Efeito de dois diferentes protocolos para congelação lenta de embriões bovinos produzidos in vitro na região da Amazônia Legal

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1 Efeito de dois diferentes protocolos para congelação lenta de embriões bovinos produzidos in vitro na região da Amazônia Legal Karina Almeida Maciel 1 ; Márcio Gianordoli Teixeira Gomes 2 ; Francisca Elda Ferreira Dias 3 1 Aluno do Curso de Zootecnia, Campus Araguaína. karina-am312@hotmail.com PIBIC/CNPq 2 Orientador, Bolsista do Programa Nacional de Pós Doutorado / CAPES, Ciência Animal Tropical, Campus Araguaína; mgianordoli@hotmail.com 3 Co-orientadora, Profa. da Universidade Federal do Tocantins - EMVZ, Campus Araguaína. eldadias@mail.uft.edu.br RESUMO Este trabalho teve por objetivo avaliar a viabilidade pós-descongelamento de embriões bovinos produzidos in vitro e congelados de forma lenta utilizando dois diferentes crioprotetores permeáveis, etilenoglicol (G1) e glicerol (G2). Os oócitos foram obtidos de folículos de ovários coletados em matadouro, sendo maturados, fecundados e cultivados in vitro. Após sete dias de cultivo, os blastocistos, blastocistos expandidos e iniciais que apresentaram boas características morfológicas segundo o manual da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões - IETS (1998) foram envasados em palhetas de 0,25mL e congelados de forma lenta em máquina para congelamento de embriões seguindo metodologia específica para o protocolo de cada meio de congelamento utilizado. Após o descongelamento foram observadas as taxas de reidratação e eclosão até 72 h. Os embriões bovinos produzidos in vitro e congelados de forma lenta em meio contendo etilenoglicol apresentaram maior taxa de reidratação e eclosão comparados aos embriões congelados em meio contendo glicerol. Palavras-chave: criopreservação; FIV; MIV, PIV. INTRODUÇÃO Na última década a PIV em bovinos tornou-se importante ferramenta comercial para o melhoramento genético do rebanho mundial e brasileiro, sendo amplamente utilizada para esse fim (RODRIGUES et al., 1999; VITROGEN, 2004). O congelamento de embriões é o processo pelo qual deseja-se levar o metabolismo celular ao estado de quiescência, para que este possa ser restabelecido após um período de estocagem por tempo indeterminado, continuando seu desenvolvimento normal. (GORDON, 1994).

2 Rodrigues (2011) afirma que todos os protocolos para congelamento de oócitos e embriões celular têm por natureza a preocupação pela não formação de cristais de gelo durante a congelação e reaquecimento. Se os embriões forem congelados sem a presença de crioprotetores, permeáveis ou de membranas, a formação de cristais de gelo intracelulares e/ou compressões por formação destes cristais extracelulares iriam provocar lesões irreversíveis ao embrião. Em contra partida, a água presente no interior das células é substituída por crioprotetores e os embriões são desidratados à medida que a temperatura vai baixando. Por estas razões a utilização dos mesmos é imprescindível para que sejam alcançados bons resultados, tornando-se um dos pontos chaves para o sucesso da PIV e TE. MATERIAL E MÉTODOS O projeto foi conduzido no Laboratório Brio Genética e Biotecnologia Ltda., localizado no município de Araguaína-TO. Os ovários coletados em abatedouro localizado no mesmo município eram de vacas predominantemente zebuínas e foram transportados em uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) adicionado de antibióticos (penicilina e estreptomicina) e mantidos a temperatura de 35º C até o inicio da aspiração folicular. Logo após a aspiração, os oócitos foram submetidos ao processo de maturação, seguido pela fertilização, segundo (GORDON, 1994). No 7 dia após fertilização (D7) os embriões classificados como blastocistos, blastocistos expandidos e iniciais, e que apresentaram boas características morfológicas segundo metodologia de avaliação da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões IETS (1998) foram criopreservados. Os 193 embriões selecionados foram divididos aleatoriamente em dois grupos com diferentes crioprotetores, ambos congelados pelo processo lento através da máquina para congelação de embriões e sêmen TK, modelo PK1000, respeitando o limite de sete embriões envasados por palheta e armazenados em botijão contendo nitrogênio líquido. No etilenoglicol (G1) foram utilizados 56 blastocistos, expostos diretamente em meio contendo etilenoglicol 1,5 M com 0,4 % BSA e 0,1M Sacarose, enquanto no glicerol (G2) foram utilizados 137 blastocistos, os quais foram expostos a três diferentes concentrações: concentração 1 com 0,4% Albumina sérica bovina (BSA) em Embriolife Base; concentração 2 com 5% Glicerol, 0,1M Sacarose em Embriolife Base e concentração 3

3 com 10% Glicerol, 0,1M Sacarose em Embriolife Base, em três diferentes etapas, cada qual de 5 minutos de exposição ao glicerol. O descongelamento dos embriões foi feito em duas passagens: cinco segundos no ar e 15 segundos em banho-maria entre C. Após este período, os embriões do G1 receberam dois banhos de cinco minutos, em duas distintas gotas contendo meio de cultivo para embriões in vitro. Já os embriões do G2 receberam três banhos de cinco minutos, em três distintas gotas contendo meio para descongelamento específico para o meio utilizado no congelamento, recomendado pela empresa fabricante. Após os banhos para retirada do crioprotetor, todos os embriões voltaram à estufa. As avaliações foram feitas utilizando como parâmetros as taxas de reidratação após o reaquecimento e as taxas de eclosão após a re-introdução nas incubadoras. As observações foram feitas 24, 48 e 72 horas após o descongelamento dos embriões. RESULTADOS E DISCUSSÃO No total foram coletados 218 ovários, obtendo-se 828 oócitos, que proporcionaram a produção e congelamento de 359 embriões, dos quais 193 foram descongelados e 166 descartados. No parâmetro reidratação, para o etilenoglicol, o melhor resultado foi com 72 horas após o descongelamento (35,7%), mas, para o glicerol, a melhor taxa de reidratação foi obtida com 24 horas após o descongelamento (19%). Quanto às médias encontradas, nas primeiras 24 horas pós-descongelamento não houve diferença significativa, mas, com 48 e 72 horas após, o etilenoglicol se mostrou melhor quando comparado com o glicerol (Tabela 1). Tabela 1. Número de embriões reidratados e não reidratados e suas respectivas taxas. 24 h 48 h 72 h Etileno Glicerol Etileno Glicerol Etileno Glicerol Embriões reidratados Embriões reidratados (%) 25, ,14-35,7 3,6 Média de embriões reidratados 1,88a 1,3a 2b 0a 2,22b 0,25a Embriões não reidratados Embriões não reidratados (%) 69,6 81,2 67, ,2 96,3 *Médias com letras minúsculas diferentes na mesma linha diferem significativamente pelo teste SNK (P 0,05)

4 Dalcin (2010) afirma que o acúmulo excessivo de lipídeos nos embriões bovinos de PIV pode reduzir a taxa de sobrevivência embrionária após o reaquecimento. Sendo assim, o acúmulo de lipídeos pode ter sido um dos fatores a diminuir a reidratação dos embriões congelados. Nicacio (2004), afirma que embriões produzidos in vivo e in vitro diferem em alguns aspectos quanto à morfologia, a velocidade de desenvolvimento, o metabolismo e a expressão gênica e que devido a estas diferenças, os embriões produzidos in vitro são mais sensíveis à congelação. O etilenoglicol e o glicerol são considerados crioprotetores permeáveis menos tóxicos quando comparados a outros da mesma classe, no entanto o nível de toxicidade pode variar (Rodrigues, 2011). Serapião e colaboradores em 2005 encontraram taxas de eclosão em embriões PIV criopreservados com etilenoglicol 1,8 M de (38,6%), o que mostra a viabilidade do uso de valores superiores a 1,2 M, o recomendado para os processos em congelação lenta. Sugere-se então maior toxicidade do glicerol quando comparado ao etilenoglicol. A partir das observações feitas 24, 48 e 72 horas, avaliando as estruturas embrionárias após o descongelamento, foram obtidos 21 blastocistos eclodidos, sete blastocistos em eclosão, 22 blastocistos expandidos, cinco blastocistos, dois blastocistos regredidos e 136 embriões degenerados, impossibilitando a identificação de seu estágio de desenvolvimento (Tabela 2). Tabela 2. Estágios embrionários obtidos após o descongelamento. Inicial em Eclosão Eclodido Expandido 24 horas 48 horas 72 horas Etileno Glicerol Etileno Glicerol Etileno Glicerol total % total % total % total % total %

5 Para blastocistos eclodidos, sugere-se uma melhor taxa com 72 horas após o descongelamento para o grupo etilenoglicol. Já para o tratamento com glicerol nenhum blastocisto eclodiu, evidenciando novamente a possibilidade de maior toxidez. Alvarez (2008) afirma que o apesar das taxas de prenhez serem semelhantes entre os embriões congelados com glicerol e etilenoglicol, atualmente o etilenoglicol em substituição ao glicerol, tornou possível a transferência do embrião diretamente no útero da receptora, sem necessidade de retirar o embrião da palheta em que foi congelado. Conclui-se, portanto que os embriões bovinos produzidos in vitro e congelados de forma lenta em meio contendo etilenoglicol apresentaram maior taxa de reidratação comparados aos embriões congelados em meio contendo glicerol. LITERATURA CITADA ALVAREZ, R. H. Fatores determinantes do sucesso de um programa de transferência de embriões bovinos Disponível em: Acesso em: Agosto DALCIN, L. Avaliação do citoesqueleto, padrão de atividade mitocondrial e ultraestrutura de embriões ovinos produzidos in vivo congelados ou vitrificados em etilenoglicol, p. Dissertação (mestrado)- Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária. Universidade de Brasília. GORDON, I.A. Laboratory production of cattle embryos. CAB international, p NICACIO, A. C. Avaliação do desenvolvimento após a criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro, p. Tese (doutorado)- Faculdade de Medicina veterinária e Zootecnia da USP. Universidade de São Paulo. RODRIGUES, P.B.R. Estudo de alguns aspectos da criopreservação de embriões bovinos da raça Frísia Holstein na rotina de uma unidade de transferência de embriões, p. Dissertação (mestrado)- Faculdade de Medicina Veterinária. Faculdade técnica de Lisboa. SERAPIÃO, R.V.; SÁ, W.F.; FERREIRA, A.D. et al. Criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro. Revista Brasileira de Ciência Veterinária, v.12, n.1/3, p.58-61, AGRADECIMENTOS Ao Brio genética e biotecnologia e toda sua equipe, por terem fornecido toda a estrutura necessária para o desenvolvimento das atividades, ao CNPq pelo financiamento do projeto e CAPES pela concessão da bolsa de pós doutorado.