Produção in vitro de embriões

Transcrição

1 Universidade Estadual do Ceará Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias Biotécnicas Aplicadas à Reprodução de Fêmeas Caprinas e Ovinas Produção in vitro de embriões Vicente José de F. Freitas Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução

2 Plano de Aula Princípios da técnica. A obtenção de oócitos. Metodologia das diferentes etapas laboratoriais. Os principais obstáculos da técnica. Considerações

3 Introdução A criação de pequenos ruminantes como atividade industrial. Correção dos erros de manejo: Alimentar, sanitário e reprodutivo Trabalhar com genética superior.

4 Introdução Esquema de um programa de melhoramento genético baseado em sistema de PIVE. Colheita de oócitos em cabras geneticamente superiores Transferência de blastocistos para receptoras comuns Maturação dos oócitos e fecundação com sêmen de machos geneticamente superiores Cultivo dos embriões por 6-7 dias

5 Diferentes etapas da PIVE Colheita de oócitos competentes. Seleção e maturação in vitro (MIV) dos oócitos. Fecundação in vitro (FIV) de oócitos maturados. Cultivo in vitro (CIV) dos prováveis embriões. Transferência do embriões para receptoras.

6 Métodos para colheita de oócitos

7 Ovários de abatedouro Slicing Punção folicular

8 Ovários de abatedouro Desvantagens: Problemas sanitários, Histórico reprodutivo desconhecido, Problemas nutricionais, Etc, etc, etc...

9 Métodos para colheita de oócitos

10 Animais vivos Permite a colheita de oócitos em fêmeas pré-púberes, senis ou mesmo prenhes. Torna possível repetir a colheita várias vezes no mesmo animal, tonando viável o uso do termo doadora permanente. Primeiramente foi desenvolvido para bovinos por pesquisadores alemães há quase 30 anos (Pieterse et al., 1988).

11 Colheita guiada por ultrassonografia No entanto ê 4 oócitos/doadora

12 Colheita guiada por laparoscopia Pode ser realizada sem ou com estímulo hormonal anterior. No entanto, somente com uso de tratamento hormonal de estimulação ovariana, o método torna-se interessante para obter-se um número adequado de oócitos. Trata-se de um método desenvolvido há vários anos por Hérnan Baldassarre, na Argentina, entre outros.

13 Colheita guiada por laparoscopia Protocolo hormonal de estimulação ovariana utilizado em caprinos criados no Nordeste do Brasil (Avelar et al., 2009).

14 Colheita guiada por laparoscopia Efeito de diferentes tratamentos hormonais de estimulação ovariana sobre o número de folículos visualizados, aspirados e a taxa de colheita oocitária. Tratamento Cabra s Folículos visualizados Folículos puncionados Taxa de colheita (%) 5 FSH 18 16,8 ± 1,5 ª 14,8 ± 1,3 ª 84,1 ª 3 FSH 17 17,1 ± 1,5 ª 15,7 ± 1,3 ª 67,9 b 1 ecg+fsh 17 17,0 ± 1,5 ª 14,9 ± 1,3 ª 72,4 a a,b: P < 0,05 Fonte: Avelar et al., 2009

15 Colheita guiada por laparoscopia Equipamentos

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17 Colheita guiada por laparoscopia

18 Meio de colheita oocitária TCM 199 contendo: 10 mm HEPES, 0,022 mg/ml de piruvato de sódio, UI de penicilina, μg/ml de sulfato de estreptomicina, 25 μg/ml de anfotericina B, 10% soro fetal bovino e 20 UI/mL de sulfato de heparina.

19 Seleção e maturação oocitária Classificação de CCOs caprinos (Avelar et al., 2009) CCO Grau Características I II III IV Cumulus compacto com várias camadas e citoplasma levemente granulado Uma a três camadas de células do cumulus e citoplasma levemente granulado Revestimento celular ausente/ incompleto e citoplasma heterogêneo CCO de formato anormal, citoplasma heterogêneo, aspecto viscoso

20 Seleção e maturação oocitária Maturação in vitro (MIV): Etapa fundamental da PIVE (em todas espécies). Maturação nuclear e citoplasmática. Meio de MIV: TCM199 suplementado com: 0,022 μg/ml de piruvato de sódio, UI de penicilina, μg/ml de sulfato de estreptomicina, 25 μg/ml of anfotericina B, 10% de soro fetal bovino, 10 ng/ml de EGF (fator de crescimento epidermal), 5 μg/ml de pfhs, 10 μg/ml de plh, 1 μg/ml de 17β-estradiol e 100 μm de cisteamina 24 horas 38,5 o C a 5% de CO 2.

21 FIV dos oócitos maturados Sptz móveis: obtidos por centrifugação (15 m 900 g) em 2 ml de gradiente de Percoll (45/90%). Sptz viáveis: diluídos em meio FIV em concentração final de 2 x 10 6 sptz/ml. Sptz e oócitos são coincubados por 18 h a 38,5 o C em 5% de CO 2. Meio FIV: 450 μl de SOF 10% de soro de cabra em estro e Gentamicina.

22 CIV dos prováveis embriões Sistemas utilizados em caprinos: Co-cultivo em células da granulosa ou do oviduto. Meios desenvolvidos para necessidade dos embriões. Desenvolvimento in vivo no oviduto. SOF contendo: 0,4% de albumina sérica bovina (BSA), 2% de soro fetal bovino. Cultivo por 6-7 dias: Gotas de 50 μl cobertas com óleo mineral. Em estufa de três gases: 5% CO 2, 5% O 2 e 90% N 2.

23 CIV dos prováveis embriões

24 CIV dos prováveis embriões

25 CIV dos prováveis embriões Eficiência total da PIVE caprina: 1. N o de oócitos colhidos 2. N o de oócitos maturados 3. N o de clivados 4. N o de blastocistos

26 Considerações A PIVE em caprinos no Brasil: Quando será sua aplicação comercial? Procedimentos mais eficientes podem fazer a diferença: Colheita laparoscópica Maturação oocitária Capacitação espermática