Cultivo de células animais e humanas

Transcrição

1 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO Universidade Federal de Alfenas. Unifal-MG Rua Gabriel Monteiro da Silva, 700. Alfenas/MG. CEP Fone: (35) Fax: (35) Minicurso: Cultivo de células animais e humanas Docente orientadora: Profa. Dra. Cibele Marli Cação Paiva Gouvêa Ministrantes/Discentes: Ana de Souza Santos Luiz Otávio Lourenço Alfenas-MG 2016

2 Cultivo de células animais e humanas SUMÁRIO o Introdução; o Técnicas de cultivo (Biossegurança, assepsia e cuidados de manejo); o Métodos de cultivo; o Tipos de cultura; o Tipos de células; o Métodos da prática. INTRODUÇÃO O cultivo de células consiste em um conjunto de técnicas que permite a utilização e análise fora de um organismo. As células fora de seu tecido de origem são mantidas em condições semelhantes a seu natural. Trata-se de uma prática amplamente empregada em culturas animais e humanas, tendo suas aplicações na bioengenharia, terapia celular, análise de citotoxicidade, produção de vacinas, entre outros. TÉCNICAS DE CULTIVO Células são unidades muito pequenas e, portanto, exige grande cuidado em seu manejo, com isso a proteção contra contaminação e movimentos delicados dos materiais são fundamentais para a condução dos experimentos. Em seguida estão algumas ações empregadas: o Biossegurança: A execução do estudo deve ser conduzida nas condições mais seguras possíveis, algumas ações como o uso de jaleco/avental, luvas, touca, máscara cirúrgica, propé assim como o uso de calça e sapatos fechados são fundamentais para evitar a contaminação e riscos à saúde, o uso de anéis e pulseiras deve ser restrito. Todo trabalho com células que não estejam contaminadas com patógenos, deve ser conduzido em cabine de fluxo laminar com segurança de Classe II. o Assepsia: A limpeza dos materiais e equipamentos deve ser feita periodicamente para controle microbiológico. O uso de raios ultravioleta (Raios UV), assepsia com uso

3 de álcool 70%, limpeza da estufa de cultivo e uso de materiais e soluções estéreis são essenciais para eficácia da prática em estudo. A condução do estudo deve ser feita por número limitado de indivíduos, já que a entrada e saída do fluxo laminar e manipulação dos materiais deve ser cautelosa para se obter um bom produto final. MÉTODOS DE CULTIVO As células a serem cultivadas, devem permanecer em meio de cultura que simula as condições fisiológicas de um organismo e a escolha de tal meio varia de acordo com o tipo de célula a ser cultivada. Esses meios de cultura contêm composições típicas para seu cultivo celular que proporcionam condições básicas de sobrevivência, como sais inorgânicos, carboidratos, aminoácidos, lipídios, proteínas, agentes antioxidantes, um sistema tampão que regula o ph, entre outros componentes. No entanto, há necessidade de suplementação do meio por meio de soros que contém hormônios e fatores de crescimento e também de proteínas que auxiliam no transporte de hormônios. O soro fetal bovino, por exemplo, é um dos mais utilizados por possui menor quantidade de imunoglobulinas e elevada proporção de fatores de crescimento, favorecendo a manutenção das condições ideias ao cultivo. Para seu preparo a água utilizada deve estar com altíssima pureza, seu ph deve ser analisado após a adição dos suplementos e soro, lembrando que nessa etapa sob risco de contaminação, é obrigatório o uso de EPIs e sala sem circulação para controle microbiológico. TIPOS DE CULTURA A classificação das culturas se relaciona diretamente com o tempo ao qual foram cultivadas, podendo ser de cultura primária, secundária, de linhagem estabelecida ou linhagem de célula transformada. o Cultura Primária: Trata se de o estágio inicial do cultivo, onde as células são recém-tiradas do tecido vivo. Um explante tecidual é feito a fim de se obter fragmentos do tecido. Esse fragmento de tecido deve ser delicadamente cortado em pedaços menores ou por ação enzimática, reduzido para a formação de cultura primária, é um recurso vantajoso por manter as características do tecido de origem e desvantajoso pela baixa durabilidade.

4 o Linhagem finita: São obtidas das culturas primárias, que não sofreram transformação. Estão sujeitas a senescência e são obtidas a partir do subcultivo das culturas primárias. o Linhagem contínua: São derivadas de culturas primárias, que sofreram transformação ou se tornaram imortalizadas, por mutação espontânea ou induzida por vírus. As células podem se dividir indefinidamente e este tipo de cultura é muito empregado em pesquisas por apresentar capacidade de proliferação celular infinita. São também utilizadas na fabricação de produtos farmacêuticos como vacinas, hormônios e anticorpos e para proliferação de vírus de interesse para a saúde humana e animal. TIPOS DE CÉLULAS As células como ocorrem no organismo, realizam interações entre si e essas interações estão relacionadas à sua disposição no meio, podendo ser uma cultura de células aderentes e não aderentes. o Células aderentes: Essas células permanecem aderidas ao frasco de cultura, são geralmente oriundas de órgãos sólidos e por isso, necessitam de ancoragem para iniciar sua proliferação. o Células não aderentes: Crescem em suspensão no meio sem necessidade de ancoragem, ficando restrita a células hematopoiéticas e linhagens transformadas da linhagem sanguínea. o Células mistas: Contém células aderentes e em suspensão. Para o sub cultivo das células aderentes é necessário que estas sejam destacadas do frasco de cultura. Esta ação é exercida pela tripsina, uma enzima proteolítica, que promove a desagregação das células pela lise de proteínas da matriz extracelular. É preciso controlar o tempo de ação da tripsina para que atue apenas sobre as proteínas extracelulares, uma vez que se trata de enzima proteolítica de amplo espectro e se permanecer muito tempo em contato com as células, ocorrerá a lise das proteínas da membrana citoplasmática, inviabilizando as células.

5 A preservação das células dá-se por criopreservação, que consiste no processo de congelamento. Este protege as células de alterações em seu DNA, devido a suas frequentes divisões e permite que as células sejam conservadas por período indeterminado de tempo, permitindo a retomada do seu desenvolvimento celular normal após seu armazenamento em nitrogênio líquido à temperatura de (-196 C). O processo de congelamento mais usado é o congelamento lento. Esse processo caracteriza-se por uma redução gradual de temperatura. Além disso, o congelamento lento é caracterizado por uma desidratação celular gradual que reduz a formação de cristais de gelo. Para o congelamento celular é necessário o uso de crioprotetores, que são solventes orgânicos, que sobre variações moleculares, possuem a capacidade de penetrar e proteger a membrana das células dos danos de congelamento. Dentre os crioprotetores destacam-se o glicerol e dimetilsufórido (DMSO), os mais utilizados por apresentarem maior capacidade de penetração nas células, sendo ambos tóxicos. De forma geral, os crioprotetores atuam substituindo parcialmente a água no interior da célula, aumentando a aderência do meio de congelamento, consequentemente, reduzindo o ponto de congelamento da mesma. O descongelamento das células é uma etapa na qual ocorre o resgate do material criopreservado e retomada do metabolismo celular. O descongelamento deve acontecer de forma rápida, e esse processo consiste na lavagem das células para a retirada do crioprotetor utilizado. Tanto o congelamento como o descongelamento são processos utilizados tanto para as células aderentes como para as não aderentes, e ocorre da mesma forma para ambos os tipos de células. MÉTODOS DA PRÁTICA A atividade prática tem como objetivo fornecer noções práticas do cultivo de células animais e humanas, como a tripsinização, coloração e a análise morfológica, bem como mostrar alguns tipos de células em cultura, quanto a sua natureza e finalidade. Etapas práticas: o Observação e lavagem das garrafinhas com células tumorais aderentes. Observar as células ao microscópio invertido. Remover o meio de cultura com auxílio de pipeta.

6 Lavar a garrafa de cultura com 2 ml de salina 0,85% por duas vezes (remover a salina com auxílio de uma pipeta). o Tripsinização e análise das células. Incubar com 2 ml de tripsina 0,25%, contendo EDTA 0,02% por 3 min. Neutralizar a ação da tripsina com 1 ml de SFB. Observar as células, na garrafinha de cultura, ao microscópio invertido. Objetivo da tripsinização: liberar as células da matriz extracelular em que está inserida e dissociar as células. o Demonstração de lâminas de cultura primária de hepatócito de camundongo, de linhagem aderente e de linhagem não aderente. Observação em microscópio ótico comum. o Corar e determinar a viabilidade celular. Corantes: Hematoxilina-eosina. Observar ao microscópio ótico comum. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ALVES, E. A.; GUIMARÃES, A. C. R. Cultivo Celular. In: FUNDAÇÃO OWALDO CRUZ (Org.). Conceitos e métodos para a formação de profissionais em laboratório de saúde. Rio de Janeiro: EPSJV, IOC, v. 2, Cap. 5, Rio de Janeiro, 2010, p