go in relation to technical, all present, especially in the handling in the laboratory limitations that need to be overcome, and yes, one fit for such techniques biomedical, can act in breeding cattle. Keywords: Genetical enhancement. Cattle. Techniques. Acting. Biomedicine.

7 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO EVOLUÇÃO E ASPECTOS ECONÔMICOS DA PECUÁRIA NO BRASIL DESCRIÇÃO DAS TÉCNICAS LABORATORIAIS DE MELHORAMENTO GENÉTICO ANIMAL INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL (IA) OVULAÇÃO MÚLTIPLA E TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES (TE) PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VITRO (PIVE) Maturação (MIV); Fecundação (FIV); Cultivo In Vitro (CIV) dos Embriões SEXAGEM DE EMBRIÕES Sexagem de Embriões por PCR CLONAGEM POR TRANSFERÊNCIA NUCLEAR Obtenção e Maturação dos Oócitos Receptores Seleção e Preparação das Células Doadoras de Núcleo Coordenação do Ciclo Celular da Célula Doadora de Núcleo e do Citoplasma Receptor Reconstrução dos Embriões (Fusão da Célula Doadora de Núcleo/Oócito Receptor) Cultivo do Embrião e Transferência para Fêmea Receptora CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 34

8 LISTA DE ABREVIAÇÕES µs: Microsegundos. µl: Microlitros. BGA: Banco de Germoplasma Animal. PIB: Produto Interno Brasileiro. CIV: Cultivo In Vitro. CO2: Dióxido de Carbono. DMSO: Dimetilsulfóxido. ETG: Etilenoglicol. FIV: Fecundação In Vitro. FSH: Hormônio Folículo Estimulante. GLI: Glicerol. IA: Inseminação Artificial. khz: Quilohertz. Km/h: Quilômetros por Hora. KV/Cm: Quilovolt por Centímetros. LH: Hormônio Luteinizante. MCI: Massa Celular Interna. MII: Metáfase II. MIV: Maturação In Vitro. ml: Mililitros. MOIFOPA: Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Pré-Antrais. N2: Nitrogênio. O2: Oxigênio. ºC: Graus Celsius. ºC/mm: Graus Cesius por minimetros. PIV: Produção In Vitro. PIVE: Produção In Vitro de Embriões.

9 PROH: Propanodiol. RPM: Rotações por Minuto. SFB: Soro Fetal Bovino. TE: Transferência de Embrião. TN: Transferência Nuclear. TNCS: Transferência Nuclear de Células Somáticas. Tps: Teste de Progênie TRA: Técnica de Reprodução Assistida. V: Voltagem. XX: Cromossomo feminino. XY: Cromossomo masculino.

10 9 1 INTRODUÇÃO O setor pecuário, atualmente, representa 6,5% do PIB brasileiro, gera 18% das exportações do agronegócio nacional e já passou por vários ciclos de expansão e retração, mas, em média, sempre cresceu, inovou, não deixando dúvidas que constitui um dos nossos principais pilares econômicos (SINDIRAÇÕES, 2015). O Brasil apresenta uma situação única entre os países do Mercosul, sendo ao mesmo tempo importador e exportador de carne bovina. A composição das importações e exportações é significativamente diferente, sendo que as primeiras se constituem basicamente de carcaças e as segundas de produtos desossados (TRINDADE; BENAVIDES, 2008). O cenário de recessão pela qual passa o Brasil resultou em um aumento da participação do setor agropecuário no Produto Interno Bruto (PIB, soma de todos os bens e serviços produzidos no país). De acordo com balanço feito pela Confederação da Agricultura e Pecuária do Brasil (CNA), a participação do setor no PIB passou de 21,4% registrados em 2014, para uma projeção de 23% em (PEDUZZI, Pedro. 2015). De acordo com Queiroz (2012), a biotecnologia é uma forte ferramenta para a indústria pecuária. As biotécnicas como a inseminação artificial associada aos núcleos MOET, produção in vivo e in vitro, sexagem de embriões e clonagem, têm contribuído de forma grandiosa para essa expansão da pecuária brasileira, sendo estas as técnicas mais aplicadas nos rebanhos, e foi possível tornar o Brasil, em um país referência na produção de embriões in vitro (PIV), uma das mais importantes técnicas de reprodução animal. Com a grande demanda de exportação carne bovina, é de grande importância o incremento da tecnologia nos rebanhos de corte brasileiros, afim de que se obtenha mais eficiência e produtividade na comercialização nacional. Visto que a uma previsão de que futuramente o rebanho mundial poderá não ser capaz de suprir a demanda mundial de carne. NOGUEIRA, Maurício Palma (2015), engenheiro agrônomo e diretor da Bigma Consultoria, relata isso para o Jornal Dia de Campo Quando compilamos os dados de diversos órgãos oficiais em relação às demandas futuras de carne bovina, nos deparamos com uma situação assustadora: É provável que o rebanho mundial não seja suficiente para atender a demanda por carne. Apesar de assustadora, a situação nos coloca numa rota desafiadora para a bovinocultura de corte dos próximos anos. Tanto no Brasil, como na média mundial, o mercado pressionará por um aporte tecnológico num ritmo nunca vivido antes pela pecuária. Ou é assim, ou não teremos como ofertar a carne que o mundo quer. No caso da pecuária brasileira, estima-se até que haja redução da área total, conforme temos visto nos últimos anos. A saída que resta é a aplicação de tecnologia. Na produção pecuária, podemos dividir a aplicação de tecnologia em dois grupos básicos: agronômico, relacionado ao suporte por área e zootécnico, relacionado ao desempenho animal (NOGUEIRA, 2015). É importante explorar as técnicas já utilizadas nos programas de melhoramento genético, sendo assim foi realizada uma revisão, tendo como objetivo

11 10 explorar de forma introdutória as principais técnicas comercialmente aplicadas em programadas de melhoramento genético de bovinos de corte no Brasil, bem como uma ligeira colocação da história da técnica, pontos positivos e negativos, e de acordo com o que foi possível acessar, exemplificar a forma como tais técnicas são usualmente realizadas em laboratórios para a produção em larga escala. Tendo exposto as principais limitações e dificuldades no emprego de cada técnica, pois estes são os focos das pesquisas, que visam, de acordo com Queiroz (2012), melhorar a produtividade e eficiência de cada uma, visto que o uso de tais técnicas é cada vez mais inevitável, pois atingem de forma positiva os rendimentos e a questão da preservação do meio ambiente, pois a criação de gado tem uma considerável parcela no desmatamento de áreas, ou seja, há uma preocupação futura com um maior incremento de biotécnicas na pecuária, havendo a necessidade, de cada vez mais, maiores investimentos para uma melhor tecnologia na produção de carne bovina. Baruselli et al., (2004) concluíram ainda que é de extrema importância avaliar as principais biotécnicas de reprodução que são utilizadas comercialmente no rebanho brasileiro, afim de que se possa melhora-las, para obter um desempenho melhor e mais rápido de cada uma delas, visto que, o Brasil é o maior exportador de carne bovina no mundo.

12 11 2 EVOLUÇÃO E ASPECTOS ECONÔMICOS DA PECUÁRIA NO BRASIL Abiec et al., (2011) afirma que a pecuária possui cada vez mais peso na economia e no desenvolvimento do País com o decorrer dos anos, sendo um dos importantes pilares da economia brasileira, o País possui cerca de 20% da sua área ocupada por pastagens, seria mais ou menos 174 milhões de hectares, com cerca de 200 milhões de cabeças, ocupa o primeiro lugar em maior rebanho comercial, com vendas em mais de 180 países, ocupando o primeiro lugar no ranking mundial de exportações de carne bovina, segundo maior produtor de carne e sexto maior produtor de leite, tendo ainda áreas líderes no combate à aftosa, um grande exemplo desta é Rondônia, o que representa um avanço muito positivo para Brasil, visto que a aftosa é uma das principais barreiras de exportações, além das barreiras tarifárias e ecológicas. O Brasil possui o maior rebanho comercial do mundo com 19% da população bovina, com grande expressão no cenário mundial da pecuária bovina e mercado de carne, ficando somente atrás da Índia, com rebanho total de mais de 336 milhões de cabeças (BEEF POINT, 2008). O Ministério Da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (2015) relata que o clima tropical e a extensão territorial do Brasil contribuem para esse resultado, pois permitem a criação da maioria do gado em pastagens. E ainda, o investimento em tecnologia e capacitação profissional; O desenvolvimento de políticas públicas, que permitem que o animal seja rastreado do seu nascimento até o abate, e o controle da sanidade animal e segurança alimentar, contribuiu para que o País atendesse às exigências dos mercados rigorosos e conquistasse espaço no cenário mundial. Porém nem sempre foi assim, Queiroz (2012) relataram que desde os primórdios, no início da exploração portuguesa no Brasil, a pecuária já estava presente e desenvolvia papéis extrativistas importantes, como marcação de território, estabilidade do capital e reserva de valor, e não passava disso, não tinha visão de crescimento da pecuária a ponto pesar na economia. Ferraz; Eler (2010) afirmam que houve uma interação muito importante no melhoramento genético, na qual resulta nos avanços que ocorrem na pecuária brasileira hoje. Os pesquisadores, que normalmente estão em instituições públicas, necessitam dos dados para poder avaliar e gerar resultados, esses dados devem ser coletados de populações que estão nas propriedades dos criadores, que em maioria são privados, havendo essa coleta de dados e gerando informações, esta passa a ser utilizada pelos criadouros, a fim de selecionar quais animais serão utilizados para o melhoramento, sendo então a interação público e privado essencial para o desenvolvimento do melhoramento genético animal bem sucedido. Segundo Queiroz (2012), com o passar do tempo tornou-se muito mais que isto, passou a ser considerada essencial à mesa do consumidor, hoje a pecuária além de estar em grande parte dos sistemas de produção de carne bovina, possui um peso extremamente importante na economia do país como produto agroexportador. E para hoje o Brasil apresentar-se como destaque na produção e exportação de carne bovina, é graça a implantação de sistemas de produção, bem como a criação de programa de melhoramento genético de bovinos, neste é possível

13 12 obter um estudo científico-tecnológico, devido ao crescimento de pesquisas e especialistas na área de melhoramento genético. Baruselli et al., (2004) relataram que o melhoramento genético, baseado na seleção de indivíduos com maior desenvolvimento ponderal, rendimento de carcaça, produção leiteira, capacidade de conversão alimentar, precocidade, entre outros, possibilita o aumento da produtividade de carne e de leite. Tendo, a eficiente multiplicação de animais superiores por biotécnicas da reprodução proporciona maior retorno econômico à atividade. Mas, a multiplicação e distribuição desse material genético só são possíveis com adequado manejo e sem comprometer a eficiência reprodutiva do rebanho. Desta forma, elevados índices de produção, associados à alta eficiência reprodutiva, devem ser metas que elevem os técnicos e criadores a alcançarem maior produtividade. Silva et al., (2015) afirma ainda que as constantes evoluções das técnicas na qual se utiliza os gametas e os embriões para melhorar o gado, a fim de produzir mais e ao mesmo tempo com qualidade, se deram, devido ao crescente mercado competitivo de exportações de carne bovina, e ainda pelas exigências impostas por compradores consagrados no mercado, como por exemplo, a Europa. O cenário mundial da carne bovina se desenvolveu de forma que aqueles criadores que não acompanharem de forma adequada os níveis de qualidade e alta produtividade serão obrigatoriamente marginalizados. Fredrichsen (2015) propõem que com as exigências impostas pela globalização e o aumento da competitividade, a pecuária necessariamente teria que buscar o da eficiência reprodutiva e produtiva. Diz ainda que, o ganho genético nos últimos 20 anos deveu-se, basicamente, ao aumento na pressão de seleção das raças. Tendo a inseminação artificial (IA), os programas de teste de progênie e, posteriormente, pela transferência de embriões (TE) dado o passo inicial para seleção animal. E que o incremento ainda maior pôde ser obtido com o desenvolvimento da técnica de produção in vitro (PIV) e sua incorporação ao setor produtivo. Queiroz (2012) afirma que qualquer programa de melhoramento genético de bovinos tem como objetivo geral exacerbar características zootécnicas de interesse comercial, essas características são medidas obtidas em cada indivíduo ou no rebanho como um todo, para serem comparadas com o rebanho, seja este rebanho residente, ou seja, o rebanho que aquele indivíduo que está sendo comparado reside, ou ainda um rebanho de uma população maior, a fim de se obter o embasamento para se realizar a seleção e descarte dos indivíduos avaliados, ou seja, a exploração do das diferenças ambientais e genéticas existentes entre os animais de uma população. Quando se fala em diferenças ambientais, refere-se ao período de nascimento, seca ou chuva, sexo, nutrição, manejo e idade das vacas mães, já quanto às diferenças genéticas, é possível selecionar, por métodos de seleção adequados, indivíduos portadores de cargas genéticas de interesse econômico, zootécnico (QUEIROZ, 2012).

14 13 Quanto à seleção, é realizada por métodos como seleção pelo desempenho, seleção pela família, seleção pelo valor fenotípico individual, seleção pelo pedigree e a seleção pela progênie, onde o produtor deve se atentar para características como. Sete Estrelas Embriões (2010) relata que as principais características para seleção de animais a fim de participar de melhoramento genético são ganho de peso no aleitamento, ganho de peso no período pós-desmama, conversão alimentar, precocidade reprodutiva, habilidade materna, adaptabilidade, características de carcaça, ausência de defeitos hereditários, temperamento, longevidade produtiva e tipo de conformação morfológica. É uma seleção realizada com muito cuidado, há uma preocupação em minimizar o máximo a interação com muitos fatores, como nutrição, manejo, clima, isso tudo é muito bem organizado e estudado de forma adequada dentro de um programa. A seleção para características associadas à carcaça, como área de lombo, espessura de gordura subcutânea e marmoreio, pode contribuir com a melhoria da qualidade de carne produzida. As respostas significativas à seleção são esperadas ao utilizá-las em programas de melhoramento, uma vez que as estimativas de herdabilidade são de média a alta magnitude (YOKOO et al., 2009). O sucesso no melhoramento genético de qualquer espécie depende, fundamentalmente, de quatro princípios básicos: Medir com o menor erro possível as características a serem melhoradas; Identificar com precisão os animais melhoradores; Permitir que estes animais deixem maior número de filhos em relação à média da população; Garantir que o fluxo de genes seja sempre no sentido de animais (rebanhos) de maior mérito genético para os de menor (ALVES et al., 1999). 3 DESCRIÇÃO DAS TÉCNICAS LABORATORIAIS DE MELHORAMENTO GENÉTICO ANIMAL De acordo com Filho (2009) de certa forma sempre se utilizou a seleção dos melhores animais, na época em que a criação de gado era uma atividade sem interesse econômico, se utilizava a seleção dos melhores animais, mesmo sem a consciência disto, onde eram escolhidos os animais que tinham as características fenotípicas desejáveis para fazer o cruzamento entre os mesmos, não havia nada cientificamente comprovado sobre os efeitos em longo prazo em relação às características que poderiam ser melhoradas, porém foram notórias mudanças positivas quando comparadas, somente a olho nu, as populações mais antigas das populações jovens. Vieira (2012) explica que a biotecnologia tem um papel muito importante na atualidade, e através dela é possível manipular as características economicamente desejáveis de um organismo por suas estruturas genéticas, sempre em associação com interação do meio ambiente, pois este tem um papel importante quanto à expressão maior ou menor das determinadas características economicamente desejáveis no animal, são notórias que nos tempos antigos de civilização, já utilizavam a seleção de características desejáveis, por mais rustica e ausente de comprovação cientifica que fosse os cruzamentos realizados por seleção natural, tinham o objetivo de melhorar a progênie de determinado gado.

15 14 Segundo Mattar (2012), essa melhoria mencionada anteriormente, hoje pode ser concebida em menor tempo, com segurança e sem uma descontrolada intervenção do meio ambiente na exibição dos fenótipos desejáveis, isso devido à forma como o gado é criado, sempre levando em conta a nutrição, sanidade, manejo, reprodução e a seleção, bem como a ambiência e o bem estar animal, porém jamais podemos deixar de lado a intervenção do meio ambiente, pois mesmo com os sistemas de cria para minimizar a interação do mesmo, ele influência os resultados das técnicas aplicadas no melhoramento genético de bovinos, quanto à expressão e variação fenotípica, seja seleção de animais com genética superior ou mesmo no resultado de inseminação com embrião manipulado em laboratório, por exemplo. Essas variações fenotípicas estão envolvidas duas causas muito importantes, causas genéticas e ambientais, as variações são compostas por associação desses dois fatores e são medidas pela avaliação genética dos bovinos, na avaliação acreditam que acontecem nos grupos onde é feita a comparação, que a variação ambiental e seus efeitos sejam os mesmos nestes grupos, isso são apenas tendências e, que acabam desprezando os efeitos da intervenção ambiental, efeitos estes que podem gerar manifestações funcionais diferentes, bem como alterações no metabolismo animal, afetando diretamente as características fenotípicas desejáveis economicamente (QUEIROZ, 2012). As biotecnologias permitem a utilização melhor de gametas masculinos e femininos, intercâmbio de material genético, controle de transmissão de doenças e, em função do aumento proporcional na natalidade do rebanho, o incremento do ganho genético oferece a diminuição de intervalo de gerações e do aumento da acurácia e da intensidade de seleção (QUEIROZ, 2012). De acordo com o Ministério Da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (2016), todo estabelecimento produtor, comercial ou prestador de serviço que trabalha com material genético bovino deve ser registrado no Ministério da Agricultura, o que é de extrema importância, pois com isso, há uma comprovação da qualidade do material genético de determinado animal, bem como seus produtos de comercialização nacional e internacional. E ainda, os processos de registro dos estabelecimentos e inscrição dos reprodutores, animais doadores de sêmen, permitem a rastreabilidade da produção de sêmen e embriões no País. Somente pode ser comercializado material genético dos reprodutores que passam por exames sanitários, de identificação genética e desempenho zootécnico, o que assegura a identidade e qualidade do produto final. As biotécnicas de reprodução animal como inseminação artificial (IA), superovulação e transferência de embriões (TE), produção in vitro de embriões (PIV), sexagem de embriões, clonagem e, criopreservação de gametas e embriões são ferramentas indiscutivelmente úteis à pecuária moderna, usadas de forma comercial. Auxiliam na identificação, seleção e principalmente na multiplicação mais rápida de animais de alto valor genético. Esse conjunto de técnicas vem contribuindo para a melhoria genética dos rebanhos, consequentemente incrementando os resultados dentro dos sistemas de produção, seja de carne ou leite, segundo MARSON et al., (2003).

16 INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL (IA) Antes de falar sobre essa técnica é importante deixar claro que a inseminação artificial é única e exclusivamente realizada pelo médico veterinário com o apoio de sua equipe, porém o sêmen que irá ser introduzido na fêmea pode ser um sêmen sexado, ou seja, um sêmen no qual já se sabe o sexo do futuro embrião, essa sexagem é realizada em laboratório, onde pode ser realizada por um profissional biomédico. De acordo com Queiroz (2012), a técnica surgiu por motivos sanitários na Europa e nos Estados Unidos da América após a Segunda Guerra Mundial, possibilitando uma prenha muito mais fácil, pois não tinha a necessidade de levar a vaca ao touro desconhecido, evitando o contato de ambos, o que poderia levar a transmissão de doenças. No Brasil surgiu na década de 70 às primeiras empresas especializadas no processamento da amostra e comércio da mesma, então o emprego da inseminação artificial cresceu muito desde seu surgimento, porém devido a fatores como, seu investimento inicial e instalações adequadas e específicas, bem como um manejo diferenciado e profissionais capacidades, sua aplicação não estar presente na maior parte do rebanho brasileiro, mas está presente nos principais e grandes produtores. É uma técnica que intensifica a seleção dos machos, pois são utilizados poucos pais para reprodução, e que por fim gera um maior ganho de genética superior para a prole, fazendo desta técnica a mais importante dentro dos programas de melhoramento genético. A Asbia (2016) afirma que pela inseminação artificial não há possibilidade de transmissão de doenças entre a vaca e o touro, quando utilizado altos níveis de higiene na manipulação dos gametas, pois não há contato entre os animais, sendo ainda o sêmen utilizado, de qualidade comprovada, permite ainda o cruzamento entre raças, utilizando de genética de reprodutores provados para a produção de carne, sem que aja todo o trabalho de criação em pasto destes reprodutores, é também possível obter dados do parto e da fecundação, o que leva a uma boa seleção das melhores fêmeas do rebanho, é possível homogeneizar os lotes de gados, quando utilizado poucos reprodutores em um grande número de fêmeas, devido a grande endogamia. Vieira (2012) relata que a IA, também conhecida como Técnica de Reprodução Assistida (T.R.A.), foi à primeira técnica a ser introdução na produção de bovinos em todo o mundo, é a técnica mais utilizada em qualquer programa de melhoramento genético de bovinos. Basicamente nessa técnica é realizado o seguinte procedimento, após coletar o sêmen do macho, é feito a deposição do mesmo no aparelho genital da fêmea e a fecundação do espermatozoide no ovócito se dá naturalmente. 3.2 OVULAÇÃO MÚLTIPLA E TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES (TE) Desde os anos 70 esta técnica é usada, de forma dispersa, para promover o melhoramento dentro de rebanhos e facilitar os trabalhos de importação e multiplicação de raças e, de forma organizada, nas mães de touro para TPs. (PENNA, 2004).

17 16 De acordo com Peixoto et al., apud Hinks (2004), os núcleos de melhoramento surgiram da necessidade de procedimentos alternativos que suportassem as mudanças nas condições de produção e mercado, promovessem auto-suficiência nos países com pouca infra estrutura para executar programas de melhoramentos eficazes e extensos e assegurassem controle mais direto dos fatores determinantes da mudança genética. Os núcleos vêm sendo utilizados há vários anos para o melhoramento genético de suínos, ovinos e bovinos e, segundo o autor, seu mérito constitui alternativa de melhoramento genético. Entretanto, foi a partir do desenvolvimento da técnica de ovulação múltipla e da transferência de embriões (MOET) que seu potencial pôde ser definido (PENNA, 2004). A ovulação múltipla e transferência de embriões (em inglês, Multiple Ovulation & Embryo Transfer - MOET) aumentam as taxas reprodutivas de bovinos e, consequentemente, menos vacas (as melhores) podem ser usadas para produzir a geração seguinte (PENNA, 2004). Queiroz (2012) diz que o principal benefício dessa ferramenta, é a produção de mais bezerros de uma mesma vaca geneticamente superior, pois em reprodução natural uma vaca produziria cerca de 4 a 5 bezerros, com a aplicação da ovulação múltipla e transferência de embriões, essa produção vai de 25 a 30 bezerros. Outro benefício muito importante é risco de transmissão de doenças pelo embrião, que passa a ser descartado quando os procedimentos recomendados pela Sociedade Internacional de Transferência de Embriões são seguidos corretamente. Trata-se de uma técnica relativamente cara e usada apenas em animais de elite. Os núcleos MOET de melhoramento consistem em rebanhos que utilizam a técnica de ovulação múltipla seguida de transferência de embriões para constituir, rapidamente, amplas famílias de irmãos completos e meio-irmãos a serem avaliadas quanto ao mérito genético. (PEIXOTO et al., 2004). Peixoto et al., (2004) afirmam que no núcleo MOTE são usados dois tipos de fêmeas para a produção, as que são chamadas de doadoras, estas possuem genéticas superiores, e fêmeas que são chamadas de receptoras, as que irão receber o óvulo fecundado da doadora, fecundação esta onde somente é usado espermatozoides de genética superior. É primeiro realizado uma superovulação nas doadoras por tratamento hormonal específico, após a ovulação são inseminadas por sêmen de touros comprovados, e depois de 6 a 7 dias é feita lavagem uterina para recuperar os embriões, estes são transferidos para outras fêmeas, as chamadas receptoras, ou podem ser congelados e ir para o banco de sangue. 3.3 PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VITRO (PIVE) Essa técnica consiste basicamente em coletar os oócitos, ou seja, óvulos imaturos, por aspiração folicular guiada por ultrassom (ovum pick-up, OPU) diretamente dos ovários de fêmeas vivas ou recém-abatidas, em seguida são encaminhados para o laboratório onde tudo passa a ser feito in vitro, desde maturação dos oócitos, fertilizações após a capacitação espermática, até o cultivo dos embriões, depois serão transferidos para a fêmea receptora.

18 17 A PIV tem o objetivo de utilizar melhor os gametas (óvulos e espermatozoides), tendo uma contribuição muito grande quando se refere à quantidade de material genético de alto mérito que possa ser produzido, intensificando a seleção de animais melhores geneticamente. Em uma reprodução natural uma fêmea gera de 4 a 5 bezerros, já com o uso da PIV, ainda mais se estiver associada com o núcleo MOET, que será descrito à frente, uma mesma vaca pode produzir cerca de 100 ou mais bezerros. O Brasil é o líder mundial em relação à produção de embriões in vitro de embriões de raças zebuínas. Em 2007, o país produziu 221 mil embriões bovinos (THIBIER, 2008). Apesar dos avanços obtidos, a PIVE ainda apresenta algumas limitações, como baixa taxa de blastocistos, dificuldade na criopreservação de embriões, custo do embrião mais alto que na produção in vivo, bezerros com maior peso ao nascer, aumento da mortalidade pós-natal e anormalidades congênitas (RUMPF, 2007) Maturação (MIV); Fecundação (FIV); Cultivo In Vitro (CIV) dos Embriões Após a avaliação ginecológica, bem como, a sincronização das doadoras e receptoras, e ainda realizadas as coletas de oócitos por aspiração folicular guiada por ultrassonografia, os oócitos são classificados de acordo com sua qualidade em grau I, II ou III, todos esses procedimentos devem ser realizados por um Médico Veterinário, após isso, entrarão os processos que serão realizados em laboratório, no qual podem ser executadas por um profissional Biomédico habilitado, que seriam os processos de maturação, fertilização e o cultivo até a fase de blastocisto, essas fases duram ao todo torno de nove dias. A maturação do oócito envolve uma serie de transformações, dentre elas modificações nucleares, citoplasmáticas, e moleculares, sendo ligada a uma serie de mudanças estruturais e bioquímicas que tornam o gameta feminino apto para ser fecundado e para consequentemente desenvolvimento (GONCALVES et al., 2008). Com a retirada do oócito do folículo, este já passa a entrar no processo de maturação e requer de 18 a 22 horas, Antoniolli (2005) sugere que o meio de maturação tenha características similares à composição do fluido folicular. De acordo com Gonçalvez et al., (2007) em relação ao meio de maturação, o mais utilizado nos laboratórios de produção in vitro, é geralmente o TCM 199, sendo suplementado com soro fetal bovino (SFB), FSH, LH, piruvato e antibiótico, entretanto existem variações entre os diferentes protocolos de PIV. Cada laboratório usa um protocolo diferente para o seu meio de maturação adotado, conforme a rotina do laboratório, por exemplo, o meio TCM 199 é mais comumente empregado, porém cada laboratório o modifica conforme sua rotina, outro fato a ser lembrado é o uso de hormônios, pois apresenta opiniões contrárias em relação à quantidade de hormônio que é utilizado, bem como a real necessidade do uso dos mesmos. Todavia, de acordo com Gonçalves et al., (2002) a maioria dos resultados demonstram que a adição de gonadotrofinas ao meio de maturação de oócitos aumenta a capacidade de fecundação e melhora o posterior desenvolvimento embrionário.

19 18 O processo de maturação in vitro de oócitos bovinos pode ser feito com TCM 199 ou com meio Ham's F10. Porém, esses meios sem suplementação não suportam altos níveis de maturação oocitária, necessitando de uma suplementação com soro. O uso do soro nos meios de maturação aumenta a concentração protéica e de fatores de crescimento, que previnem o endurecimento da zona pelúcida, aumentando assim a capacidade de fecundação dos oócitos, tendo sido utilizado na proporção de 10% a 20% do volume total do meio, é extremamente importante ficar atento para que o meio de maturação esteja com o ph adequado, assim como a temperatura da estufa, que deve está entre 38,5º a 39,0ºC, a tensão de CO2 e O2, osmolaridade e a composição iônica (GONÇALVEZ et al., 2002). A maturação representa o estádio final da preparação do oócito para a fecundação, portanto as mudanças estruturais e bioquímicas que ocorrem durante esse período são necessárias para que esse processo seja completo. Entretanto, para que isso ocorra, o oócito precisa ter competência meiótica, que é adquirida progressivamente durante a fase final do crescimento oocitário. Essa competência se refere à capacidade do oócito de completar a divisão meiótica, descondensar a cabeça do espermatozóide, formar os pró-núcleos e suportar o desenvolvimento embrionário subsequente (WARSSAMAN & ALBERTINI, 1994). A PIV apresenta menores taxas de blastocisto após a fecundação quando compara a taxa da produção in vivo, sendo esse seu ponto negativo. Rizos et al. (2002) comprovam em vários estudos, que as condições e os meios usados para maturação de oócitos, fecundação e desenvolvimento embrionário têm sido modificados para aumentar a produção in vitro de embriões. Entretanto, as taxas de blastocisto, prenhez e criopreservação obtida de oócitos maturados e fecundados in vitro são menores que as obtidas pelos sistemas de produção in vivo. Após a maturação dos oócitos, os espermatozóides e oócitos maturos são coincubados em um meio específico, por um período de cerca de 18 horas, sendo possível co-incubar por períodos menores sem afetar as taxas de produção de embriões. Precisam ser fecundados para que sejam capazes de se desenvolver até o estádio de blastocisto, são utilizados espermatozoides viáveis e de qualidade comprovada, a separação do gameta masculino viável dos outros componentes do sêmen e de crioprotetores é feita pelo método de Swin Up ou pelo método de Gradiente de Densidade de Percoll (GONÇALVES, 2007). In vivo, os espermatozóide necessitam chegar à ampola do oviduto para fecundar o oócito. Durante esse percurso e, principalmente no ístmo, glicosaminaglicanos induzem a capacitação dos espermatozóides. A capacitação nada mais é que uma desestabilização membrana plasmática, pela remoção de algumas proteínas, sem modificações morfológicas, mas bioquímicas, resultando em uma hiperativação espermática. Esse processo torna possível a ligação do espermatozóide à zona pelúcida, onde ocorre a reação do acrossomo. In vitro, para que esse processo ocorra, os meios usados devem fornecer um ambiente adequado. O meio mais usado para fecundação in vitro é o FERT-TALP, que contém em sua constituição fatores capazes de promover a capacitação espermática como é o caso da heparina (GONÇALVEZ, 2007).

20 19 É extremamente importante que haja um ambiente adequado, para uma boa capacitação espermática e fecundação. Esse ambiente deve permitir o metabolismo dos oócitos e células camulus e manter a função espermática eficiente... contendo heparina para capacitação espermática. (GONÇALVES et al., 2007). Como no processo de fertilização in vitro a maioria dos laboratórios utilizam sêmen congelado, apos o descongelamento a seleção espermática pode ser feita através do sistema swim-up, que consiste na deposição de 100 µl de sêmen no fundo de um tubo contendo 1 ml de meio de fertilização e a transferência para a estufa na temperatura de 39º C. Desta maneira ocorre a migração dos espermatozoides vivos para a porção superior do meio. Em uma segunda etapa o sobrenadante e aspirado, de uma forma que não permita o contato dos componentes do sêmen contidos no fundo do tubo com os espermatozoides viáveis. Essa amostra é transferida para outro tubo, sendo centrifugada com rotação de 700 a 900 rpm por 5 minutos, e realizada a coleta do conteúdo depositado no fundo do tubo e formado o pellet para a formação do volume necessário na fertilização (GONCALVES et al., 2008). A seleção espermática pelo percoll, o sêmen é centrifugado através da passagem por diferentes gradientes para permitir a separação dos espermatozoides vivos dos mortos e demais constituintes do sêmen. A composição do percoll baseiase em partículas de sílica coloidal cobertos por polivinilpirrolidona, preparado em diferentes concentrações para formar um gradiente necessário de separação espermática. (GONÇALVES et al., 2002). No sistema de separação espermática com Percoll o sêmen e centrifugado pela passagem de diferentes gradientes para permitir a separação através da densidade dos espermatozoides ou vivos dos mortos. O Percoll na concentração de 90% e colocado no fundo de um tubo de ensaio na quantidade de 2 ml, em seguida e adicionado lentamente mais 2 ml de Percoll na concentração de 45%, sem permitir a homogeneização das duas soluções. O conteúdo da palheta de sêmen e depositado no mesmo tubo e levado a centrifugação por 30 minutos a 700 rpm. Em seguida o sobrenadante e removido, deixando apenas o pellet contendo os espermatozoides viáveis, que e colocado em um tubo de 10 ml de meio TALP e novamente centrifugado, desta vez em rotação de g por 10 minutos. Apos a segunda centrifugação o sobrenadante e removido e os espermatozoides são suspensos em 500 µl de meio FERT-TALP (GONÇALVES et al., 2002). Após a maturação dos oócitos e separação dos espermatozoides viáveis, é necessário propiciar um ambiente adequado para que ocorra a capacitação e fecundação. Com esse intuito diversos componentes são adicionados ao meio de fecundação, como a heparina e PHE (penicilamina, hipotaurina e epinefrina), pois ajudam na capacitação, incrementam a atividade espermática e aumentam os índices de fecundação. Outro fator que interfere na taxa de fecundação é o tempo de co-cultivo que varia de 18 a 22 horas (GONÇALVES et al., 2002). Em seguida à seleção dos espermatozoides são feitas as analises para determinar a concentração espermática, que e avaliada com o objetivo de aferir a quantidade de espermatozoides vivos presentes em cada palheta e também e feito o teste de motilidade do espermatozoide, devendo sempre ser progressiva (GONCALVES et al., 2008). Segundo HAFEZ et al., (2004), a concentração pode ser

21 20 analisada de três formas: Pelo hemocitômetro, também conhecido como Câmara de NeuBauer, que consiste em uma lamina microscópica com câmaras traçadas com precisão, sendo o numero de espermatozoides por câmara contado manualmente. Ha também o espectofotômetro ou um colorímetro calibrado a um hemocitômetro que apresentam a vantagem de serem precisos e rápidos, porem não são acurados quando o sêmen apresenta-se contaminado ou sujo. A determinação da motilidade envolve estimativas subjetivas da viabilidade dos espermatozóides e da qualidade da motilidade. Observa se uma gota de sêmen entre lamina e lamínula num aumento de 200 a 400X, verificando o percentual de espermatozoides com motilidade progressiva. Para sêmen congelado a motilidade deve ser superior a 30%. A motilidade espermática e extremamente sensível às condições ambientais, de modo que e necessário proteger o sêmen de condições ou agentes prejudiciais a analise (HAFEZ et al., 2004). Para maximizar a capacidade fecundante, e realizado o cálculo baseado na motilidade e na população viva de espermatozoides após a centrifugação em gradiente Percoll, determinando a concentração espermática ideal para cada touro, geralmente utilizando a concentração de 2 X 106 espermatozoides/ml (GONCALVES et al. 2002). Dias et al., (2010) a fecundação é realizada com os resultados obtidos através do calculo baseado na motilidade e na concentração espermática. A quantidade determinada de espermatozoides e colocada em contato com os oócitos presentes em cada gota do meio FIV presente nas placas Petri de 60 mm, que são cobertos com óleo mineral e logo em seguida colocados em estufa de CO2, nas mesmas condições da maturação. Atualmente o processo de fertilização in vitro na espécie bovina e o que apresenta maior sucesso dentre as espécies, sendo que 40% dos oócitos maturados e fecundados se desenvolvem ate blastocisto (BAVISTER, 2002). Após a FIV, é realizado o cultivo embrionário, que é e grande importância para o desenvolvimento do embrião e consequentemente para o sucesso da PIV, as condições do processo empregado aqui devem oferecer condições adequadas para que os processos embrionários ocorram de forma correta e chegue até o estágio de blastocisto, para então serem transferidos para outras fêmeas. O meio mais utilizado para o cultivo é o SOF, este é baseado nos fluidos do oviduto da vaca, ele tenta imitar o ambiente da tuba uterina e do útero como um todo, porém estes apresentam uma grande variação nos diversos estágios embrionários, sendo muito difícil reproduzi-los em laboratório (GONÇALVES et al., 2007). Ainda no meio FIV os embriões devem ser desnaturados, e só então transferidos para o meio SOF em estufa com controle de O2, iram permanecer por um dia, é importante sempre ter cuidado com possíveis contaminantes nesta fase, após um dia é feita a separação dos embriões clivados dos não clivados, os clivados são retirados e transferidos para outro meio contendo CO2 7,5% e também contendo o tapete celular, este é composto pelas células do camulus, neste meio os embriões ficaram os 7 dias necessários para o desenvolvimento, e aqui a estufa deve ser controlada com CO2, após os 7 dias, a placa é retirada da estufa e é realizada a

22 21 contagem das estruturas embrionárias por gota como, observação e classificação dos embriões como mórula, blastocisto inicial, blastocisto, blastocisto expandido, blastocisto em eclosão e blastocisto eclodido (GONÇALVES, 2007). É realizada uma lavagem para essa classificação citada acima, com o H199 e passagem pela tripsina por um minuto, após essa lavagem os embriões são transferidos para as palhetas de 250µl estéreis com o auxílio do micro-classic ou mesmo com uma seringa de insulina. São preenchidas cinco colunas a primeira coluna com holding, a segunda coluna de ar, a terceira coluna de holding contendo e embrião, e quarta coluna de ar e a quinta coluna com holding. A palheta é então lavrada com a devida identificação do embrião (MAINARDES, 2010). As palhetas são colocadas em uma caixa de isopor contendo gel térmico aquecido e papel, para que aja instabilidade da temperatura do embrião ou são colocadas na transportadora de embriões a 36ºC, e são levadas até o local de transferência, sendo o ideal, um prazo de até 7 horas para que ocorra a transferência após a lavagem e o armazenamento dos embriões na palheta (MAINARDES, 2010). 3.4 SEXAGEM DE EMBRIÕES Técnicas destinadas à seleção do sexo de espermatozóides e embriões préimplantados vêm sendo desenvolvidas em várias espécies animais. O sucesso da implantação destas técnicas deve-se a eficiência dos programas de inseminação artificial (IA) e de produção in vitro (PIV) com subseqüente transferência de embriões (TE) (WOLF, 2007). Segundo Johnson (2000), a tecnologia atual de pré-seleção do sexo em animais é baseada na diferença de conteúdo de DNA entre espermatozoides portadores dos cromossomos X e Y. A incorporação desta tecnologia a IA e a fertilização in vitro (FIV) aumentará a eficácia desses programas trazendo benefícios para a indústria de produção animal e anulando as perdas originadas pelo descarte de embriões do sexo indesejado na FIV. O interesse do homem pela seleção do sexo da progênie data de muitos anos, como na antiga população grega que acreditava que amputar o testículo esquerdo faria com que o homem produzisse somente filho homens, pois o fator determinante de sexo masculino era proveniente do testículo direito (SCHENKER, 2002). De acordo com Seidel; Garner (2010), as pesquisas só tomaram o lado cientifico a partir dos anos 70, quando Jost relatou em 1970 relatou que nos mamíferos, a determinação do sexo era definida como uma série de etapas ordenadas que se iniciava com o estabelecimento do sexo genético, quando o oócito foi fecundado por um espermatozoide portador do cromossomo X ou do cromossomo Y originando, respectivamente, um embrião geneticamente do sexo feminino (XX) ou masculino (XY).

23 22 A partir da década de 80, houve uma intensificação dos estudos de seleção do sexo com interesse zootécnico, visto que se aprimoravam as tecnologias de IA e TE, as quais eram utilizadas em programas de melhoramento genético animal. A importância econômica da seleção do sexo na pecuária foi registrada por vários autores ao longo da década de 80. Evidenciavam que a produtividade, em algumas atividades como a bovinocultura de leite e corte, é favorecida quando a progênie é constituída em sua maioria por um dos sexos (RUVUNA et al., 1991). A seleção do sexo de embriões bovinos precedendo a sua implantação representa grande melhoria econômica. Em propriedades especializadas na produção de leite, por exemplo, a obtenção de fêmeas é de suma importância. Por outro lado, para a produção de gado de corte as carcaças do sexo masculino são mais valorizadas, considerando que as fêmeas são reservadas para reprodução são encaminhadas para o abate somente em idade avançada, quando a rigidez das fibras musculares é maior, característica que diminui a qualidade da carne (CURI et al., 2002). Algumas simulações realizadas (por modelos teóricos) demonstraram que, quando a tecnologia da reprodução era utilizada sobre uma base recorrente em uma população fechada, era possível observar um aumento na taxa de melhoramento genético entre as gerações, sendo esta considerada a principal vantagem genética oferecida pelas tecnologias reprodutivas. Todavia, a utilização dessas tecnologias também proporciona algumas desvantagens, já que elas poderiam aumentar a endogamia e diminuir a variabilidade genética. Assim, seria importante considerar em que sistema de produção essa tecnologia seria utilizada além de considerar o sistema de reprodução (inseminação artificial, transferência de embrião) associado (NICHOLAS, 1996). O uso da seleção do sexo em um rebanho aumenta a disponibilidade de novilhas de reposição, afetando o mercado da pecuária de leite. Com a maior oferta, o preço das novilhas de reposição diminui de maneira significativa, aumentando, consequentemente, a rotatividade do rebanho. Já com relação ao mérito genético, com o uso de sêmen com espermatozoides sexados é possível se observar aumento de até 15%, quando se obtém 100% de prenhez. Além disso, a utilização desse tipo de sêmen promove redução no custo dos programas de teste de progênie e transferência de embriões e, possivelmente aumento no valor dos marcadores genéticos (NONATO, 2014) Sexagem de Embriões por PCR A busca por metodologias que padronizem as técnicas de sexagem em embriões bovinos têm sido o foco de muitas pesquisas nos últimos anos (CARVALHAIS et al., 2007). Existem diversos métodos para a obtenção do sexo do embrião, tais como métodos imunológicos, bioquímicos, citogenéticos, hibridizacão in situ fluorescente, dot blot, e PCR, sendo que a última técnica se destaca em relação à rapidez e simplicidade na sua realização. A sexagem de embriões bovinos frescos é outra vantagem a ser levada em consideração (RUFINO et al., 2006). Segundo BONDIOLI (1992), não há dúvidas de que a PCR é, atualmente, o método de sexagem de embriões que confere maior precisão dos resultados.

24 23 De acordo com Silva et al., (2011), o sexo dos embriões é determinado quando um espermatozoide portador do cromossomo X ou Y fertiliza um oócito portador do cromossomo X, formando uma fêmea (XX) ou um macho (XY), como o cromossomo Y está presente apenas nos indivíduos masculinos, a técnica de PCR utiliza-se deste para determinar o sexo, por amplificação de DNA cromossômico masculino, cromossomo Y. A PCR amplifica, exponencialmente, pequenos fragmentos de DNA de regiões específicas do cromossomo Y. A presença ou ausência dessa amplificação indica o sexo do embrião (SHEA, 1999). Esta técnica tem sido muito utilizada (LOPES et al., 2001; HASLER et al., 2002; ALVES et al., 2003) e consiste em uma simulação do processo de replicação de DNA que ocorre nas células in vivo. A enzima DNA polimerase promove a síntese de milhões de cópias de seqüências de DNA presentes somente nas células de embriões masculinos (DESCHAMPS et al., 2000), através do uso de oligonucleotídeos iniciadores (primers) específicos desenhados para amplificar regiões do cromossomo Y (PARK et al., 2001; ALVES et al., 2003). A amplificação do DNA consiste de vários ciclos dom três etapas: desnaturação, anelamento e extensão. O primeiro ciclo ocorre à temperatura entre 90-95ºC, permitindo a abertura da dupla fita de DNA, pela quebra das ligações entre os nucleotídeos. O segundo ciclo ocorre o anelamento dos iniciadores a temperatura entre 50-60ºC, possibilita a amplificação da sequencia de DNA desejada, a extensão do segmento a partir dos iniciadores, corresponde ao terceiro ciclo e ocorre a temperatura de 72ºC pela ação da enzima termorresistente. Os ciclos de temperatura para realização da PCR são repetidos várias vezes e a amplificação do DNA ocorre de forma geométrica. Inicialmente, o controle da temperatura era realizado em três banhos-maria, já que a mudança deve ocorrer rapidamente. Atualmente, utilizam-se termocicladores que contribuem para aperfeiçoar a técnica (REGITANO; COUTINHO, 2001). De acordo com Thedy (2010), a confirmação do sexo é realizada por ultrassonografia por volta de dois meses da gestação, essa técnica oferece um alto grau de acurácia e eficiência, além de permitir o uso de diferentes estágios de desenvolvimento, desde mórula até o blastocisto expandido, isto havendo boa qualidade dos mesmos. Existe muitas divergências que vão desde o estágio adequado do embrião para a realização da sexagem até a utilização de oligonucleotídeos iniciadores que conferem melhores resultados na amplificação dos segmentos de DNA. Muitos desses protocolos utilizam um oligonucleotídeo para o cromossomo Y e outro para uma seqüência autossômica do DNA, comum para ambos os sexos, a fim de se evitar falsos diagnósticos de fêmeas. Esse método é denominado PCR multiplex (CARVALHAIS et al., 2007).