Criopreservação de Embriões

Transcrição

1 Universidade Estadual do Ceará Faculdade de Veterinária Biotecnologia da Reprodução Animal Criopreservação de Embriões Vicente José de F. Freitas Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução

2 Plano de Aula Apresentar os princípios da criopreservação de embriões. Discutir as técnicas de criopreservação. Apresentar os fatores que afetam o sucesso da técnica. Apresentar as considerações finais sobre o tema.

3 Conceito Redução, ou mesmo parada, de todos os fenômenos biológicos: ü movimentos moleculares, ü reações químicas e ü atividades enzimáticas em temperaturas inferiores a -150 C.

4 Histórico Espécie Referência Murina Whittingham et al., 1972 Bovina Wilmut & Rowson, 1973 Ovina Willadsen et al., 1976 Caprina Bilton & Moore, 1977

5 Vantagens Otimização das biotecnologias reprodutivas. Conservação de material genético: Raças de produção. Espécies em extinção. Prevenção de perdas de animais vivos durante o transporte.

6 Vantagens Programa de Conservação da Raça Morada Nova Branca (UECE-UFC) Sincronização/ Superovulação IA por laparoscopia com sêmen de carneiro MNb + 6 dias TE para ovelhas receptoras Ovelha doadora Colheita/congelação dos embriões Nascimento das crias

7 Princípio da criopreservação protocolo empregado na criopreservação de uma célula deve ser suficientemente... lento (evitar a cristalização da água intracelular) e suficientemente rápido (evitar a exposição das células a elevadas concentrações de eletrólitos antes da congelação).

8 Crioprotetores Papel de proteção da célula, pois...: Reduz a formação de cristais de gelo; Diminui o ponto crioscópico da água; Aumenta a estabilidade da membrana celular. Tipos de crioprotetores: a) Permeáveis: propilenoglicol, glicerol, etilenoglicol, dimetilssulfóxido (DMSO). b) Não permeáveis: polivinilpirrolidona, polietilenoglicol, ficoll, dextran e álcool polivinílico

9 Tipos de criopreservação 1. Congelação clássica (lenta): Também conhecida como método de congelação clássica, tradicional ou de equilíbrio. Esta técnica foi padronizada e largamente utilizada no âmbito comercial e industrial. Criação de um delicado balanço entre vários fatores que determinam a formação de cristais de gelo, fraturas, danos tóxicos e osmóticos, permitindo trocas entre os meios extra e intracelular sem que ocorram sérios efeitos osmóticos e deformidades celulares.

10 Tipos de criopreservação 2. Vitrificação: Esta técnica pode ser considerada um método de criopreservação em que a formação de cristais de gelo é totalmente eliminada. A solidificação é atingida pelo aumento extremo da viscosidade e não pela cristalização, chegando diretamente à fase vítrea. Permite a passagem pela zona crítica de temperatura de maneira rápida, o que impede o desenvolvimento de injúrias ocasionadas pela formação dos cristais de gelo. A concentração do crioprotetor traz efeitos tóxicos e hipertônicos, aumentando o risco de injúrias causadas pelo choque osmótico e pela toxicidade celular.

11 Congelação lenta 1. Princípio: Equilíbrio progressivo entre os crioprotetores utilizados e o compartimento aquoso do embrião. 2. Crioprotetores: Glicerol, etilenoglicol, DMSO, propanodiol. 3. Cristalização (seeding): Deve ser induzida pelo operador antes que ocorra de maneira espontânea. Evita a congelação de células em temperaturas excessivamente baixas.

12 Congelação lenta Exemplo de curva de congelação de embriões (caprinos e ovinos)

13 Congelação lenta Equipamentos programáveis para congelação de embriões

14 Vitrificação 1. Características: Estado líquido estado vítreo (amorfo) Crioprotetores com alto grau de viscosidade: Etilenoglicol e DMSO Alta velocidade na criopreservação: Imersão direta no NL.

15 Vitrificação Open Pulled Straw (OPS): Palheta de 0,25 ml esticada (diâmetro interno pequeno )

16 Vitrificação Kit para vitrificação pelo método de OPS

17 Fatores que influenciam no sucesso da técnica 1) Estádio de desenvolvimento embrionário: Embriões mais tardios (blastocistos) apresentam maior taxa de sobrevivência Melhor taxa de sobrevivência

18 Fatores que influenciam no sucesso da técnica 2) Qualidade do embrião: Embriões de melhor qualidade apresentam maior taxa de sobrevivência.

19 Fatores que influenciam no sucesso da técnica 3) Espécie/subespécie animal: Zebuínos apresentam menor taxa de sobrevivência embrionária

20 Considerações Ambas as técnicas (congelação lenta e vitrificação) podem ser utilizadas para criopreservação de embriões. A eficiência das duas técnicas pode variar de acordo com diversos fatores que devem ser levados em consideração. A vitrificação parece apontar, em um futuro próximo, como técnica de escolha.