Produção in vitro de embriões

Transcrição

1 Universidade Estadual do Ceará Faculdade de Veterinária Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias Biotécnicas Aplicadas à Reprodução de Fêmeas Caprinas e Ovinas Produção in vitro de embriões Vicente José de F. Freitas Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução

2 Plano de Aula Princípios da técnica. A obtenção de oócitos. Metodologia das diferentes etapas laboratoriais. Os principais obstáculos da técnica. Considerações

3 Introdução A criação de pequenos ruminantes como aavidade industrial. Correção dos erros de manejo: Alimentar, sanitário e reproduavo Trabalhar com genéaca superior.

4 Introdução Esquema de um programa de melhoramento genético baseado em sistema de PIVE. Colheita de oócitos em cabras geneticamente superiores Transferência de blastocistos para receptoras comuns Maturação dos oócitos e fecundação com sêmen de machos geneticamente superiores Cultivo dos embriões por 6-7 dias

5 Diferentes etapas da PIVE Colheita de oócitos competentes. Seleção e maturação in vitro (MIV) dos oócitos. Fecundação in vitro (FIV) de oócitos maturados. CulAvo in vitro (CIV) dos prováveis embriões. Transferência do embriões para receptoras.

6 Métodos para colheita de oócitos

7 Ovários de abatedouro Slicing Punção folicular

8 Ovários de abatedouro Desvantagens: Problemas sanitários, Histórico reproduavo desconhecido, Problemas nutricionais, Etc, etc, etc...

9 Métodos para colheita de oócitos

10 Animais vivos Permite a colheita de oócitos em fêmeas pré- púberes, senis ou mesmo prenhes. Torna possível repear a colheita várias vezes no mesmo animal, tonando viável o uso do termo doadora permanente. Primeiramente foi desenvolvido para bovinos por pesquisadores alemães há quase 30 anos (Pieterse et al., 1988).

11 Colheita guiada por ultrassonograqia No entanto ê Taxa de colheita (34%) 4 oócitos/doadora

12 Colheita guiada por laparoscopia Pode ser realizada sem ou com esbmulo hormonal anterior. No entanto, somente com uso de tratamento hormonal de esamulação ovariana, o método torna- se interessante para obter- se um número adequado de oócitos. Trata- se de um método desenvolvido há vários anos por Hérnan Baldassarre, na ArgenAna, entre outros.

13 Colheita guiada por laparoscopia Protocolo hormonal de esamulação ovariana ualizado em caprinos criados no Nordeste do Brasil (Avelar et al., 2009).

14 Colheita guiada por laparoscopia Efeito de diferentes tratamentos hormonais de esamulação ovariana sobre o número de folículos visualizados, aspirados e a taxa de colheita oocitária. Tratamento Cabra s Folículos visualizados Folículos puncionados Taxa de colheita (%) 5 FSH 18 16,8 ± 1,5 ª 14,8 ± 1,3 ª 84,1 ª 3 FSH 17 17,1 ± 1,5 ª 15,7 ± 1,3 ª 67,9 b 1 ecg+fsh 17 17,0 ± 1,5 ª 14,9 ± 1,3 ª 72,4 a a,b: P < 0,05 Fonte: Avelar et al., 2009

15 Colheita guiada por laparoscopia Equipamentos

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17 Colheita guiada por laparoscopia

18 Seleção e maturação oocitária Classificação de CCOs caprinos (Avelar et al., 2009) CCO Grau Caracterís4cas I Cumulus compacto com várias camadas e citoplasma levemente granulado II Uma a três camadas de células do cumulus e citoplasma levemente granulado III RevesAmento celular ausente/ incompleto e citoplasma heterogêneo IV CCO de formato anormal, citoplasma heterogêneo, aspecto viscoso

19 Seleção e maturação oocitária Maturação in vitro (MIV): Etapa fundamental da PIVE (em todas espécies). Maturação nuclear e citoplasmáaca. Meio: M199, cisteamina, EGF, gentamicina. Hormônios. 24 horas 38,5oC a 5% de CO2. No LFCR: 85%.

20 FIV dos oócitos maturados Remoção da células do cumulus. Lavagem dos oócitos em meio FIV. SOF + soro de cabra em estro. Preparo do sêmen: Sêmen congelado/descongelado. Gradiente de percoll (45%/90%) 10 min a 900 g. Interação sptz/oócitos: 18 horas.

21 CIV dos prováveis embriões Sistemas ualizados em caprinos: Co- culavo em células da granulosa ou do oviduto. Meios desenvolvidos para necessidade dos embriões. Desenvolvimento in vivo no oviduto. LFCR: SOF + BSA em 38,5 o C por 6-7 dias. Em estufa de três gases: 5% CO 2, 5% O 2 e 90% N 2.

22 CIV dos prováveis embriões

23 CIV dos prováveis embriões EQiciência total da PIVE caprina no LFCR. 1. N o de oócitos colhidos 2. N o de oócitos maturados 3. N o de clivados 4. N o de blastocistos

24 CIV dos prováveis embriões

25 Considerações A PIVE em caprinos no Brasil: Quando será sua aplicação comercial? Procedimentos mais eficientes podem fazer a diferença: Colheita laparoscópica Maturação oocitária Capacitação espermáaca