Coleta, Classificação e Maturação in vitrode Oócitos

Transcrição

1 Universidade Federal de Pelotas Graduação em Biotecnologias Disciplina de Manipulação de Gametas e Embriões 2ª Aula: Coleta, Classificação e Maturação in vitrode Oócitos Priscila M. M. de Leon Doutoranda PPGB Agosto, 2010

2 Oócito Conceito: o oócitos são células germinativas femininas resultantes do processo determinado Oogênese Oogênese: processo de maturação das oogônias em oócitos. Este processo inicia-se na vida fetal e termina após a puberdade. 1º bloqueio meiótico oócitos em Diplóteno da Prófase I

3 Oogênese: Fases da Ovogênese Ovogonias Ovócito I Ovócito II Fecundação Embrionária Nascimento A partir da Puberdade Diplóteno da Prófase I Metáfase II Óvulo

4 Oócito Diplóteno da Prófase I Estágio de Vesícula Germinativa VG: núcleo desenvolvido e imaturo; Foliculogênese formação Complexo cumulus oophuros

5 Foliculogênese Folículo Primário:oócitoenvolto por camada simples de céls. pavimentosas; Bovinos Folículo = 35µm; Oócito= 30µm Folículo Secundário: duas ou + céls. Foliculares Oócito começa a crescer Formação de junções comunicantes (gap junctions) Meiose permanece bloqueada Folículo Antral(Terciário ou De Graaf): Crescimento folicular Crescimento e maturação do oócito Bovinos Folículo = 1mm; Oócito= 80µm Folículo = 15mm; Oócito= 120µm

6 Oócito Quebra da Vesícula Germinativa marca a retomada da meiose e início do processo de Maturação Oocitária; In vivo ocorre pela estimulação por LH (Hormônio Luteinizante) In vitroocorre na coleta do oócito 2º bloqueio meiótico: oócitos em Metáfase II Estágio em que o oócitoé ovulado A meiose só prosseguirá se ocorrer a fertilização

7 Foliculogênese: Oogênese: Meiose: Folículo Primário Oócito I Folículo Secundário Oócito I VG Folículo Antral(Terciário) Oócito I QVG Folículo Pré-Ovulatório Oócito II MI Ovulação Oócito II MII Fecundação Óvulo

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9 Foliculogênese Humana

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12 Complexo CumulusOophorus Antro Folicular Coroa Radiada Zona Pelúcida Oócito

13 Maturação Oocitária 1. Crescimento Oocitário 2. Capacitação Oocitária 3. Maturação Oocitária a. Maturação Citoplasmática b. Maturação Nuclear 4. Ativação do Oócito

14 1. Crescimento Oocitário Crescimento Oocitáriose inicia com o Crescimento Folicular; Finalizado na formação do Folículo Antral; Aumento de tamanho (3x); Aumento e oraganização de Organelas; Síntese de RNA e proteínas : Maturação, Fecundação e Desenvolvimento Embrionário

15 2. Capacitação Oocitária Entre final do Crescimento e início da Maturação Modificações Estruturais Acaba a síntese de RNA Ocorre no Folículo Antral Ainda se mantém no 1º bloqueio meiótico

16 3. Maturação Oocitária Quando o oócito retoma a Meiose Após o pico de LH Abrange 2 estágios: Maturação Citoplasmática Maturação Nuclear

17 3.1. Maturação Nuclear Reversão do 1º bloqueio meiótico Vai até o segundo bloqueio meiótico Metáfase II Condensação dos cromossomos e Quebra da Vesícula Germinativa(QVG) Extrusão do 1º Corpúsculo Polar Diacinese Metáfase I Anáfase I Telófase I Metáfase II

18 3.2. Maturação Citoplasmática Ocorrem Modificações Citoplasmáticas: Mitocondriase complexos de Golgimigram para a periferia nuclear; Grânulos Citoplasmáticos migram para a periferia do oócito, próximo a membrana celular; Microtubulose microfilamentossão reorganizados; Expansão das células do cumulus(modificação das junções gap)

19 Junções Gap: Cumulus Expandido:

20 Oócito em MII:

21 Tremoleda et al., 2006.

22 Reguladores da Maturação do Oócito MPF: Fator Promotor da Maturação Principal regulador das modificações morfológicas durante a maturação do oócito. Funções: Regulam a condensação dos cromossomos; Estimulação do rompimento do envelope nuclear na QVG; Reorganização dos microtúbulos; Em baixa atividade em oócitos em VG; Atividade máxima em MI e MII; Ativado pela queda na concentração de AMPc; Inativado pela fertilização, permitindo a finalização da meiose pelo seu desbloqueio.

23 Reguladores da Maturação do Oócito MAPK: Proteína Cinase Ativada por Mitógeno Funções: Atua na fosforilaçãode fatores de transcrição e proteínas do citoesqueleto; Sua ativação ocorre na QVG e se mantém até o fim da maturação (essencial nos eventos após QVG);

24 Microscopia Confocal: VG Pró-M MI Microtúbulos MI AI TI Microfilamentos Cromatina MII MII Deg Tremoleda et al., 2001.

25 Vídeo Estágios de Maturação do Oócito

26 4. Ativação do Oócito Oócitos são ovulados em Metáfase II; A ativação é induzida pela fecundação de um espermatozóide; Metáfase II Telófase II extrusão do2º corpúsculo polar divisão embrionária Caso não ocorra fertilização o oócito se degenera;

27 Finalização da maturação do oócito: Tremoleda et al., 2006.

28 Fertilização in vitro: Tremoleda et al., 2006.

29 Oócito Fertilizado:

30 Coleta de oócitos In vivo: Aspiração Guiada Por Ultra Som (OPU) Aspiração Folicular Cirúrgica Aspiração Transcutânea pelo flanco In vitro: Aspiração Folicular Slicing(Técnica de Fatiamento) Scraping

31 Aspiração Guiada por Ultra Som (OPU) OPU Ovum Pick-Up Ultra som sonda convexa de 5MHz a 6,5MHz; Bomba de vácuo; Tranqüilização; Aspiração do Fluído Folicular; Lavagem Folicular com PBS e Heparina; Procura do CCO em lupa estereo microscópica;

32 Coleta de Oócitos in vivo -OPU -Bovino Média de Oócitos /OPU: 8 CCO viáveis; CCOsviáveis com estimulação hormonal (Protocolo de Superovulação); 10% dos CCO são degenerados; Manejo OPU doadora: OPU entre os dias 14 e 16 do ciclo estral n CCOs; OPU no dia 5 n de COC viáveis e competentes; OPU de 20 vacas / dia; OPU 2x em uma semana ( nº de CCOs); OPU 1 x a cada 2 semanas; OPU no 1º Trimestre da Gestação; Estimativa: pode ser obtidas 18 gestações/3 meses com OPU + PIV

33 Coleta de Oócitos in vivo -OPU -Bovino

34 Coleta in vivo de Oócitos-Equinos Equinos: maior aderência das células do cumulusà parede folicular dificuldade na coleta Aspiração Folicular Cirúrgica (McKinnon, 1986); Aspiração Transcutânea pelo flanco (Palmer, 1987); Aspiração Transvaginal guiada por ultra som (Cook, 1992); Carnevale& Ginther, 1993: 78% de oócitos recuperados; Gaetano et al. 2005: 46,4% Recuperação Oocitária; Manejo OPU éguas doadoras: OPU 12-24h após hcg; 5 CCOs/égua; 11 CCOs/ éguas com protocolo de Superovulação;

35 Coleta in vivo de Oócitos Caprinos e Ovinos Aspiração Folicular por Laparoscopia (LAF); Uso frequente promove aderências no trato reprodutivo; Coleta cirúrgica por Laparotomia muito traumática OPU é dificultada pelo tamanho dos animais; Manejo LAF doadoras: Até 1 x /semana; 11º dia do ciclo ou do protocolo de Superovulação; Em média 6 CCO/coleta em cabras; 4 CCO/coleta em ovelhas;

36 Aspiração Folicular por Laparoscopia: LAF -Cabras

37 Coleta de Oócitos -Mulheres Dellenbach(1985): inicio da aspiração folicular por via transvaginal guiada por ultra-som. Procedimento é feito sob sedação; 6 CCOsou mais coletados por OPU; Mulheres co infertilidade: 15% de taxa de gravidez com CCO próprios; 49% de taxa de gravidez com CCO doados;

38 Vídeo -Aspiração Folicular Guiada por Ultra Som

39 Coleta de Oócitos in vitro Aspiração Folicular Slicing(Técnica de Fatiamento) Scraping Objetivos: Avanços científicos; Controle em clínicas de reprodução assistida;

40 Coleta de Oócitos in vitro-scraping Individualização de cada folículo e abertura em placa de petri; Auxílio de bisturi ou cureta; Maior taxa de coleta (90%); CCO de boa qualidade; Muito demorado; Utilizado em Equinos;

41 Coleta de Oócitos in vitro-slicing Fatiamento de toda a superfície ovariana; alta taxa de coleta; Muitos CCO inviáveis e desnudos; Líquido de procura bem sujo, maior probabilidade de contaminação; Utilizado em bovinos;

42 Coleta de Oócitos in vitro Aspiração Folicular Aspiração do conteúdo folicular com seringa e agulha; Taxa de coleta em torno de 60%; Método mais prático e rápido; Líquido de procura é deixado para sedimentar; Utilizado em Bovinos, Equinos, Ovinos e Suínos;

43 Classificação dos Complexos Cumulus Oócito De acordo com aspectos Morfológicos: Quantidade de camadas de céls. do cumulus; Grau de compactação das células do cumulus; Homogeneidade citoplasmática; Presença de grânulos citoplasmáticos; Influencia diretamente a qualidade embrionária e a viabilidade após o descongelamento de oócitos

44 Classificação dos Complexos Cumulus Oócito Grau I: Mais de 3 camadas de céls. do cumulus; Cumulus compacto; Ooplasma com granulações finas e homogêneas; Ooplasma preenchendo todo o interior da zona pelúcida; Grau II: 3, 2 ou 1 camada de células do cumulus; Cumulus compacto; Granulações heterogeneamente distribuídas (concentradas em uma lado ou na periferia); Ooplasma preenche todo o interior da zona pelúcida;

45 Classificação dos Complexos Cumulus Oócito Grau III: Cumulus parcialmente expandido; Ooplasmacontraído (espaço entre a zona pelúcida e o ooplasma); Manchas escuras no ooplasma; Grau IV: Cumulus expandido; Oócitos Desnudos; Ooplasma muito escuro; Sinais de degenação(vacúolos, inclusões citoplasmáticas);

46 Classificação quanto ao Estágio de Maturação

47 Classificação de oócitos Grau I Grau II Grau IV Grau II Grau III Grau IV

48 Classificação de oócitos Cumulus Compacto Cumulus Expandido

49 Oócito humano em Metáfase II apresentando: Granulações Citoplasmáticas

50 Oócito humano em Metáfase II apresentando: Fragmentação do Corpúsculo Polar

51 Oócitohumano em Metáfase II apresentando: Vacúolo no Ooplasma

52 Oócito humano em Metáfase II apresentando: Inclusões Citoplasmáticas

53 Maturação In vitro Condições de cultivo para maturação do oócito: VG MII 1º Bloqueio Meiótico é quebrado na coleta do oócito; Rompimento da comunicação entre as células foliculares e retira os fatores inibidores do fluído folicular.

54 Maturação In vitro Bovinos: Taxa de maturação entre 80 e 90% 20 a 24h de incubação a 38,5 C Caprinos e Ovinos: Taxa de maturação caprinos é 50% Taxa de maturação ovinos 35 40% 27 h de incubação a 38,5 C a 39 C Equinos: Taxa de maturação entre 40 e 60%; 36 a 40h de incubação a 38,7 C

55 Maturação In vitro Maioria dos Protocolos: Meio de cultivo de tecidos 199 (TCM-199); Suplementação com Soro Fetal Bovino (SFB); Antibióticos (Gentamicina e Penicilina ou Sulfato de Amicacina); Adição de Hormônios : Estradiol FSH e LH Fatores de Crescimento e Estimulantes (GH, IGF-I, IL-1β); Fluído Folicular ou Soro de Vaca em Estro; Adição de Albumina Sérica Bovina (BSA);

56 Maturação In vitro Gotas de 60 a 120 µl; Submersas em óleo mineral; Placas de Petri tratadas Em Estufa de CO2; 5% de CO2, temperatura e umidade controladas;

57 Maturação in vitro: Dell Aquillaetal, 1996: adiçãodesorodeéguaevacaemestroaotcm 199 para maturação; Bruck et al., 2000: MIV em fluído de folículos pré-ovulatórios; Carneiro et al., 2002: IGF-I adicionado a meio de maturação; Pereiraetal.2006:41,47%deMIVcomeGHpor30h; Tremoleda et al., 2006: manutenção do Bloqueio da Meiose com o objetivo de desenvolvimento da Competência Oocitária e Reprogramação Celular;

58 Leon etal., 2008: Adição de Cisteaminaao meio de MIV; Síntese de Glutationa(GSH); Estresse Oxidativo; Aumentodataxade maturaçãoin vitro; Tratamento Imaturo Maturo Total controle 88 (56.8%) a 67 (43.2%) a 155 (31.4%) 50µM Cisteamina 84 (57.5%) a 62 (42.5%) a 146 (29.6%) 100µM Cisteamina 89 (46.4%) b 103 (53.6%) b 192 (38.9%) Total

59 Atividade Proposta! Em duplas: Escolha uma espécie para pesquisa...; Encontre um artigo sobre maturação in vitrode oócitos; Estude o diferencial da espécie e o protocolo aplicado; Será discutido na próxima aula prática!