Rede de Pesquisa do Ovário Artificial

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1 Rede de Pesquisa do Ovário Artificial Coordenador Instituição Executora Vigência Número de pesquisadores envolvidos Projetos associados a Rede/Coordenadores Importância da tecnologia do ovário artificial Principais avanços obtidos Contatos

2 Rede de Pesquisa do Ovário Artificial Coordenador: Dr. José Ricardo de Figueiredo ( Instituição Executora: Universidade Estadual do Ceará (UECE) Vigência: 01/07/2015 a 30/06/2018 Número de pesquisadores envolvidos n=93

3 Projetos associados à Rede/Coordenadores Projeto de Pesquisa Associado 1 Coordenador: José Ricardo de Figueiredo ( Instituição executora do projeto de pesquisa Associado /UF: Universidade Estadual do Ceará-CE. Título do projeto de pesquisa: Desenvolvimento de um sistema de cultivo empregando meios dinâmicos, cocultivo e componentes da matriz extracelular para otimizar as taxas de maturação oocitária e produção in vitro de embriões a partir de oócitos oriundos de folículos pré-antrais caprinos. Projeto de Pesquisa Associado 2 Coordenadora: Dra. Maria Helena Tavares de Matos ( Instituição executora do projeto de pesquisa Associado /UF: Universidade Federal do Vale do São Francisco-UNIVASF - PE Título do projeto de pesquisa: Influência dos extratos de Amburana cearensis e Neoglaziovia variegata e Água de Coco em Pó (ACP) sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos. Projeto de Pesquisa Associado 3 Coordenadora: Dra. Maria Acelina Martins de Carvalho ( Instituição executora do projeto de pesquisa Associado /UF: Universidade Federal do Piauí - PI Título do projeto de pesquisa: Avaliação do potencial de células-tronco no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos e na regeneração in vivo de tecido ovariano lesionado. Projeto de Pesquisa Associado 4 Coordenador: Dr. Marcelo Bertolini ( Instituição executora do projeto de pesquisa Associado /UF: Universidade de Fortaleza (UNIFOR) Fundação Edson Queiroz - CE Título do projeto de pesquisa: Avaliação do efeito da modulação epigenética do núcleo doador e da utilização de oócitos oriundos de folículos pré-antrais crescidos in

4 vitro sobre o desenvolvimento de embriões caprinos produzidos pela clonagem por transferência nuclear. Projeto de Pesquisa Associado 5 Coordenador: Dr. Alexandre Rodrigues Silva ( Instituição executora do projeto de pesquisa Associado /UF: Universidade Federal Rural do Semi-Árido-UFERSA - RN Título do projeto de pesquisa: Adaptação do modelo do ovário artificial para a formação de banco de germoplasma de animais silvestres do bioma Caatinga. Projeto de Pesquisa Associado 6 Coordenador: Dr. José Roberto Viana Silva ( Instituição executora do projeto de pesquisa Associado /UF: Universidade Federal do Ceará UFC - CE Título do projeto de pesquisa: Utilização do cultivo in vitro de folículos pré-antrais e oócitos para avaliar o efeito citotóxico da frutalina (lectina da fruta-pão, Artocarpus incisa) e da oncocalyxona A (quinona do Paubranco-do-sertão, Auxemma oncocalyx).

5 Importância da tecnologia do ovário artificial O ovário mamífero contém milhares a milhões de oócitos que são armazenados individualmente em estruturas denominadas de folículos ovarianos. Do ponto de vista evolutivo, os folículos ovarianos podem ser classificados em dois grupos, a saber: folículos pré-antrais ou não cavitários e antrais ou cavitários. É importante salientar que cerca de 90% dos oócitos presentes nos ovários são armazenados nos folículos préantrais. Entretanto, in vivo, apesar da existência de milhares de oócitos, cerca de 99,9% será eliminada por meio de um processo fisiológico conhecido por atresia folicular. Tendo em vista a grande perda folicular que ocorrerá naturalmente nos ovários, a biotécnica de MOIFOPA visa criar artificialmente in vitro as condições necessárias para que pequenos oócitos inclusos em folículos pré-antrais recuperados dos ovários possam sobreviver, crescer, maturar e posteriormente serem fecundados in vitro, reduzindo-se o processo de atresia que ocorre largamente nos ovários.. Esta técnica tem como objetivo mimetizar in vitro o que acontece com alguns folículos pré-ovulatórios in vivo, que escapam de atresia e ovulam. Assim, a MOIFOPA também pode ser denominada de "ovário artificial". A biotécnica de MOIFOPA (ovário artificial) tem importantes aplicações nas seguintes áreas, a saber: Pesquisa fundamental ou básica: Possibilita o estudo in vitro do efeito de diferentes substâncias sobre os folículos pré-antrais, visando elucidar os mecanismos envolvidos na regulação da foliculogênese inicial, atualmente pouco compreendida. Indústria farmacêutica: Permite a realização de testes in vitro da ação de fármacos (benéfica ou tóxica) sobre os folículos preliminarmente ao seu emprego em experimentos envolvendo animais e seres humanos; Formação de bancos genéticos (germoplasma): Por meio da criopreservação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais oriundos de animais de interesse zootécnico ou em vias de extinção; Reprodução humana assistida (tratamento de infertilidade): Representa uma alternativa futura para a produção de embriões humanos in vitro. Atualmente estes embriões são produzidos utilizando-se procedimentos de superovulação e colheita dos oócitos por punção, gerando muito desconforto nas pacientes. Uma

6 outra aplicação seria a preservação da fertilidade feminina nos casos de mulheres que se submeterão a tratamentos de radio ou quimioterapias (casos de câncer) e que necessitam ter seus ovários previamente removidos e congelados para posterior autotransplante ou cultivo in vitro; Multiplicação de animais: No futuro possibilitará a produção in vitro de embriões em larga escala a partir de oócitos inclusos em folículos pré-antrais, recuperados de ovários inteiros ou de fragmentos ovarianos (biopsia), que seriam submetidos aos procedimentos de crescimento, maturação e fecundação in vitro; Bem-estar animal: Por se tratar de um modelo exclusivamente in vitro para a produção de embriões a MOIFOPA contribuirá para o bem-estar animal (redução do estresse), pois representará uma alternativa aos procedimentos de superovulação, colheita de embriões, punção de oócitos por ultra-sonografia bem como ao uso de animais em experimentos.

7 Objetivos da Rede Desenvolvimento de novos e eficientes sistemas e meios de cultivo dinâmico para o cultivo in vitro de oócitos inclusos em FOPA caprinos frescos ou criopreservados; Elaboração de meios de maturação in vitro de óocitos oriundos de FOPA caprinos; Aumento das taxas de maturação oocitária e produção in vitro de embriões utilizando a tecnologia do ovário artificial; Obtenção de uma gestação após transferência de embriões oriundos de FOPA caprinos crescidos in vitro; Desenvolvimento de novos meios de cultivo utilizando água de coco em pó bem como agentes oxidantes oriundos de plantas do semi-árido; Estabelecimento de protocolos eficientes para a criopreservação de tecido ovariano de animais silvestres (cateto e cutia) pertencentes ao bioma da caatinga bem como estabelecimento de um sistema de cultivo para folículos criopreservados; Implantação de um banco de germoplasma animal para caprinos e animais silvestre oriundos do bioma da caatinga; Avaliação do efeito do co-cultivo de FOPA caprinos com células tronco sobre a sobrevivência e desenvolvimento folicular in vitro; Desenvolvimento de um protocolo que associe a tecnologia do ovário artificial e células tronco visando a regeneração de tecido ovariano lesionado por aspirações múltiplas; Integração da tecnologia do ovário artificial à clonagem, favorecendo o desenvolvimento desta última (fornecimento de população homogênea de oócitos); Estabelecimento de estratégias de manipulação epigenética do genoma para aumentar a eficiência da clonagem animal por TNCS;Utilização do Ovário artificial em testes in vitro de toxicidade de substâncias de interesse farmacêutico; Fortalecimento de programas de pós-graduação emergentes pertencentes à UFERSA, UNIVASF, UNILAB e UFC-Sobral);

8 Fortalecimento de uma rede de pesquisadores do Nordeste ligados à reprodução animal por meio da manutenção e otimização da utilização da capacidade instalada dos laboratórios envolvidos; Aumento da interação de pesquisadores desta rede com seus pares estrangeiros;produção de artigos científicos completos a serem submetidos para publicação em periódicos internacionais; Fortalecimento da Unidade de Pesquisa e Transferência Biotecnológica e inovação (UPTBI-FAVET-UECE) incrementando a interação das empresas privadas pertencentes a esta unidade com os pesquisadores pertencentes à rede temática bem como transferindo tecnologias desenvolvidas para as empresas envolvidas; Formação de recursos humanos qualificados em todos os níveis (graduação e pós-graduação); Realização sistemática de treinamentos nas diferentes técnicas praticadas nos laboratórios pertencentes à rede.

9 Principais avanços obtidos Apesar das enormes dificuldades para obtenção de ovários caprinos para a realização de experimentos em função da grave seca, a rede de pesquisa do ovário artificial tem alcançado resultados bastante animadores. Um destes resultados foi o aumento nas taxas de maturação de oócitos oriundos de folículos pré-antrais de 10% para 30% em função do desenvolvimento de meios de cultivo específicos e empregos de sistema tridimensionais usando tipos e concentrações adequadas de matrizes extracelulares obtidas por bioengenharia. Ressalta-se que a equipe do LAMOFOPA, sede da presente rede de pesquisa, continua sendo a primeira e única no mundo a produzir embriões a partir de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro (ovário artificial). Outro ponto relevante é o interesse de empresas privadas, como a biotechcell, empresa incubada na Unidade Pesquisa de Transferência Tecnológica e Inovação- UPTBI UECE, para a realização de testes de toxicidade reprodutiva utilizando o processo tecnológico do ovário artificial. Além disso, recentemente (Agosto/2016) foi assinado um convênio entre a multinacional BioMérieux e a UECE, para utilização do processo tecnológico do ovário artificial caprino para testar a eficiência de Kits comerciais para dosagem hormonal em meios de cultivo. Tendo em vista a grande dependência nacional por insumos externos, como por exemplo, meios de cultivo, importantes resultados foram obtidos com a utilização do extrato da planta nativa amburana cearensis que apresentou eficiência equivalente ao MEM (meio importado) no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos, abrindo novas perspectivas para elaboração de meios de cultivo com matéria prima nacional. No que diz respeito à constituição de bancos de germoplasma (oócitos) foram adaptadas com sucesso técnicas relativas criopreservação de folículos pré-antrais caprinos para a conservação de germoplasma de fêmeas silvestres do bioma Caatinga. A princípio, o experimento vem sendo executado tomando como modelos as cutias e os catetos. Porém, foi possível também expandir esta tecnologia para o aproveitamento de material genético de outras espécies como tatus-peba e preás, assim comprovando seu potencial para a formação de bancos de recursos genéticos a partir da fauna nacional. Um avanço interessante de um dos projetos associados foi o desenvolvimento de um protocolo para atenuação transiente da DNMT1 (DNA metiltransferase de manutenção) em células somáticas (bovino e caprino) em cultivo, modulando o perfil epigenético do genoma de forma

10 variável, mas controlada no tempo. A utilização de células somáticas moduladas epigeneticamente na clonagem por transferência nuclear será importante para avaliar mecanismos associados a falhas na desmetilação do DNA no núcleo somático desde a reconstrução embrionária até o estádio de blastocisto, empregando inclusive oócitos oriundos de folículos pré-antrais crescidos in vitro como doadores de citoplasma. Na presente rede foram gerados avanços na área de bioprocesso com a validação de protocolos para a obtenção e caracterização de células tronco mesenquimais de diferentes linhagens, de interesse para indústrias, laboratórios de reprodução animal e de células-tronco. Finalmente, foi utilizado com sucesso o processo tecnológico do ovário artificial para avaliar possíveis efeitos tóxicos sobre a foliculogênese inicial de compostos com potencial anticancerígeno. Os resultados mostraram que a Oncocalyxona-A e a frutalina exercem baixos níveis de toxicidade em oócitos inclusos em folículos ovarianos caprinos. Considerando que estas substâncias tem ação antitumoral, estes dados podem trazer avanços significativos para o desenvolvimento de novos quimioterápicos com reduzidos efeitos adversos para a fertilidade feminina. Concluindo, a importância científica dos resultados desta Rede pode ser comprovada pelo aceite dos artigos em periódicos internacionais.

11 Contatos: Laboratório de Manipulação de Oócitos de Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA) Universidade Estadual do Ceará (UECE)-Faculdade de Veterinária (FAVET) Avenida Silas Munguba,1700 Bairro: Itaperi Cep: Fortaleza-CE-Brasil Tel: (85)