Expressão Gênica em Oócitos e Embriões

Transcrição

1 Universidade Federal de Pelotas Graduação em Biotecnologias Manipulação de Gametas e Embriões Expressão Gênica em Oócitos e Embriões Prof. Tiago Collares Prof a. Priscila M. M. de Leon Janeiro, 2013

2 Análise de Expressão Gênica Conceito: Análise do mrna e de proteínas em oócitos e embriões

3 Análise de Expressão Gênica Ferramenta importante na evolução de biotecnologias da reprodução assistida permite entender biologia reprodutiva; Principais processos avaliados: apoptose, estresse oxidativo e criotolerância; Apoptose principal fator que afeta o potencial de desenvolvimento embrionário; mrna: Diferença de expressão in vivo e in vitro; Envolvidos no desenvolvimento inicial embrionário; Diferenças entre Sistemas e meios de cultivo;

4 Análise de Expressão Gênica Objetivos: Obtenção de Marcadores Moleculares; Identificação de genes envolvidos na Maturação oocitária; Identificação de genes envolvidos no Desenvolvimento Embrionário; Marcadores de sobrevivência e implantação embrionária; Diferenças na expressão gênica IN VIVO e IN VITRO; Resistência ou suscetibilidade a Criopreservação; Elucidar a Biologia da Reprodução e sistemas regulatórios;

5 Desafios da PIV de Embriões: Classificação de Oócitos; Maturação in vitro; Fertilização in vitro; Interação Espermatozoide x Oócito; Cultivo in vitro embrionário; Criopreservação de Oócitos; Criopreservação de Embriões; Implantação embrionária;

6 Avaliações durante a PIV : 1. Qualidade do oócito: Qtidade e Expansão das céls. do cumulus; Integridade do citoplasma e zona pelúcida; 2. Maturação nuclear: % MII (coloração e visualização); 3. Clivagem e desenvolvimento embrionário: D1 e D7 (visualização); 4. Viabilidade embrionária: Colorações (TUNEL, IP, ROS); 5. Expressão Gênica: Oócitos e Células do Cumulus; Mórula/Blastocisto

7 Análise de Expressão Gênica Oócito: Transcrionalmente ativo durante período de crescimento; Após a retomada da meiose e rompimento da vesícula germinativa oócitos se tornam transcricionalmente pouco ativo (reservas de RNA acumuladas durante a fase de crescimento); Esta inatividade transcricional persiste até após a fertilização; Células do Cumulus: células do cumulus são transcricionalmente ativas; Em bovinos, ovinos, suínos, caninos, felinos e murinos: células do cumulus apresentam uma quantidade significativamente maior de RNA total em relação aos respectivos oócitos; RNA de oócitos possui maior abundância de fragmentos pequenos de RNA ( nucleotídeos);

8 Tremoleda et al., 2006.

9 Análise de Expressão Gênica Oócitos x Céls do Cumulus Cumulus indicador de Viabilidade e Competência do CCO

10 Análise de Expressão Gênica Embrião: o genoma embrionário se torna transcricionalmente ativo em aproximadamente 72 h; estágio de 4-8 células; Avaliações como Mórula/Blastocisto;

11 2 céls.: 10% 8 céls.: transcrição 4 céls.: 4x Blastocisto: transcrição Blastocisto Eclodido: 9x

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13 Aplicações Análise de Expressão Gênica: Qualidade de Oócitos e Embriões: Avaliação morfológica têm sido utilizada como critério para selecionar Oócitos e Embriões de melhor qualidade (Grau 1 a 5); no entanto, a morfologia é insuficiente na avaliação do desenvolvimento embrionário não permitindo distinguir oócitos e embriões competentes, ou seja, que têm a habilidade de levar uma gestação à termo Necessidade de uma seleção mais precisa que reflita a Competência oocitária e embrionária... Estudos de expressão gênica associados à competência elucidando os mecanismos genéticos e bioquímicos envolvidos na sobrevivência; melhores resultados obtidos na reprodução assistida

14 Aplicações Análise de Expressão Gênica: Maturação de Oócitos: Genes que estão envolvidos na capacidade de maturação do oócito; Identificar os fatores que regulam a aquisição da competência durante o processo de maturação; Esse conhecimento é fundamental para indicar as alterações necessárias para que o sistema in vitro possa ser o mais semelhante possível do in vivo, e com isso aumentar a disponibilidade de oócitos de melhor qualidade para serem utilizados

15 Maturação Oocitária: 8000 genes estão sendo expressos em oócitos bovinos; Destes 821 são relacionados a maturação em oócitos bovinos; Genes de origem materna tem sido foco devido seu papel no desenvolvimento embrionário; Alto grau de atividade transcricional durante o crescimento do oócito; portanto, mudanças moleculares podem ser responsáveis pelo aumento na competência dos oócitos; 60-80% dos ovócitos maturados in vivo são competentes; somente 25-40% dos maturados in vitro são competentes.

16 Análise de Expressão Gênica qrt-pcr: PCR em tempo real é uma ferramenta para investigações de expressão gênica em gametas e embriões por permitir o uso de quantidades reduzidas de RNA; Pontos importantes: Quantidade de RNA; Síntese do cdna; Eficiência dos Primers; Genes Normalizadores; Repetibilidade;

17 Análise de Expressão Gênica Extração RNA total: reagente TRIzol (Invitrogen, USA); Kit de RNA; Pool de Oócitos Céls do Cumulus Mórula/Blastocisto

18 Análise de Expressão Gênica Quantificação e padronização do RNA: Espectofotômetro; Padronização do RNA em ng/µl; NanoVue Plus Qubit

19 Análise de Expressão Gênica Sintese do cdna: kit High Capacity cdna Reverse Transcription (Applied Biosystems, USA);

20 Análise de Expressão Gênica Primers específicos: Genes alvo Gene Normalizador Exemplos: H2a, Telomerase, Caspase 3, Bcl-2, BAX, Hsp 70, STAT-1, p 53, calpaína e catepsina; Gene Acession Number Sequence TM Bcl-2 Eq BaxEq XM_ XM_ F 5 GAGACCCCCAGTGCCATCAA 3 R 5 GGGATGTCAGGTCGCTGAAT 3 F 5 TTTGCTTCAGGGTTTCATCC 3 R 5 ATCCTCTGCAGCTCCATGTT 3 Fragment size Efficiency (%) 57ºC 146 pb 99.9% ºC 162 pb 100% 0.94 Coorelation (R 2 ) p53 Eq SurvivinEq GAPDH XM_ XM_ NM_ F 5 AAAGGATGCCCATGCTACAGAGGA 3 63ºC 82 pb R 5 AGTAGACTGGCCCTTCTTGGTCTT % 0.98 F 5 TTCATCCACTGTCCCACTGA 3 R 5 GTTCCTCTATGGGGTCGTCA 3 57ºC 98 pb 70.5% 0.98 F 5 GCC GTA ACT TCT GTG CTG TG 3 R 5 AAT GAA GGG GTC ATT GAT GG 3 61ºC 150 pb 84.0% 0.98

21 Análise de Expressão Gênica Eficiência dos Primers: Padronização do primers; Capacidade de diferenciar a expressão do gene alvo; Diluição seriada do cdna; Aceitável de 70% a 110% de eficiência;

22 Análise de Expressão Gênica Expressão Gênica: Genes alvo; Gene Normalizador; Amostras em Triplicata/Duplicata; Curva de Amplificação Curva de Dissociação

23 Análise de Expressão Gênica Análise da Expressão Gênica:

24 Análise de Expressão Gênica Análise da Expressão Gênica:

25 Apoptose: H2a; Telomerase; Caspase 3; Bcl-2; BAX; Hsp 70; STAT-1; p53; Calpaína; Catepsina.

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27 Gene expression in equine cumulus oocyte complex Introdução: Novos conhecimentos na MIV de oócitos são primordiais na produção in vitro de embriões equinos; A baixa eficiência limita a aplicação de biotécnicas reprodutivas (ICSI e FIV) em equinos (Hinrichs et al., 2007;Squires et al., 2003); Qualidade dos oócitos e condições de cultivo são variáveis; o baixo desenvolvimento de blastocistos entre os laboratórios (Smits et al., 2009); Apoptose é um dos fatores que afetam o desenvolvimento embrionário (Anguita et al., 2009;Dhali et al., 2007); Apoptose em céls do cumulus reflete o potencial de desenvolvimento embrionário durante a FIV de humanos (Corn et al., 2005);

28 Gene expression in equine cumulus oocyte complex Objetivo: Avaliar a expressão de genes relacionados com a apoptose (Bax, Bcl-2, survivin e p53) durante a maturação in vitro de oócitos equinos e comparar a expressão gênica entre oócitos e células do cumulus com diferentes características morfológicas.

29 Gene expression in equine cumulus oocyte complex Materiais e Métodos: Coleta e classificação dos COC Maturação in vitro Grupos experimentais: Morfologia: Imaturo: Maturo: COC G1 1- iooc G1 2- mooc G1 1 - icum G1 2- mcum G1 COC G2 3- iooc G2 4- mooc G2 3- icum G2 4- mcum G2

30 G1 - considered morphologically healthy (oocytes with compact cumulus and more than three cell layers, intact cytoplasm, evenly granular and homogenous coloration) G2 - considered morphologically less viable or with some degree of atresia (oocytes that presented less than three layers of cumulus cells and/or expanded cumulus, with cumulus granular appearance, heterogeneous or dense and/or shrunken cytoplasm). Fig. 1. A) Oocytes classified as healthy morphological group, G1; B) Oocyte classified as morphological group with some signs of degeneration, G2.

31 Gene expression in equine cumulus oocyte complex Materiais e Métodos: Cada grupo experimental: pools de 60 oócitos e céls do cumulus correspondentes (4 X) Extração RNA confecção cdna qrt-pcr qrt-pcr Gene Acession Number Sequence TM Bcl-2 Eq BaxEq p53 Eq SurvivinEq GAPDH XM_ XM_ XM_ XM_ NM_ F 5 GAGACCCCCAGTGCCATCAA 3 R 5 GGGATGTCAGGTCGCTGAAT 3 F 5 TTTGCTTCAGGGTTTCATCC 3 R 5 ATCCTCTGCAGCTCCATGTT 3 F 5 AAAGGATGCCCATGCTACAGAGGA 3 R 5 AGTAGACTGGCCCTTCTTGGTCTT 3 F 5 TTCATCCACTGTCCCACTGA 3 R 5 GTTCCTCTATGGGGTCGTCA 3 F 5 GCC GTA ACT TCT GTG CTG TG 3 R 5 AAT GAA GGG GTC ATT GAT GG 3 Fragment size Efficiency (%) 57ºC 146 pb 99.9% ºC 162 pb 100% ºC 82 pb 90.5% ºC 98 pb 70.5% ºC 150 pb 84.0% 0.98 Coorelation (R 2 )

32 Gene expression in equine cumulus oocyte complex Resultados: 1160 COC/528 ovaries IVM: 51% Expressão de Gênica: OocG1 = OocG2 iooc = mooc Bax: icumg1 que icumg2 (p = 0.02) Bcl-2

33 Gene expression in equine cumulus oocyte complex Resultados: Expressão de Gênica: Survivin: moocg1 que mcumg1 (p <0,02) P53: moocg1 que mcumg1 (p = 0.007)

34 Gene expression in equine cumulus oocyte complex

35 Gene expression in equine cumulus oocyte complex

36 Gene expression in equine cumulus oocyte complex Conclusões: Primeiro relato de expressão gênica relacionada a apoptose em complexo cumulus oócito equino; Este estudo contribui para a identificação da regulação gênica durante a maturação e aumenta o conhecimento sobre a biologia do oócito e eventos moleculares envolvidos na comunicação do complexos cumulus oócito; p53 e survivin: possíveis marcadores de viabilidade e competência;

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38 Melka, M.G. et al, 2010

39 Melka, M.G. et al, 2010

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